Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie zapisu klamry całokomórkowej z wewnętrznych neuronów siatkówki w preparacie siatkówki myszy do montażu płaskiego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii siatkówki, takie jak różnorodność neuronów, ich połączenia synaptyczne w warunkach normalnych i patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zarówno połączenia pionowe, jak i boczne są zachowane, co pozwala na badanie obwodów siatkówki z dużymi elementami bocznymi.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ siatkówka jest cienką, delikatną tkanką, z którą należy obchodzić się z wielką ostrożnością i cierpliwością. Praktyka jest jednak najlepszym sposobem, aby ją opanować. Aby rozpocząć tę procedurę, zwiń gałki oczne myszy w czysty ręcznik papierowy, aby usunąć krew.

Następnie zanurz je w karbogenicznym roztworze Ringera ssaków. Następnie wybij otwór w rąbku igłą o rozmiarze 23 i przetnij gałki oczne, przecinając wzdłuż rąbka mikronożyczkami. Następnie usuń rogówkę i soczewkę za pomocą cienkich kleszczyków.

W przypadku całego montażu siatkówki delikatnie oderwij całą siatkówkę od pigmentowanego nabłonka za pomocą cienkich kleszczyków i wykonaj cztery ortogonalne nacięcia o długości od 1,5 do dwóch milimetrów od krawędzi w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Następnie zanurz dziurkowaną membranę nitrocelulozową w naczyniu i delikatnie przeciągnij po niej siatkówkę stroną GCL do góry. Następnie umieść głowę nerwu wzrokowego w środkowym otworze podczas przygotowywania siatkówki z pełnym mocowaniem.

Następnie przenieś błonę z siatkówką do innego czystego naczynia. Delikatnie spłaszcz siatkówkę jako krzyż maltański za pomocą cienkiego pędzla i połóż wszystkie cztery krawędzie nad otworami. Osusz membranę nitrocelulozową kawałkiem suchej bibuły filtracyjnej i usuń szklistą i wewnętrzną membranę ograniczającą za pomocą kleszczy i pędzla.

Upewnij się, że wszystkie krawędzie siatkówki są całkowicie przymocowane do membrany przed przeniesieniem zestawu do komory nagrywającej z uszczelnionym szklanym szkiełkiem nakrywkowym na dole. Przymocuj membranę do szkiełka nakrywkowego za pomocą smaru próżniowego i ponownie nawodnij siatkówkę roztworem zewnętrznym. Uważaj, aby nie uwięzić żadnych pęcherzyków powietrza pod zespołem.

Następnie ustaw komorę na stoliku mikroskopu pionowego. Napełnij komorę zewnętrznym roztworem karbogennym o temperaturze 34 stopni Celsjusza w tempie około trzech mililitrów na minutę. Najpierw zbadaj siatkówkę pod 10-krotną soczewką subiektywną.

Następnie użyj soczewki zanurzonej w wodzie 60x, aby zobaczyć neurony GCL i INL w ustawieniu DIC i epifluorescencyjnym. Aby zobrazować tdTomato wyrażające SAC, użyj białego źródła światła LED w połączeniu z filtrem wzbudzenia o długości 554 nanometrów i filtrem emisyjnym o długości 581 nanometrów. W tej procedurze przefiltruj roztwór wewnętrzny przez filtr strzykawkowy do niestandardowego filamentu do wypełniacza.

Następnie włóż filament do świeżo wyciągniętej mikropipety i dozuj roztwór wewnętrzny w pobliżu końcówki, aż roztwór pokryje drut srebrnej elektrody na więcej niż pięć milimetrów. Następnie przymocuj mikropipetę do uchwytu elektrody za pomocą ssącego pociągnięcia, przez które można regulować ciśnienie wewnątrz elektrody, naciskając lub pociągając tłok podłączonej do rurki, 10-mililitrowej plastikowej strzykawki. Następnie umieść pipetę pod obiektywem i obniż ją do około 100 mikrometrów powyżej siatkówki.

W obecnym trybie wtórnika użyj przesunięcia DC, aby wyzerować stojący sygnał napięcia DC. Zmierz rezystancję pipety w trybie cęgów prądowych, wstrzykując przez pipetę prądy o fali prostokątnej o stałej amplitudzie, gdy znajduje się ona w kąpieli. Zneutralizuj różnicę, obracając pokrętło Raccess i użyj odczytu na nim do obliczenia rezystancji pipety.

Następnie powoli umieść elektrodę na wysokości około 10 mikrometrów nad siatkówką. Zastosuj nadciśnienie do elektrody. Następnie obserwuj, jak zmienia się odbicie w pobliżu końcówki pipety, gdy zbliża się do siatkówki.

Szybko, ale delikatnie, wepchnij pipetę do GCL i natychmiast zmniejsz nadciśnienie. Przesuń pipetę w kierunku znakowanego neuronu i unikaj kontaktu z innymi neuronami, naczyniami krwionośnymi i końcami stóp komórek Müllera. W razie potrzeby zastosuj większe nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu elektrody.

Następnie umieść końcówkę pipety w pobliżu oznaczonego neuronu, aż będzie widoczny wgłębienie. Następnie zwolnij nadciśnienie i pozwól, aby błona plazmatyczna odbiła się z powrotem na końcówkę pipety. Zastosuj do pipety prądy ujemne o natężeniu od 20 do 120 pikomów, aby pomóc w tworzeniu uszczelnienia gigaomowego.

Umożliwienie błonie komórkowej odbicia się po uwolnieniu nadciśnienia jest ważne, ponieważ doskonałe uszczelnienie utworzone naturalnie między błoną a otworem pipety jest ważne dla zachowania morfologii komórki po zarejestrowaniu. W razie potrzeby zastosuj delikatne ssanie, aby wciągnąć błonę plazmatyczną do pipety. Odczekać pięć minut po utworzeniu się uszczelnienia, aby pękła błona komórkowa, aby umożliwić usunięcie rozlanego roztworu wewnętrznego przez superfuzję.

Po pęknięciu membrany i w bieżącym trybie zacisku włącz balans mostka i wyreguluj go za pomocą pokrętła Raccess. Rejestruj pobudzające i hamujące prądy postsynaptyczne w trybie cęgów napięciowych, utrzymując ogniwo przy potencjałach odwrócenia. Po nagraniu delikatnie wyjmij pipetę z somy.

Przenieś zestaw z komory do czystego naczynia. Następnie odłącz i ponownie przymocuj siatkówkę do innej spłaszczonej membrany nitrocelulozowej bez dziurkowania otworów, aby zapewnić płaskość siatkówki podczas mocowania. Tkanka jest teraz gotowa do barwienia.

Obrazy te pokazują, że komórki cholinergiczne zarówno w GCL, jak i INL mogą być niezawodnie identyfikowane za pomocą fluorescencji tdTomato i kierowane do zapisu klamry krosowej całej komórki w ramach DIC. Oscylacje ich potencjałów błonowych można ujawnić za pomocą rejestracji cęgów prądowych, a oscylacje napędzane przez hamujące i pobudzające prądy synaptyczne ujawniają się poprzez utrzymywanie komórek odpowiednio na poziomie zero miliwoltów i ujemnych 75 miliwoltów w warunkach zacisku napięcia. W tym przypadku charakterystyka histologiczna post hoke zarejestrowanych komórek wskazuje na typową morfologię dendrytyczną SAC i poziomy stratyfikacji w IPL.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zabezpieczeniu zespołu błony siatkówki w komorze rejestracyjnej i ponownym nawodnieniu bez zatrzymywania pęcherzyków powietrza pod spodem w szczelny i delikatny sposób, aby uzyskać próbkę nadającą się do zapisu. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak zapisy z podwójnym zaciskiem łatowym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy oscylacje docelowych komórek wielokomórkowych są napędzane przez te same mechanizmy synaptyczne. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii siatkówki do zbadania synchronizacji oscylacji między sąsiednimi neuronami siatkówki w siatkówkach zdegenerowanych fotoreceptorami.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak usunąć ciało szkliste i przygotować płaski uchwyt siatkówki do ukierunkowanego nagrywania klamer na całą skalę z wewnętrznych neuronów siatkówki.