Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest ocena rozmieszczenia elektrod w komorze rejestracyjnej podczas stymulacji prądem stałym skrawka mózgu oraz analiza wpływu tej stymulacji na aktywność przypominającą napady drgawkowe, rejestrowaną za pomocą wieloelektrodowej macierzy. Pozwala to na lepszą odpowiedź na kluczowe pytania dotyczące stymulacji prądem stałym oraz aktywności przypominającej napady drgawkowe w skrawku mózgu myszy rejestrowanej przez wieloelektrodową macierz. Zaletą tej techniki jest możliwość oceny efektów stymulacji prądem stałym w konkretnych szlakach skrawka mózgu myszy.

Procedurę zaprezentują Hsiang Chin oraz Wei-Jen Chang, technicy z mojego laboratorium. W ramach tej procedury wszystkie instrumenty chirurgiczne należy wysterylizować 75% roztworem etanolu przed rozpoczęciem eksperymentu. Następnie należy odsłonić czaszkę zwierzęcia i usunąć pozostałe mięśnie.

Następnie, za pomocą kuretek, usuń powierzchnię grzbietową czaszki i przytnij jej boki. Następnie, używając szpatułki, przetnij cebulki węchowe oraz połączenia nerwowe wzdłuż powierzchni brzusznej mózgu przed jego wyjęciem. Szybko przenieś mózg do zlewki wypełnionej lodowatym, natlenionym ACSF.

Aby przygotować skrawki zawierające szlak MT-ACC, wykonaj cięcie strzałkowe, 2 mm bocznie od linii środkowej w każdej półkuli, aby odsłonić anatomię podkorową. Następnie wykonaj skośne cięcie poprzeczne równolegle do widocznego pęczka włókien w prążkowiu. Wykonaj drugie skośne cięcie poprzeczne od połączenia między móżdżkiem a korą wzrokową do punktu środkowego międzystyk wpławu przedniego a drogą wzrokową, które znajdują się brzusznie i równolegle do szlaku obręczywą wzgórza.

Następnie przymocuj blok mózgu do płytki kątowej za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Wykonaj cięcie tuż nad punktem zwrotnym ścieżki. Po tym rozprostuj płytkę, wyrównaj ją i przyklej do stolika komory wibrotomu.

Następnie należy pociąć plastry mózgu na sekcje o grubości 500 micrometers i przechowywać je w schłodzonym do temperatury lodu, natlenionym ACSF. Przenieś plaster do komory rejestracyjnej w temperaturze 32 degrees Celsius z ciągłą perfuzją natlenionego ACSF przez jedną godzinę. Potwierdź umieszczenie sondy MEA w systemie wielokanałowym.

Użyj jednej rurki do doprowadzenia ACSF do komory MEA, a drugiej do odprowadzenia ACSF z komory. Płucz preparat w sposób ciągły, używając ciepłego, natlenionego ACSF o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Za pomocą wilgotnego patyczka bawełnianego przenieś skrawka mózgu na MEA.

Ostrożnie przesuń skrawek mózgu, aby zorientować ACC nad elektrodami, a następnie ustabilizuj skrawek za pomocą uchwytu do skrawków, aby zapewnić dobre połączenie elektryczne między skrawkiem a elektrodami. Następnie umieść anodę proksymalnie względem ACC, a katodę dystalnie względem ACC. Zarejestruj natężenie pola dla dwóch orientacji pola MEA.

Następnie należy podać prądy elektryczne za pomocą stymulatora. Odległość między dwiema elektrodami z chlorku srebra należy ustawić na około 1,5 do 2 cm, a natężenie prądu stymulatora dostosować tak, aby DCS wynosił od 0,5 do 2 mA. W tej procedurze należy umieścić elektrodę wolframową w MT i podać impulsy ze stymulatora do obszaru wzgórza w skrawku.

Następnie należy zastosować różne natężenia prądu, aby określić próg wywołujący odpowiedź ACC. Przesuwaj elektrodę wolframową wzdłuż szlaku wzgórkowo-przyśrodkowego, aby uzyskać optymalny profil odpowiedzi. Zarejestruj od 1 do 20 odpowiedzi ACC i wykorzystaj oprogramowanie do automatycznego uśrednienia wszystkich odpowiedzi ACC wywołanych stymulacją MT.

Aby wywołać aktywność przypominającą napady drgawek, do roztworu perfuzyjnego należy dodać 250 µM 48P oraz 5 µM bikukuliny i kontynuować perfuzję skrawka przez dwie do trzech godzin. Pompę należy utrzymać na stosunkowo wysokim tempie perfuzji, co może pomóc zapobiec powstaniu gradientu pH. Następnie należy umieścić elektrodę wolframową w MT i zastosować stymulację elektryczną w celu uzyskania profilu odpowiedzi ACC.

Zarejestruj 10-20 prób (sweepów) i wyciągnij średnią z odpowiedzi. Następnie zastąp roztwór przedfuzyjny świeżym ACSF w celu wypłukania leków. W tej procedurze należy zapewnić generowanie jednorodnych pól elektrycznych poprzez przepływ prądów między dwoma równoległymi srebrnymi drutami powlekanymi chlorkiem srebra, umieszczonymi w komorze MEA.

Jeśli nie występują problemy, wartość DCS powinna utrzymywać się w przedziale od 0,5 do 2 mA. Następnie wyłącz DCS i stymuluj wzgórze za pomocą elektrody wolframowej. Aby uzyskać maksymalne odpowiedzi synaptyczne w ACC, zarejestruj 10-20 odpowiedzi, a następnie wyciągnij z nich średnią.

Następnie włącz urządzenie DCS i jednocześnie stymuluj wzgórze. Oceń zmiany amplitudy odpowiedzi ACC wywołanej stymulacją wzgórza podczas działania DCS. Teraz wyłącz DCS, dodaj 250 micromolar 48P oraz 5 micromolar bicuculline do roztworu perfuzyjnego i odczekaj 2-3 godziny.

Jeśli leki wywarły wpływ na skibek mózgu, skibek powinien wykazywać odpowiedzi w postaci napadów korowych. Następnie należy zebrać od 10 do 20 odpowiedzi z przedniej części kory zakrętu obręczy oraz zmierzyć amplitudę i czas trwania elektrycznie wywołanych odpowiedzi napadowych kory. W kolejnym kroku należy włączyć DCS i jednocześnie stymulować wzgórze.

Oceń zmiany amplitudy i czasu trwania wywołanych odpowiedzi drgawek korowych podczas stosowania DCS. Następnie zastąp roztwór perfuzyjny świeżym ACSF w celu wypłukania leków. Rysunek ten przedstawia różne odpowiedzi wywołane, obejmujące odpowiedzi wywołane stymulacją wzgórza w obszarze ACC, aktywność przypominającą drgawki wywołaną lekami, a także aktywność przypominającą drgawki wywołaną zarówno przez stymulację wzgórza, jak i przez leki.

Na tej rycinie przedstawiono wpływ różnych orientacji w DCS, takich jak różne orientacje w polu elektrycznym, odpowiedzi wywołane stymulacją wzgórza podczas DCS oraz wpływ katodowego DCS na aktywność przypominającą drgawki. Na tym rysunku pokazano, że 15 minut katodowego DCS skutecznie indukuje długotrwałe obniżenie potencjału synaptycznego (LTD) i tłumi odpowiedzi wywołane. Czas trwania napadu uległ znacznemu skróceniu po 15 minutach katodowego DCS w porównaniu z grupą bez zastosowania DCS.

Szybciej; technicznie można to przeprowadzić w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie to wykonane prawidłowo. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne działania, takie jak przezczaszkowa stymulacja magnetyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład w celu zapewnienia nieinwazyjnych metod kontrolowania napadów opornych na leczenie. Po tym opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie terapii nieinwazyjnej do eksploracji metod leczenia napadów w modelu zwierzęcym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wykorzystać stymulację prądową do oceny aktywności przypominającej napady drgawkowe w skrawkach mózgu.