Name: Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj technikę patch clamp w płaskim preparacie siatkówki myszy do badania neuronów amakrynowych. Ta metoda umożliwia zachowanie połączeń synaptycznych i analizę aktywności elektrycznej komórek siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Joung Jang i Xin Guan za pomoc techniczną. Dziękujemy dr Rory'emu McQuistonowi z Virginia Commonwealth University za ustawienie naszego pierwszego zestawu do zacisków krosowych i porady dotyczące procedur eksperymentalnych. Dziękujemy dr Samuelowi Wu za sugestie dotyczące nagrywania cęgów napięciowych. Prace są wspierane przez granty NIH EY013811, EY022228 oraz grant na realizację projektu vision core EY002520. C-KC jest prezesem Fundacji Badawczej Siatkówki im. Alice R. McPherson w Baylor College of Medicine.

Zgoda etyczna – procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami wytycznych National Institutes of Health dla zwierząt badawczych, zatwierdzonych przez instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania w Baylor College of Medicine.
1. Rozwiązania zewnętrzne i wewnętrzne
<ol>
	<li>Roztwór Ringera należy stosować u ssaków podczas rozwarstwiania siatkówki oraz jako roztwór zewnętrzny w późniejszym zapisie elektrofizjologicznym. Przygotować roztwór Ringera ssaków z 10-krotnego roztworu podstawowego (bez wapnia) w dniu rejestracji i dodać kroplami CaCl2 po 15 minutach karbonowania (95%O2 i 5% CO2 ). Końcowy roztwór 1x zawiera (w mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na2HPO4, 0,1 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1MgSO4 i 10 D-glukozy.</li>
	<li>Użyj dwóch wewnętrznych rozwiązań, aby scharakteryzować oscylacje SAC. Zbadać przydatność przygotowanych roztworów w przedłużonych zapisach patch-clampów całokomórkowych na dorosłych myszach RGC i przechowywać zweryfikowane partie w 500 μl podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
	<ol>
		<li>Do rejestrowania oscylacji potencjału błonowego należy użyć wewnętrznego roztworu na bazie potasu, który zawiera (w mM): 125 K-glukonian, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES i 0,2% biocytyny (w/v). Dostosuj pH do 7,3 za pomocą KOH.</li>
		<li>Do rejestrowania pobudzających i hamujących prądów postsynaptycznych należy użyć wewnętrznego roztworu na bazie cezu, który zawiera (w mM): 100 Cs-metanosulfonianu, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES i 0,2% biocytyny (w/v). Dostosuj pH do 7,3 za pomocą CsOH.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie do Dnia Nagrania
<ol>
	<li>Aby przygotować membranę nitrocelulozową z otwartymi otworami, należy ręcznie przebić membranę za pomocą specjalnego dziurkacza wykonanego z igły strzykawkowej 16 G i spłaszczyć membranę między dwiema czystymi szklanymi płytkami. W przypadku siatkówki z pełnym mocowaniem wykonaj centralny otwór o średnicy 0,2 mm i otocz go 4 większymi otworami o średnicy 1-1,2 mm.</li>
	<li>Aby uzyskać niestandardowy filament do wypełniania do ładowania roztworu wewnętrznego do elektrod, stopić końcówkę pipety o pojemności 10 μl na środku i delikatnie wydłużyć stopioną część, aż ostygnie i stwardnieje. Tuż przed użyciem użyj czystej żyletki, aby przyciąć filament, aż będzie nieco dłuższy niż pipety z plastrem.</li>
	<li>Wyciągnij pipety plastrowe w programowalnym ściągaczu z rurki ze szkła borokrzemianowego z wewnętrznym żarnikiem. Mikropipety należy wyprodukować w dniu eksperymentu i natychmiast je zużyć. 
	UWAGA: Do nagrywania SAC używamy następującego ustawienia ściągacza: ciepło: 484; uciąg: 0; prędkość: 25; czas opóźnienia: 1; Ciśnienie: 400 i wartość rampy 462. Średnica zewnętrzna i wewnętrzna rurek borokrzemianowych wynosi odpowiednio 1,65 mm i 1,0 mm. Rezystancja pipet wynosi 10-14 MΩ.</li>
	<li>Na godzinę przed pobraniem tkanek rozmrozić probówkę z roztworem wewnętrznym, potrząsając nią na wirze przez >30 min.</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie siatkówki
<ol>
	<li>Znieczulij zwierzę 4% izofluranem w tlenie, aż zwierzę straci reakcję na uszczypnięcie palca u nogi. Złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Odetnij obie gałki oczne od nerwów wzrokowych w odległości 1-2 mm od główek nerwu wzrokowego za pomocą nożyczek do tęczówki z prostym zakończeniem.</li>
	<li>Rzuć gałki oczne na czysty ręcznik papierowy, aby usunąć krew, a następnie zanurz je w roztworze Ringera karbogenowanych ssaków. Przebij otwór w rąbku za pomocą igły 23 G i przetnij gałki oczne, przecinając wzdłuż rąbka mikronożyczkami. Usuń rogówkę i soczewkę za pomocą drobnych kleszczyków.
	<ol>
		<li>W przypadku całego montażu siatkówki delikatnie oderwij całą siatkówkę od pigmentowanego nabłonka za pomocą cienkich kleszczyków i wykonaj cztery 1,5-2 mm ortogonalne nacięcia od krawędzi w kierunku głowy nerwu wzrokowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz dziurkowaną membranę nitrocelulozową w naczyniu i delikatnie przeciągnij po niej siatkówkę stroną GCL do góry. Umieść głowę nerwu wzrokowego w środkowym otworze podczas przygotowywania całej siatkówki. Przenieś błonę z siatkówką do innego czystego naczynia. Delikatnie spłaszcz siatkówkę cienkim pędzlem, aby wyglądała jak krzyż maltański i połóż wszystkie cztery krawędzie na otworach.
	<ol>
		<li>Jeśli jednorazowo ma być badana część siatkówki, należy przeciąć każdą muszlę oczną przygotowaną z kroku 3.3 na 3-4 części za pomocą żyletki z przyczepionymi resztkami pigmentowanego nabłonka. Niewykorzystane kawałki należy chronić przed światłem w karbogenicznym roztworze zewnętrznym i zużyć w ciągu 12 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osusz membranę nitrocelulozową kawałkiem suchej bibuły filtracyjnej i usuń szklistą i wewnętrzną membranę ograniczającą za pomocą kleszczy i pędzla.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie krawędzie siatkówki są całkowicie przymocowane do membrany przed przeniesieniem zespołu do komory nagrywającej z uszczelnionym szklanym szkiełkiem nakrywkowym na dole. Przymocuj membranę smarem próżniowym do szkiełka nakrywkowego i ponownie nawodnij siatkówkę roztworem zewnętrznym. Uważaj, aby nie uwięzić żadnych pęcherzyków powietrza pod zespołem.</li>
	<li>Ustaw komorę na stoliku mikroskopu pionowego. Ukrwić komorę ciepłym (34-35 °C) karbogenicznym roztworem zewnętrznym w ilości ~3 ml na minutę.</li>
	<li>Najpierw zbadaj siatkówkę pod soczewką obiektywu 10x, a następnie użyj soczewki zanurzonej w wodzie 60x, aby zobaczyć neurony GCL i INL pod wpływem różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i/lub epifluorescencji. Aby uwidocznić SAC wykazujące ekspresję tdTomato, użyj białego źródła światła LED w połączeniu z filtrem wzbudzenia o długości fali 554 nm i filtrem emisyjnym o długości fali 581 nm.</li>
</ol>
4. Nagrywanie z użyciem clampu krosowego całej komórki z płaskiej siatkówki
<ol>
	<li>Przefiltruj roztwór wewnętrzny przez filtr strzykawkowy do niestandardowego filamentu do wypełniania.</li>
	<li>Włóż filament do świeżo wyciągniętej mikropipety i dozuj roztwór wewnętrzny w pobliżu końcówki, aż roztwór pokryje srebrny drut elektrody na >5 mm. Zamocuj mikropipetę na uchwycie elektrody z kijkiem ssącym, za pomocą którego można regulować ciśnienie wewnątrz elektrody, popychając lub pociągając tłok plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml podłączonej do rurki.</li>
	<li>Znajdź pipetę pod obiektywem i zejdź ją do ~100 μm powyżej siatkówki. W trybie wtórnika prądowego (I = 0) użyj przesunięcia DC, aby wyzerować stojący sygnał napięcia DC. Zmierz rezystancję pipety w trybie cęgów prądowych (IClamp), wstrzykując prądy o fali prostokątnej o stałej amplitudzie przez pipetę, gdy znajduje się ona w kąpieli, i zneutralizuj różnicę, obracając pokrętło Raccess. Użyj odczytu na pokrętle Raccess, aby obliczyć rezystancję pipety zgodnie z prawem Ohma.</li>
	<li>Powoli ustaw elektrodę na wysokości ~10 μm nad siatkówką. Zastosuj nadciśnienie do elektrody. Obserwuj, jak zmienia się odbicie w pobliżu końcówki pipety, gdy zbliża się ona do siatkówki. Szybko, ale delikatnie wepchnij pipetę do GCL i natychmiast zmniejsz nadciśnienie.</li>
	<li>Przesuń pipetę w kierunku oznakowanego neuronu. Unikaj kontaktu z innymi neuronami, naczyniami krwionośnymi i końcami nóg komórek Müllera. W razie potrzeby zastosuj większe nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu elektrody.</li>
	<li>Umieść końcówkę pipety w pobliżu linii środkowej znakowanego neuronu, aż będzie widoczny wgłębienie. Zwolnij nadciśnienie i pozwól, aby błona plazmatyczna odbiła się z powrotem na końcówkę pipety.</li>
	<li>Zastosuj do pipety prądy ujemne o natężeniu od 20 do 120 pA, aby pomóc w tworzeniu uszczelnienia giga-omowego. W razie potrzeby zastosuj delikatne ssanie, aby wciągnąć błonę plazmatyczną do pipety. Odczekaj 5 minut po utworzeniu uszczelnienia, aby pękła błona komórkowa. Pozwala to na usunięcie rozlanego roztworu wewnętrznego przez superfuzję. Rozerwij membranę przez delikatne zasysanie.</li>
	<li>Po pęknięciu membrany i w bieżącym trybie zacisku włącz balans mostka i wyreguluj go za pomocą pokrętła Raccess. 
	UWAGA: W przypadku małej komórki, takiej jak SAC, wymagana jest tylko niewielka regulacja, jeśli taka istnieje. Alternatywnie, rejestruj pobudzające i hamujące prądy postsynaptyczne w trybie zacisku napięciowego (VClamp), utrzymując komórkę przy potencjałach odwrócenia odpowiednio chlorku (około -75 mV) i glutaminianu (około 0 mV). W razie potrzeby sprawdź i wyreguluj położenie pipety, aby dostosować się do sporadycznego dryfu siatkówki i/lub mikromanipulatora.</li>
	<li>Aby zarejestrować potencjał błonowy lub zmianę prądu przed, w trakcie i po leczeniu farmakologicznym, należy przygotować blokery synaptyczne (np. CNQX, AP5, pikrotoksynę, tubokurarynę itp.) i modulatory kanałów (np. flupirtynę, dopaminę, kwas meklofenamowy itp.) świeże w dniu eksperymentu z zamrożonych zapasów. Rozcieńczyć leki karbogenicznym roztworem Ringera. Nakładaj je partiami poprzez perfuzję.</li>
	<li>Po nagraniu delikatnie wyjmij pipetę z somy. Przenieś zestaw z komory do czystego naczynia. Odłącz i ponownie przymocuj siatkówkę do innej spłaszczonej membrany nitrocelulozowej bez wybitych otworów, aby zapewnić płaskość siatkówki podczas mocowania.</li>
	<li>Napraw siatkówkę, zanurzając ją w 4% paraformaldehydzie na 30 minut w temperaturze pokojowej. Usuń siatkówkę z membrany nitrocelulozowej i dokładnie ją spłucz 1x PBS. Ujawnij morfologię zarejestrowanych komórek przez barwienie O/N streptawidyną sprzężoną z barwnikiem rozcieńczoną w 1x PBS 0,4% Triton X-100 w temperaturze 4 °C14. Zamontuj siatkówkę w podłożu zapobiegającym blaknięciu i obserwuj zarejestrowane komórki za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego. 
	UWAGA: Zabiegi z udziałem paraformaldehydu, który jest lotny i toksyczny, powinny być przeprowadzane w komorze ciągowej dla bezpieczeństwa.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+bursting+of+AII+amacrine+cells+underlies+oscillations+in+the+rd1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina.</a> J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).</li>
<li>Gregg, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nyctalopin+expression+in+retinal+bipolar+cells+restores+visual+function+in+a+mouse+model+of+complete+X-linked+congenital+stationary+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness.</a> J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).</li>
<li>Hellmer, C. B., Ichinose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+light-evoked+postsynaptic+responses+in+neurons+in+dark-adapted%2C+mouse+retinal+slice+preparations+using+patch+clamp+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+dendritic+branching+in+direction+selective+retinal+ganglion+cells+in+nob1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+membrane+potential+fluctuations+of+cholinergic+amacrine+cells+in+mice+lacking+ERG+b-waves%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>Demas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+maintain+eye-specific+segregation+in+nob%2C+a+mutant+with+abnormally+patterned+retinal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity.</a> Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Retinal+Oscillation+Mechanism+in+an+Autosomal+Dominant+Photoreceptor+Degeneration+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model.</a> Front Cell Neurosci. 9, 513(2015).</li>
<li>Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neural+oscillator+in+the+degenerating+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina.</a> J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).</li>
<li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+spontaneous+ganglion+cell+spike+activity+in+animal+models+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa.</a> J Ophthalmol. , (2011).</li>
<li>Stasheff, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+sustained+spontaneous+hyperactivity+and+temporary+preservation+of+OFF+responses+in+ganglion+cells+of+the+retinal+degeneration+%28rd1%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse.</a> J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).</li>
<li>Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+spontaneous+activity+in+the+degenerating+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of spontaneous activity in the degenerating retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 277(2015).</li>
<li>Trenholm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+oscillatory+activity+arising+within+the+electrically+coupled+AII+amacrine-ON+cone+bipolar+cell+network+is+driven+by+voltage-gated+Na%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels.</a> J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).</li>
<li>Chen, C. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+changes+in+displaced+cholinergic+amacrine+cells+lacking+Gbeta5%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+physiological+properties+of+cat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells.</a> J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unconventional+Glutamatergic+Circuit+in+the+Retina+Formed+by+vGluT3+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells.</a> Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).</li>
<li>Hoggarth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+wiring+of+distinct+amacrine+cells+in+the+directionally+selective+retinal+circuit+permits+independent+coding+of+direction+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size.</a> Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).</li>
<li>Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+oscillations+drive+correlated+spiking+of+ON+and+OFF+ganglion+cells+in+the+rd1+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (1), e86253(2014).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+phosphorylation+of+Cx36+gap+junctions+in+the+AII+amacrine+cells+of+RD+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).</li>
<li>Enoki, R., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+horizontally+sliced+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method of horizontally sliced preparation of the retina.</a> Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).</li>
<li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiele laboratoriów rejestrowało z neuronów GCL w preparacie flat mount15-18, ale nasze procedury pozwalają na nagrywanie z neuronów INL. Niniejszym kładziemy nacisk na kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla udanych rutynowych nagrań.
Świeżość i płaskość siatkówki są ważne dla jej penetracji pipetą rejestrującą. W związku z tym najważniejsze jest mocne przymocowanie siatkówki do dziurkowanej błony nitrocelulozowej i osiąga się je poprzez przejściowe wchłanianie roztworu, a n...

Jako łatwo dostępna część ośrodkowego układu nerwowego, siatkówka przez dziesięciolecia była użytecznym modelem w badaniach neurobiologicznych. Znakowanie genetyczne neuronów pozwoliło na szczegółową charakterystykę połączeń synaptycznych w siatkówce. Dzięki wielu dostępnym metodologiom badania funkcji i morfologii neuronów siatkówki, technika zapisu patch clamp odegrała zasadniczą rolę w naszym obecnym zrozumieniu pionowo przesyłanych sygnałów w siatkówce. Sygnały te pochodzą z absorpcji fotonów w fotoreceptorach i są wysyłane do ośrodków wzrokowych mózgu poprzez pobudzanie komórek zwojowych siatkówki (RGC). Pomimo dużej ilości zgromadzonej do tej pory wiedzy, różnorodność neuronalna w unaczynionej siatkówce ssaków pozostaje nierozwiązana i utrudnia pełne zrozumienie obwodów siatkówki, które służą normalnemu widzeniu. Dzieje się tak częściowo dlatego, że większość nagrań została wykonana na wycinkach siatkówki, aby zamienić integralność obwodu bocznego na dostęp do bardziej proksymalnych neuronów siatkówki1-3. Aby uzyskać kompleksowy obraz tego, w jaki sposób siatkówka oblicza sygnały wzrokowe, pożądane jest rejestrowanie neuronów w płaskich mocowaniach, w których połączenia boczne, duże i małe, mogą być lepiej zachowane.
Gdy transmisja synaptyczna z fotoreceptorów do komórek dwubiegunowych zostaje przerwana z powodu wadliwego szlaku sygnałowego metabotropowego receptora glutaminianu 6 (mGluR6) w depolaryzujących komórkach dwubiegunowych4-6 lub po prostu w wyniku utraty fotoreceptorów w zdegenerowanych siatkówkach7-10, wiele RGC wykazuje aktywność oscylacyjną. Oscylacje te pochodzą z wielu źródeł, jednak ta obejmująca sprzężenie szczelinowe między komórkami amakrynowymi AII (AII-AC) a depolaryzującymi stożkowymi komórkami bipolarnymi (DCBC) przyciągnęła najwięcej uwagi i dlatego jest najlepiej rozumiana1,7,11. Znaleźliśmy inne źródło, które utrzymuje się pod farmakologiczną blokadą wspomnianej sieci AII-AC/DCBC i napędza oscylacje SAC typu OFF u myszy RhoΔCTA i Nob z bezkofeinowymi siatkówkami7,8,12. Tutaj szczegółowo opisujemy nasz protokół przygotowania płaskich mocowań siatkówki do rejestracji neuronów INL. Podejście to wykorzystuje komercyjne linie myszy (numer magazynowy Jax 006410 i 007905) do oznaczania cholinergicznych neuronów siatkówki za pomocą ekspresji białka fluorescencyjnego (tdTomato), którą można zidentyfikować pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w optykę wzmacniającą kontrast. Niektóre wyniki eksperymentalne uzyskane za pomocą tego podejścia zostały wcześniej zgłoszone4,5,7,13.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny o stałym stopniu z mikromanipulatorami DIC</td><td>Olympus</td><td>BX51-WI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz z zaciskiem krosowym</td><td>A-M System</td><td>AM2400</td><td></td></tr><tr><td>Konwerter AD</td> National <td>Instrument</td><td>NI-USB-6221</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik grzałki</td><td>Warner Instrument</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Inline grzałka</td><td>Warner Instrument</td><td>SC-20</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Ściągacz</td> do pipet <td>Rainin Dynamax</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Szklana rurka z żarnikiem</td><td>King Precision Glass</td><td>Dostosowany</td><td></td></tr><tr><td>stymulator</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>K-glukonian</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Mg</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cs-metanosulfonian</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Nalgene</td><td>171</td><td></td></tr> 1 <tr><td>ml strzykawka</td><td>Rainin</td><td></td><td></td>17013002</tr><tr><td>10 &mu; l końcówka do pipet</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-130RL</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-488</td><td>ThermoFisher</td><td>S-11223</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td></td></tr></tbody></table>

zapis patch clamp komórek amakrynowych starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

Siatkówka ssaków to warstwowa tkanka złożona z wielu typów neuronów. Aby zrozumieć, w jaki sposób sygnały wzrokowe są przetwarzane w skomplikowanej sieci synaptycznej, zapisy elektrofizjologiczne są często wykorzystywane do badania połączeń między poszczególnymi neuronami. Zoptymalizowaliśmy preparat do montażu płaskiego do rejestracji patch clamp genetycznie oznaczonych neuronów zarówno w GCL (warstwa komórek zwojowych), jak i INL (wewnętrzna warstwa jądrowa) siatkówki myszy. Nagrywanie neuronów INL w płaskich mocowaniach jest preferowane w stosunku do plasterków, ponieważ zarówno połączenia pionowe, jak i boczne są zachowane w poprzedniej konfiguracji, co pozwala na badanie obwodów siatkówki z dużymi komponentami bocznymi. Zastosowaliśmy tę procedurę do porównania odpowiedzi neuronów współpracujących z lustrem w siatkówkach, takich jak cholinergiczne komórki amakrynowe gwiazdoskrzydłe (SAC).

Reprezentatywne rejestracje SAC typu ON i OFF z deafferentowanej siatkówki myszy przedstawiono na Rysunku 1. Komórki cholinergiczne w GCL i INL można niezawodnie zidentyfikować dzięki fluorescencji tdTomato i poddać ukierunkowanej rejestracji metodą patch clamp w całej komórce pod kontrolą DIC (Rysunek 1A), aby ujawnić oscylacje ich potencjałów błonowych (ślady górne) oraz prądy synaptyczne, które je napędzają (ślady dolne, Rysunek 1B). H...

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie rejestracji metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell z neuronów wewnętrznej warstwy siatkówki w preparacie siatkówki mysiej w układzie flat-mount. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii siatkówki, takie jak różnorodność neuronów czy ich połączenia synaptyczne w warunkach prawidłowych i patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest zachowanie zarówno połączeń pionowych, jak i bocznych, co pozwala na badanie obwodów siatkówki z rozległymi komponentami bocznymi.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ siatkówka jest cienką, delikatną tkanką, którą należy traktować z dużą ostrożnością i cierpliwością. Praktyka jest jednak najlepszym sposobem na opanowanie tej techniki. Aby rozpocząć procedurę, należy osuszyć gałki oczne myszy, delikatnie obracając je w czystym ręczniku papierowym w celu usunięcia krwi.Następnie zanurz je w nasyconym karbogenem roztworze Ringera dla ssaków. Potem, za pomocą igły 23G, wykonaj otwór w obrębie limbusa i przedziel gałkę oczną na pół, przecinając ją wzdłuż limbusa mikronóżkami. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, usuń rogówkę oraz soczewkę.W przypadku preparatu całej siatkówki (whole-mount), ostrożnie oddziel całą siatkówkę od nabłonka barwnikowego za pomocą precyzyjnej pęsety i wykonaj cztery ortogonalne nacięcia o długości od 1,5 do 2 mm, od krawędzi w kierunku tarczy nerwu wzrokowego. Następnie zanurz wyciętą membranę nitrocelulozową w szalce i delikatnie przeciągnij nad nią siatkówkę stroną GCL do góry. Przygotowując preparat całej siatkówki, umieść tarczę nerwu wzrokowego w centralnym otworze.Następnie przenieś membranę z siatkówką do innego czystego naczynia. Delikatnie rozpłaszcz siatkówkę w kształcie krzyża maltańskiego za pomocą cienkiego pędzla i ułóż wszystkie cztery krawędzie nad otworami. Osusz membranę nitrocelulozową kawałkiem suchego papieru filtrującego, a następnie usuń ciało szkliste oraz wewnętrzną błonę ograniczającą za pomocą pęsety i pędzla.Upewnij się, że wszystkie krawędzie siatkówki są całkowicie przytwierdzone do membrany przed przeniesieniem zespołu do komory rejestracyjnej z uszczelnionym szkiełkiem podstawowym na dnie. Przymocuj membranę do szkiełka za pomocą smaru próżniowego i nawodnij siatkówkę roztworem zewnętrznym. Należy uważać, aby pod zespołem nie uwięzły żadne pęcherzyki powietrza.Następnie umieść komorę na stoliku mikroskopu pionowego. Przepłukuj komorę zewnętrznym roztworem nasyconym karbogenem o temperaturze 34 °C z przepływem około 3 ml/min. W pierwszej kolejności obejrzyj siatkówkę przy użyciu obiektywu 10x.Następnie należy użyć obiektywu imersyjnego 60x, aby zaobserwować neurony GCL i INL w trybie DIC oraz w ustawieniach epifluorescencyjnych. W celu wizualizacji SACs wykazujących ekspresję tdTomato należy zastosować białe źródło światła LED w połączeniu z filtrem wzbudzenia 554 nanometrów i filtrem emisji 581 nanometrów. W tej procedurze roztwór wewnętrzny należy przefiltrować przez filtr strzykawkowy do specjalnie przygotowanego filamentu do wstecznego wypełniania.Następnie włókno należy wprowadzić do świeżo wyciągniętej mikropipety i nanieść roztwór wewnętrzny w pobliżu końcówki, aż roztwór pokryje drut srebrnej elektrody na odcinku przekraczającym pięć milimetrów. Po tym czasie mikropipetę należy przymocować do uchwytu elektrody za pomocą ssawki, dzięki której można regulować ciśnienie wewnątrz elektrody, naciskając lub odciągając tłok podłączonej plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml. Następnie należy ustawić pipetę pod obiektywem i opuścić ją na wysokość około 100 µm nad siatkówkę.W aktualnym trybie śledzenia (follower mode) należy wykorzystać offset DC, aby wyzerować stały sygnał napięcia DC. Pomiar rezystancji pipety w trybie zacisku prądowego (current clamp) przeprowadza się poprzez wstrzykiwanie prądów o stałej amplitudzie w postaci fali prostokątnej przez pipetę zanurzoną w kąpieli. Różnicę należy zneutralizować za pomocą pokrętła Raccess, a odczytaną z niego wartość wykorzystać do obliczenia rezystancji pipety.Następnie powoli zbliż elektrodę na odległość około 10 µm nad siatkówkę. Przyłóż dodatnie ciśnienie do elektrody. Następnie obserwuj zmianę odbicia w pobliżu końcówki pipety w miarę jej zbliżania się do siatkówki.Szybko, lecz delikatnie, wprowadź pipetę do GCL i natychmiast zmniejsz ciśnienie dodatnie. Przesuń pipetę w stronę oznaczonego neuronu, unikając kontaktu z innymi neuronami, naczyniami krwionośnymi i stopkami komórek Müllera. W razie potrzeby zastosuj większe ciśnienie dodatnie, aby zapobiec zapchaniu się elektrody.Następnie umieść końcówkę pipety w pobliżu oznakowanego neuronu, aż pojawi się wgłębienie. Następnie zwolnij nadciśnienie, aby błona plazmatyczna odskoczyła i przylgnęła do końcówki pipety. Przyłóż do pipety prąd ujemny o natężeniu od 20 do 120 pA, aby wspomóc utworzenie uszczelnienia gigaomowego.Umożliwienie błonie komórkowej powrotu do pierwotnego stanu po zwolnieniu dodatniego ciśnienia jest istotne, ponieważ naturalnie utworzone, szczelne połączenie między błoną a otworem pipety jest kluczowe dla zachowania morfologii komórki po rejestracji. W razie potrzeby należy zastosować delikatne ssanie, aby wciągnąć błonę plazmatyczną do wnętrza pipety. Po utworzeniu uszczelnienia należy odczekać pięć minut przed przerwaniem błony komórkowej, aby umożliwić usunięcie rozlanej cieczy wewnętrznej poprzez superfuzję.Po przerwaniu membrany, będąc w trybie clamp prądowy (current clamp), włącz układ równoważenia mostka (bridge balance) i dostrój go za pomocą pokrętła Raccess. Zarejestruj pobudzające i hamujące prądy postsynaptyczne w trybie clamp napięciowy (voltage clamp), utrzymując komórkę w potencjałach odwrócenia. Po zakończeniu rejestracji ostrożnie wyjmij pipetę z somy.Przenieś preparat z komory na czystą szalkę. Następnie odczep i ponownie przymocuj siatkówkę do drugiej płaskiej membrany nitrocelulozowej, nie wykonując otworów, aby zapewnić płaskość siatkówki podczas utrwalania. Tkanka jest teraz gotowa do barwienia.Obrazy te pokazują, że komórki cholinergiczne zarówno w GCL, jak i INL mogą być wiarygodnie zidentyfikowane dzięki fluorescencji tdTomato i wybrane do rejestracji metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell przy użyciu DIC. Oscylacje ich potencjałów błonowych można wykryć za pomocą rejestracji w trybie current clamp, natomiast oscylacje napędzane przez hamujące i pobudzające prądy synaptyczne ujawniają się poprzez utrzymywanie potencjału komórek odpowiednio na poziomie 0 mV i -75 mV w warunkach voltage clamp. Tutaj histologiczna charakterystyka zarejestrowanych komórek po badaniu wskazuje na typową morfologię dendrytów SAC oraz poziomy stratyfikacji w IPL.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby w sposób szczelny i delikatny zamocować zespół błony siatkówki w komorze rejestracyjnej i przeprowadzić rehydratację bez uwięzienia pęcherzyków powietrza pod spodem, aby uzyskać próbkę nadającą się do rejestracji. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak podwójne rejestracje patch-clamp, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład czy oscylacje w wybranych wielu komórkach są napędzane przez te same mechanizmy synaptyczne. Po opracowaniu, technika ta otwiera badaczom z dziedziny neurobiologii siatkówki drogę do badania synchroniczności oscylacji między sąsiednimi neuronami siatkówki w siatkówkach z degeneracją fotoreceptorów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat usuwania ciała szklistego oraz przygotowania preparatu siatkówki w układzie płaskim (flat-mount) do ukierunkowanych, pełnoskalowych pomiarów metodą patch-clamp z neuronów wewnętrznej warstwy siatkówki.

patch-clamp-recording-starburst-amacrine-cells-flat-mount-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Ten film demonstruje technikę całokomórkowego patch-clamp do elektrofizjologicznego zapisu z płaskiej siatkówki myszy. Cienka szklana pipeta z elektrodą służy do zbliżania się do gwiazdotwórczych komórek amakrynowych (SAC) w siatkówce. Po uformowaniu uszczelki stosuje się ssanie w celu pęknięcia membrany i utworzenia konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. Na koniec mierzy się przepływ jonów przez receptory synaptyczne SAC za pomocą konfiguracji.

Ustanawianie opaski krosowej całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z siatkówki myszy z płaskim mocowaniem

Ten film demonstruje rejestrację wywołanych światłem reakcji postsynaptycznych w dostosowanym do ciemności preparacie tkanki siatkówki myszy. Wycinek siatkówki umieszcza się w komorze rejestrującej, a pipeta rejestrująca służy do ustalenia ciągłości elektrycznej z komórką zwojową siatkówki. Impulsy świetlne są stosowane do generowania pobudzających potencjałów postsynaptycznych w komórkach zwojowych, które są rejestrowane przez pipetę.

Wywołane światłem reakcje postsynaptyczne w neuronach wycinków siatkówki myszy

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Poznaj technikę patch clamp w płaskim preparacie siatkówki myszy do badania neuronów amakrynowych. Ta metoda umożliwia zachowanie połączeń synaptycznych i analizę aktywności elektrycznej komórek siatkówki.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów