Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Ogólnym celem tej eksperymentalnej procedury jest uzyskanie dostępu do układu elektrod w komorze rejestracyjnej w celu stymulacji prądem stałym wycinka mózgu i jego wpływu na aktywność podobną do napadu rejestrowaną za pomocą układu wieloelektrodowego. To może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące stymulacji prądem stałym, a matryca wieloelektrodowa zarejestrowała aktywność podobną do napadu w wycinku mózgu myszy. Zaletą tej techniki jest to, że efekty stymulacji prądem stałym można ocenić w określonym wycinku mózgu myszy.

Procedurę zademonstrują Hsiang Chin i Wei-Jen Chang, technicy z mojego laboratorium. W tej procedurze przed eksperymentem wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 75% roztworem etanolu. Następnie odsłoń czaszkę zwierzęcia i odetnij pozostały mięsień.

Następnie oderwij grzbietową powierzchnię czaszki za pomocą rongeurs i odetnij boki. Następnie za pomocą szpatułki przetnij opuszki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej powierzchni mózgu przed jego usunięciem. Szybko przenieś mózg do zlewki wypełnionej lodowatym, natlenionym ACSF.

Aby przygotować plastry zawierające szlak MT-ACC, wykonaj nacięcie strzałkowe, 2 mm w bok od linii środkowej w każdej półkuli, aby wyświetlić anatomię podkorową. Następnie wykonaj kątowe cięcie poprzeczne równolegle do widocznego przewodu światłowodowego w prążkowiu. Wykonaj drugi kątowy przekrój krzyżowy od połączenia między móżdżkiem a korą wzrokową do punktu środkowego między spoidłem przednim a drogami wzrokowymi, które są brzuszne i równoległe do szlaku zakrętu obręczy wzgórza.

Następnie przymocuj blok mózgu do kanciastej płytki za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Wykonaj cięcie tuż nad punktem zwrotnym ścieżki. Następnie rozłóż płytkę, spłaszcz ją i przyklej do stopnia komorowego wibratomu.

Następnie pokrój plastry mózgu o grubości 500 mikrometrów i trzymaj je w lodowato natlenionym ACSF. Przenieś plasterek do komory rejestracyjnej w temperaturze 32 stopni Celsjusza z ciągłą obfitością natlenionego ACSF przez jedną godzinę. Potwierdź umieszczenie sondy MEA w systemie wielokanałowym.

Użyj jednej rurki, aby wprowadzić ACSF do komory MEA, a drugiej rurki, aby wyprowadzić ACSF z komory. Preparat należy w sposób ciągły przetapiać ciepłym, natlenionym ACSF w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Za pomocą mokrego bawełnianego wacika przenieś plasterek mózgu do MEA.

Ostrożnie przesuń wycinek mózgu, aby zorientować ACC nad elektrodami, a następnie ustabilizuj wycinek mózgu za pomocą kotwicy do wycinka, aby zapewnić dobre połączenie elektryczne między wycinkiem a elektrodami. Następnie umieść elektrodę anodową proksymalnie do ACC, a elektrodę katodową dystalnie do ACC. Zapisz natężenie pola według dwóch orientacji pola MEA.

Następnie dostarcz prąd elektryczny za pomocą stymulatora. Dostosuj odległość między dwiema elektrodami chlorku srebra do około 1,5 do 2 cm i dostosuj natężenie prądu stymulatorów, aby DCS wynosił od 0,5 do 2 miliamperów. W tej procedurze umieść elektrodę wolframową w MT i dostarczaj impulsy ze stymulatora do obszaru wzgórza plastru.

Następnie użyj różnych natężeń prądu, aby określić próg, który wywołuje odpowiedź ACC. Przesuń elektrodę wolframową wzdłuż szlaku wzgórza obręczy, aby uzyskać optymalny profil odpowiedzi. Nagraj od 1 do 20 odpowiedzi ACC i użyj oprogramowania, aby automatycznie uśrednić wszystkie odpowiedzi ACC wywołane moją stymulacją MT.

Aby wywołać aktywność podobną do napadu, dodaj 250 mikromolowych 48P i 5 mikromolowych bicukuliny do roztworu perfuzyjnego i kontynuuj obfite wyciskanie przez dwie do trzech godzin. Utrzymuj pompę na stosunkowo szybkim tempie perfuzji, co może pomóc w zapobieganiu gromadzeniu się gradientu pH. Następnie umieść elektrodę wolframową w MT i dostarcz stymulację elektryczną, aby uzyskać profil odpowiedzi ACC.

Nagraj 10-20 przebiegów i uśrednij odpowiedzi. Następnie zastąp roztwór prefuzyjny świeżym ACSF, aby wypłukać leki. W tej procedurze należy zapewnić wytwarzanie jednorodnych pól elektrycznych, przepuszczając prądy między dwoma równoległymi drutami srebrnymi pokrytymi chlorkiem srebra, które są umieszczone w komorze MEA.

Jeśli nie ma żadnych problemów, DCS powinien pozostać w zakresie od 0,5 do 2 miliamperów. Następnie wyłącz DCS i stymuluj wzgórze elektrodą wolframową. Aby uzyskać maksymalne odpowiedzi synaptyczne w ACC, należy zarejestrować 10-20 odpowiedzi, a następnie je uśrednić.

Następnie włącz DCS i jednocześnie stymuluj wzgórze. Oceń zmiany amplitudy stymulacji wzgórza wywołanej odpowiedzią ACC podczas DCS. Teraz wyłącz DCS, dodaj 250 mikromolowych 48P i 5 mikromolowych dwuklakuliny do roztworu perfuzyjnego i odczekaj 2-3 godziny.

Jeśli leki wpływają na wycinek mózgu, wycinek powinien wywołać korowe reakcje napadowe. Następnie zbierz 10-20 odpowiedzi korowych przedniej części zakrętu obręczy i zmierz amplitudę i czas trwania elektrycznie wywołanych reakcji napadowych kory mózgowej. Zagnieźdź się, włącz DCS i jednocześnie stymuluj wzgórze.

Oceń zmiany amplitudy i czasu trwania wywołanych reakcji napadowych kory mózgowej podczas aplikacji DCS. Następnie zastąp roztwór perfuzyjny świeżym ACSF, aby wypłukać leki. Rysunek ten pokazuje różne reakcje wywołane, które obejmują stymulację wzgórza wywołaną odpowiedziami w ACC, aktywność wywołaną przez lek, aktywność podobną do napadu oraz zarówno stymulację wzgórza, jak i aktywność podobną do napadu wywołanego lekiem.

Rysunek ten pokazuje wpływ różnych orientacji w DCS, takich jak różne orientacje w polu elektrycznym, stymulacja wzgórzowa wywołana reakcjami DCS oraz wpływ katodowego DCS na aktywność podobną do napadów. Na tym rysunku pokazano, że 15 minut katodowego DCS skutecznie wywołało długotrwałą depresję i wywołane reakcje depresyjne. Czas trwania napadu uległ znacznemu skróceniu po 15 minutach katodowego DCS w porównaniu z brakiem aplikacji DCS.

szybciej, technicznie rzecz biorąc, można to zrobić w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne kwestie, takie jak przezczaszkowa stymulacja magnetyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zapewnienie nieinwazyjnych podejść do kontrolowania napadów oporności. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią nieinwazyjną do zbadania metod leczenia napadów na modelu zwierzęcym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać obecnej stymulacji do oceny aktywności podobnej do napadów w wycinkach mózgu.