Elektrofizjologiczne nagrania przeprogramowanych neuronów w wycinku mózgu myszy

Weźmy unieruchomiony, genetycznie zmodyfikowany wycinek koronalny myszy w komorze nagraniowej wypełnionej natlenizowanym buforem.

Wycinek zawiera obszar prążkowia, w którym znajdują się interneurony przeprogramowane z komórek prekursorowych oligodendrocytów oznaczonych markerem interneuronowym i ekspresją białka fluorescencyjnego.

Zmontuj pipetę rejestrującą składającą się z elektrody zanurzonej w roztworze wewnątrzkomórkowym.

Mikroskopowo zidentyfikuj fluorescencyjny interneuron.

Utrzymuj dodatnie ciśnienie w pipecie i przesuwaj ją w kierunku docelowego interneuronu, stykając się z błoną.

Zastosuj podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie o wysokiej wytrzymałości.

Zastosuj impulsy podciśnienia, aby przebić membranę, ustanawiając konfigurację całego ogniwa.

Utrzymuj potencjał błonowy interneuronu na stałej wartości ujemnej.

Zastosuj krótkie prądy przyrostowe, otwierając kanały jonowe i zmieniając potencjał błony, wyzwalając potencjał czynnościowy.

W końcu membrana wraca do potencjału spoczynkowego.

Obserwuj te zmiany w potencjale błony w odpowiedzi na bieżące wstrzyknięcie, wskazując na dojrzewanie neuronów i pomyślne przeprogramowanie.

Po przeniesieniu jednego wycinka tkanki do komory rejestrującej w celu elektrofizjologii, zamontuj szklaną pipetę na elektrodzie rejestrującej i opuść ją do roztworu. Dokładnie sprawdź rezystancję elektrody. Następnie powoli zbliż się pipetą do przeprogramowanej komórki, utrzymując lekkie dodatnie ciśnienie w elektrodzie, aby uniknąć zatkania końcówki, i sprawdź, czy ogniwo jest GFP-dodatnie przed załataniem.

Gdy ogniwo zostanie załatane, utrzymuj ogniwo w cęgach prądowych od minus 60 do minus 70 miliwoltów i wstrzykuj prądy 500-milisekundowe od minus 20 do plus 90 pikoamperów z przyrostami 10-pikoamperowymi, aby indukować potencjały czynnościowe. Wskazuje to na dojrzewanie neuronów i udane przeprogramowanie.