Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy
7 czerwca 2016
Badania wykazały, że katodowa przezczaszkowa stymulacja prądem stałym może powodować efekt tłumiący napady oporne na leki. W tym badaniu opracowano konfigurację eksperymentalną in vitro, w której oceniano stymulację prądem stałym i rejestrację wieloelektrodową aktywności podobnej do napadu w przygotowaniu wycinków mózgu myszy. Ocenie poddano parametry stymulacji prądem stałym.
Ogólnym celem tej eksperymentalnej procedury jest uzyskanie dostępu do układu elektrod w komorze rejestracyjnej w celu stymulacji prądem stałym wycinka mózgu i jego wpływu na aktywność podobną do napadu rejestrowaną za pomocą układu wieloelektrodowego. To może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące stymulacji prądem stałym, a matryca wieloelektrodowa zarejestrowała aktywność podobną do napadu w wycinku mózgu myszy. Zaletą tej techniki jest to, że efekty stymulacji prądem stałym można ocenić w określonym wycinku mózgu myszy.
Procedurę zademonstrują Hsiang Chin i Wei-Jen Chang, technicy z mojego laboratorium. W tej procedurze przed eksperymentem wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 75% roztworem etanolu. Następnie odsłoń czaszkę zwierzęcia i odetnij pozostały mięsień.
Następnie oderwij grzbietową powierzchnię czaszki za pomocą rongeurs i odetnij boki. Następnie za pomocą szpatułki przetnij opuszki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej powierzchni mózgu przed jego usunięciem. Szybko przenieś mózg do zlewki wypełnionej lodowatym, natlenionym ACSF.
Aby przygotować plastry zawierające szlak MT-ACC, wykonaj nacięcie strzałkowe, 2 mm w bok od linii środkowej w każdej półkuli, aby wyświetlić anatomię podkorową. Następnie wykonaj kątowe cięcie poprzeczne równolegle do widocznego przewodu światłowodowego w prążkowiu. Wykonaj drugi kątowy przekrój krzyżowy od połączenia między móżdżkiem a korą wzrokową do punktu środkowego między spoidłem przednim a drogami wzrokowymi, które są brzuszne i równoległe do szlaku zakrętu obręczy wzgórza.
Następnie przymocuj blok mózgu do kanciastej płytki za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Wykonaj cięcie tuż nad punktem zwrotnym ścieżki. Następnie rozłóż płytkę, spłaszcz ją i przyklej do stopnia komorowego wibratomu.
Następnie pokrój plastry mózgu o grubości 500 mikrometrów i trzymaj je w lodowato natlenionym ACSF. Przenieś plasterek do komory rejestracyjnej w temperaturze 32 stopni Celsjusza z ciągłą obfitością natlenionego ACSF przez jedną godzinę. Potwierdź umieszczenie sondy MEA w systemie wielokanałowym.
Użyj jednej rurki, aby wprowadzić ACSF do komory MEA, a drugiej rurki, aby wyprowadzić ACSF z komory. Preparat należy w sposób ciągły przetapiać ciepłym, natlenionym ACSF w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Za pomocą mokrego bawełnianego wacika przenieś plasterek mózgu do MEA.
Ostrożnie przesuń wycinek mózgu, aby zorientować ACC nad elektrodami, a następnie ustabilizuj wycinek mózgu za pomocą kotwicy do wycinka, aby zapewnić dobre połączenie elektryczne między wycinkiem a elektrodami. Następnie umieść elektrodę anodową proksymalnie do ACC, a elektrodę katodową dystalnie do ACC. Zapisz natężenie pola według dwóch orientacji pola MEA.
Następnie dostarcz prąd elektryczny za pomocą stymulatora. Dostosuj odległość między dwiema elektrodami chlorku srebra do około 1,5 do 2 cm i dostosuj natężenie prądu stymulatorów, aby DCS wynosił od 0,5 do 2 miliamperów. W tej procedurze umieść elektrodę wolframową w MT i dostarczaj impulsy ze stymulatora do obszaru wzgórza plastru.
Następnie użyj różnych natężeń prądu, aby określić próg, który wywołuje odpowiedź ACC. Przesuń elektrodę wolframową wzdłuż szlaku wzgórza obręczy, aby uzyskać optymalny profil odpowiedzi. Nagraj od 1 do 20 odpowiedzi ACC i użyj oprogramowania, aby automatycznie uśrednić wszystkie odpowiedzi ACC wywołane moją stymulacją MT.
Aby wywołać aktywność podobną do napadu, dodaj 250 mikromolowych 48P i 5 mikromolowych bicukuliny do roztworu perfuzyjnego i kontynuuj obfite wyciskanie przez dwie do trzech godzin. Utrzymuj pompę na stosunkowo szybkim tempie perfuzji, co może pomóc w zapobieganiu gromadzeniu się gradientu pH. Następnie umieść elektrodę wolframową w MT i dostarcz stymulację elektryczną, aby uzyskać profil odpowiedzi ACC.
Nagraj 10-20 przebiegów i uśrednij odpowiedzi. Następnie zastąp roztwór prefuzyjny świeżym ACSF, aby wypłukać leki. W tej procedurze należy zapewnić wytwarzanie jednorodnych pól elektrycznych, przepuszczając prądy między dwoma równoległymi drutami srebrnymi pokrytymi chlorkiem srebra, które są umieszczone w komorze MEA.
Jeśli nie ma żadnych problemów, DCS powinien pozostać w zakresie od 0,5 do 2 miliamperów. Następnie wyłącz DCS i stymuluj wzgórze elektrodą wolframową. Aby uzyskać maksymalne odpowiedzi synaptyczne w ACC, należy zarejestrować 10-20 odpowiedzi, a następnie je uśrednić.
Następnie włącz DCS i jednocześnie stymuluj wzgórze. Oceń zmiany amplitudy stymulacji wzgórza wywołanej odpowiedzią ACC podczas DCS. Teraz wyłącz DCS, dodaj 250 mikromolowych 48P i 5 mikromolowych dwuklakuliny do roztworu perfuzyjnego i odczekaj 2-3 godziny.
Jeśli leki wpływają na wycinek mózgu, wycinek powinien wywołać korowe reakcje napadowe. Następnie zbierz 10-20 odpowiedzi korowych przedniej części zakrętu obręczy i zmierz amplitudę i czas trwania elektrycznie wywołanych reakcji napadowych kory mózgowej. Zagnieźdź się, włącz DCS i jednocześnie stymuluj wzgórze.
Oceń zmiany amplitudy i czasu trwania wywołanych reakcji napadowych kory mózgowej podczas aplikacji DCS. Następnie zastąp roztwór perfuzyjny świeżym ACSF, aby wypłukać leki. Rysunek ten pokazuje różne reakcje wywołane, które obejmują stymulację wzgórza wywołaną odpowiedziami w ACC, aktywność wywołaną przez lek, aktywność podobną do napadu oraz zarówno stymulację wzgórza, jak i aktywność podobną do napadu wywołanego lekiem.
Rysunek ten pokazuje wpływ różnych orientacji w DCS, takich jak różne orientacje w polu elektrycznym, stymulacja wzgórzowa wywołana reakcjami DCS oraz wpływ katodowego DCS na aktywność podobną do napadów. Na tym rysunku pokazano, że 15 minut katodowego DCS skutecznie wywołało długotrwałą depresję i wywołane reakcje depresyjne. Czas trwania napadu uległ znacznemu skróceniu po 15 minutach katodowego DCS w porównaniu z brakiem aplikacji DCS.
szybciej, technicznie rzecz biorąc, można to zrobić w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne kwestie, takie jak przezczaszkowa stymulacja magnetyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zapewnienie nieinwazyjnych podejść do kontrolowania napadów oporności. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią nieinwazyjną do zbadania metod leczenia napadów na modelu zwierzęcym.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać obecnej stymulacji do oceny aktywności podobnej do napadów w wycinkach mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Badanie to dotyczy wpływu stymulacji transkranialnej prądem stałym z użyciem elektrod katodowych na napady opornych na leki, przy użyciu modelu przekroju mózgu myszy in vitro. Układ elektrod oraz ich wpływ na aktywność przypominającą napady oceniono za pomocą wieloelektrodowej matrycy.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Elektrofizjologia
- Neurostymulacja
Tło
- Stymulacja transkranialna prądem stałym z użyciem elektrod katodowych ma potencjalne efekty terapeutyczne w przypadku napadów.
- Zrozumienie mechanizmów stymulacji może pomóc w opracowywaniu terapii dla opornej na leki epilepsji.
- Modele in vitro umożliwiają precyzyjną kontrolę i obserwację aktywności neuronowej.
- Wieloelektrodowe matryce zapewniają szczegółowe zapisy aktywności elektrycznej w przekrojach mózgu.
Cel badania
- Ocenić wpływ stymulacji prądem stałym na aktywność przypominającą napady w przekrojach mózgu myszy.
- Ocenić układ elektrod w komorze rejestrującej.
- Zgłębić zrozumienie ścieżek dotkniętych stymulacją.
Stosowane metody
- Przygotowanie przekrojów mózgu myszy do eksperymentu.
- Zastosowanie stymulacji transkranialnej prądem stałym z użyciem elektrod katodowych.
- Rejestrowanie aktywności przypominającej napady za pomocą wieloelektrodowej matrycy.
- Ocenienie parametrów stymulacji i ich efektów.
Główne wyniki
- Stymulację prądem stałym wywierała efekt hamujący na aktywność przypominającą napady.
- Określone układy elektrod wpływały na wyniki stymulacji.
- Badanie dostarczyło wglądu w ścieżki zaangażowane w modulacje napadów.
- Wyniki wspierają potencjał stymulacji prądem stałym w zastosowaniach terapeutycznych.
Wnioski
- Stymulacja transkranialna prądem stałym z użyciem elektrod katodowych może skutecznie modulować aktywność napadów in vitro.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia technik stymulacji w neuronaukach.
- Wymagane są dalsze badania, aby przełożyć te wyniki na zastosowania kliniczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of neuromodulation strategies for seizure disorders by evaluating direct current stimulation effects on thalamocingulate pathway plasticity and seizure-like activity in an in vitro mouse model. It supports target validation and predictive confidence in preclinical neurotherapeutic development by quantifying amplitude and duration changes in electrically evoked cortical responses. The approach provides a reproducible platform for screening stimulation parameters prior to in vivo testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding neuromodulation of thalamocingulate circuitry in seizure suppression.
- Operational Value: Enables biological de-risking of direct current stimulation targets through pathway-specific electrophysiological readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated brain slice preparations for standardized assessment of stimulation parameters including orientation, field strength, and duration.
- Operational Value: Delivers quantitative, multi-channel electrophysiological outputs that support assay reproducibility and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity in anterior cingulate cortex.
- Operational Value: Supports translational continuity from mechanistic discovery to preclinical evaluation of neuromodulation interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization in neuromodulation, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions prior to in vivo validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of thalamocingulate circuitry as a modifiable target for seizure control.
- Screening: Enables assay readiness through standardized multi-electrode array recording of stimulation-evoked and seizure-like responses.
- Analytics: Generates quantitative measurements of response amplitude and duration that allow comparative analysis across stimulation conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical continuity by modeling drug-resistant seizure phenotypes in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform for evaluating diverse neuromodulation paradigms beyond direct current stimulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target engagement by demonstrating suppression of seizure-like activity through cathodal stimulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via controlled perfusion, electrode placement, and multi-channel recording protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parameter optimization in vitro before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of neuromodulation candidates based on electrophysiological de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slice preparation, and multi-electrode array handling.
- Dependent on vibratory microtomes, perfusion systems, stimulators, and multi-electrode array acquisition units.
- Necessitates standardization of slice orientation, electrode positioning, and perfusion timing across experimental replicates.
- Adaptation to other brain regions or disease models may require validation of pathway preservation and stimulation efficacy.
- Practical limitations include slice viability duration and the need for precise control of current density and field orientation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Preparation of Medial Thalamus-anterior Cingulate Cortex Brain Slice
3:01
Preparation of Perfusion Chamber for Multielectrode Array Recording and Electric Field Generation
4:23
Electrically-induced Cortical Synaptic Responses and Seizure-like Activity
5:58
Testing Effect of DCS on Evoked Cortical Responses
7:37
Results: Testing of Evoked Responses and Effect of DCS on Seizure Activity
8:37
Conclusion
