Name: Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę stymulacji prądem stałym i wieloelektrodowej rejestracji aktywności napadopodobnej w preparatach wycinków mózgu myszy. Technika ta umożliwia badanie wpływu stymulacji na szlaki neuronalne in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie techniczne ze strony Rdzenia Elektrofizjologii Obwodów Neuronowych w Academia Sinica. Prace te były wspierane przez Narodową Radę Nauki (102-2320-B-001-026-MY3 i 100-2311-B-001-003-MY3) oraz Program Neuroscience Academia Sinica.

Procedury, które dotyczą zwierząt, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt, Academia Sinica, Taipei, Tajwan.
1. Przygotowanie eksperymentalnego roztworu i sprzętu do zapisu w matrycy wieloelektrodowej
<ol>
	<li>Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF; 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 1 mM NaH2PO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3 i 10 mM glukozy, pęcherzykowy z 95% O2 i 5% CO2 ).</li>
	<li>Użyj dwóch typów sond MEA: 6 x 10 płaskich MEA i 8 x 8 MEA. Pierwsza sonda obejmuje obszar obejmujący korę, prążkowie i wzgórze. Ta ostatnia sonda obejmuje tylko obszar korowy.</li>
	<li>Użyj 60-kanałowego wzmacniacza z filtrem pasmowo-przepustowym ustawionym w zakresie od 0,1 Hz do 3 kHz przy 1,200 amplifikacji. Pobieraj dane z częstotliwością próbkowania 10 kHz.</li>
	<li>Umieść dwa srebrne druty pokryte AgCl w komorze MEA dla DCS. Użyj srebrnych drutów pokrytych AgCl do wytworzenia pól elektrycznych, które są generowane przez izolowany stymulator.</li>
	<li>Umieść elektrodę wolframową (średnica, 127 μm; długość, 7,62 cm; końcówka stożkowa 8° AC; rezystancja, 5 MΩ) do stymulacji wzgórza i umieść elektrodę odniesienia w komorze MEA. Dostarczaj prądy elektrody wolframowej za pomocą izolowanego stymulatora, który jest sterowany przez generator impulsów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie plastra mózgu
<ol>
	<li>Użyj samców myszy C57BL/6J w wieku 4-8 tygodni. Trzymanie zwierząt w klimatyzowanym pomieszczeniu (21-23 °C; 50% wilgotności; 12 godzin/12 godzin cyklu światła/ciemności, światło włącza się o 8:00) z bezpłatnym dostępem do jedzenia i wody.</li>
	<li>Pobrać 250 ml porcji aCSF, która została przygotowana w kroku 1.1, i umieścić ją w zlewce zawierającej lód. Jednocześnie dostarczaj ciągły gaz, który składa się w 95% zO2 i 5% CO2 .</li>
	<li>chirurgia
	<ol>
		<li>Znieczulić zwierzę 4% izofluranem w szklanym pudełku przez około 3 minuty. Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną głębokość znieczulenia (na co wskazuje brak reakcji na uszczypnięcie palca), umieść je na płytkiej tacy wypełnionej pokruszonym lodem i usuń głowę za pomocą nożyczek.</li>
		<li>Odsłoń czaszkę i odetnij pozostały mięsień. Następnie, za pomocą rongeurs, oderwij grzbietową powierzchnię czaszki od mózgu. Odetnij boki czaszki za pomocą rongeurs. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 75% roztworem etanolu.</li>
		<li>Za pomocą szpatułki przetnij opuszki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej powierzchni mózgu i usuń mózg. Po dekapitacji szybko przenieś mózg do zlewki wypełnionej lodowato natlenionym aCSF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wzgórza przyśrodkowego (MT)-ACC Brain Slice 
	Uwaga: Przygotuj plasterki, które zawierają ścieżkę od MT do ACC13.
	<ol>
		<li>Ręcznie wytnij blok mózgu za pomocą dwóch strzałkowych nacięć 2,0 mm bocznych do linii środkowej w każdej półkuli, aby wyświetlić anatomię podkorową. Następnie wykonaj dwa cięcia pod kątem. Wykonaj pierwsze cięcie poprzeczne równolegle do widocznego przewodu światłowodowego w prążkowiu.</li>
		<li>Wykonaj drugi przekrój poprzeczny od połączenia między móżdżkiem a korą wzrokową do punktu środkowego między spoidłem przednim a drogami wzrokowymi, które są brzuszne i równoległe do szlaku wzgórzowo-obręczowego.</li>
		<li>Przymocuj blok mózgu do kątowej płytki (~120°) za pomocą kleju cyjanoakrylowego i wykonaj nacięcie tuż nad punktem zwrotnym ścieżki. Rozłóż płytkę, spłaszcz ją i przyklej do stopnia komorowego wibratomu.</li>
		<li>Przygotować przyśrodkowe plastry mózgu wzgórza-ACC (o grubości 500 μm), a następnie zanurzyć je w lodowato natlenionym aCSF. Przenieść plastry do komory rejestracyjnej i utrzymywać w temperaturze 32 °C pod ciągłą perfuzją (12 ml/min) z natlenionym aCSF przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie komory perfuzyjnej do zapisu w matrycy wieloelektrodowej
<ol>
	<li>Przygotowanie komory perfuzyjnej
	<ol>
		<li>Umieść sondę MEA w systemie wielokanałowym i użyj dwóch oddzielnych rurek polietylenowych, aby podłączyć sondę do pompy perystaltycznej. Użyj jednej rurki do wprowadzenia aCSF do komory MEA, a drugiej rurki do wyprowadzenia aCSF z komory. Na koniec należy w sposób ciągły perfekować preparat ciepłym (29-30 °C) natlenionym aCSF (8 ml/min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś wycinek mózgu do MEA. Przytrzymaj plasterek mózgu na MEA za pomocą mokrego bawełnianego wacika. Ostrożnie przesuń wycinek mózgu, aby upewnić się, że ACC jest zorientowany nad elektrodami.</li>
	<li>Użyj zestawów kotew do krojenia i przytrzymywania plasterków, aby docisnąć plasterek mózgu. Ten krok zapewnia dobre połączenie elektryczne między plastrem a elektrodami.</li>
</ol>
4. Generowanie pól elektrycznych przez DCS
Uwaga: Definicja orientacji pola elektrycznego opierała się na kierunku osi akkodendrytycznej w ACC. Orientacje przedziałów dendrytowych i soma potwierdzono za pomocą barwienia Golgiego12.
<ol>
	<li>Umieść elektrodę AgCl (zdefiniowaną jako anodę) proksymalnie do ACC, a drugą elektrodę (zdefiniowaną jako katoda) umieść dystalnie do ACC. Zapisz natężenie pola, które jest generowane przez dwie orientacje pola (równoległą i prostopadłą do włókien akkodendrytycznych ACC) przez MEA i dostarczaj prądy pól elektrycznych za pomocą stymulatora.</li>
	<li>Ustal odległość elektrod AgCl (około 1,5-2 cm) i dostosuj natężenie prądu stymulatora, aby DCS wynosił od 0,5 do 2 mA.</li>
</ol>
5. Elektrycznie indukowane korowe reakcje synaptyczne
Uwaga: Wywołanie reakcji synaptycznych w ACC poprzez stymulację elektryczną w MT, w której programowalny generator bodźców elektrycznych wytwarza prostokątne dwufazowe impulsy prądu.
<ol>
	<li>Powtórz sekcję 3 powyżej.</li>
	<li>Umieść elektrodę wolframową w MT i dostarczaj impulsy ze stymulatora do obszaru wzgórza plastrów za pomocą bipolarnych elektrod wolframowych.</li>
	<li>Użyj różnych natężeń prądu, aby określić próg, który wywołuje odpowiedź ACC. W tym przypadku użyj intensywności ±150 μA i czasu trwania 200 μs, co wywołało 80% maksymalną odpowiedź w ACC w większości plasterków.</li>
	<li>Przesunąć elektrodę wolframową wzdłuż szlaku wzgórza (od MT do ciała modzelowatego) w warstwie MT-ACC, aby uzyskać optymalne profile odpowiedzi.</li>
	<li>Wykonaj 10-20 przeciągnięć odpowiedzi ACC i użyj oprogramowania, aby automatycznie uśrednić wszystkie ACC wywołane stymulacją MT. Wynikiem są odpowiedzi synaptyczne w ACC indukowane przez stymulację MT przez szlak MT-ACC.</li>
</ol>
6. Aktywność podobna do napadu elektrycznego
Uwaga: Aktywność podobna do napadu została wywołana przez zastosowanie 4-aminopirydyny (4-AP; 250 μM) i bicukuliny (5 μM). Poprzednie badania czasowo-kontrolne wykazały, że maksymalne i stabilne odpowiedzi pojawiały się 2-3 godziny po zastosowaniu leku14.
<ol>
	<li>Powtórz sekcję 5 powyżej.</li>
	<li>Dodaj leki do roztworu perfuzyjnego. Użyj 4-AP (250 μM) i bicukuliny (5 μM). Równomiernie wymieszaj leki i kontynuuj perfuzję przez 2-3 godziny.</li>
	<li>Aby ułatwić aktywność podobną do napadów padaczkowych, utrzymuj pompę perfuzyjną na stosunkowo szybkim tempie perfuzji (8 ml/min), co może również pomóc w zapobieganiu gromadzeniu się gradientu pH.</li>
	<li>Umieść elektrodę wolframową w MT i dostarcz stymulację elektryczną (150 μA, czas trwania 200 μs), aby uzyskać profile odpowiedzi ACC.</li>
	<li>Wykonaj 10-20 przeciągnięć i uśrednij odpowiedzi.</li>
	<li>Zastąp roztwór perfuzyjny świeżym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby wypłukać leki. Powtórz krok 6.5.</li>
</ol>
7. Testowanie wpływu DCS na wywołane reakcje korowe
<ol>
	<li>Powtórz sekcje 3 i 4. Upewnij się, że równomierne pola elektryczne są generowane przez przepuszczanie prądów między dwoma równoległymi srebrnymi drutami pokrytymi AgCl, które są umieszczone w komorze MEA. Jeśli nie ma żadnych problemów, DCS pozostaje w zakresie od 0,5 do 2 mA.</li>
	<li>Wyłącz DCS i umieść elektrodę wolframową, aby stymulować wzgórze (±150 μA, czas trwania 200 μs). Aby uzyskać maksymalne odpowiedzi synaptyczne w ACC, wykonaj 10-20 przemiatania i uśrednij odpowiedzi.</li>
	<li>Jednocześnie włącz DCS (siła DCS 2 mV/mm) i stymulację wzgórzową (350 μA, czas trwania 200 μs). Oceń zmiany amplitudy odpowiedzi ACC wywołanej stymulacją wzgórza podczas DCS.</li>
	<li>Wyłączyć DCS i dodać 4-AP (250 μM) i bicukulinę (5 μM) do roztworu perfuzyjnego. Następnie odczekaj 2-3 godziny. Kiedy leki wpływają na wycinek mózgu, wycinek wywołuje korowe reakcje napadowe.</li>
	<li>Wykonaj 10-20 przemiatania odpowiedzi ACC, a następnie zmierz amplitudę i czas trwania elektrycznych wywołanych reakcji napadowych kory</li> mózgowej.
	<li>Po kroku 7.5 włącz jednocześnie DCS (siła DCS 2 mV/mm) i stymulację wzgórza (150 μA, czas trwania 200 μs). Oceń zmiany amplitudy i czasu trwania wywołanych reakcji napadowych kory mózgowej podczas aplikacji DCS.</li>
	<li>Zastąp roztwór perfuzyjny świeżym płynem płynu mózgowo-rdzeniowego w celu wypłukania leków i powtórz kroki 7.2 i 7.3.</li>
	<li>Zbierz wszystkie dane rejestracyjne i pogrupuj je w różne warunki eksperymentalne. Oceń amplitudę i czas trwania reakcji napadowych kory mózgowej w różnych warunkach eksperymentalnych.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania (np. oprogramowania MC Rack), aby automatycznie uśrednić nagrane odpowiedzi i wyeksportować surowe dane do arkusza kalkulacyjnego. Przeanalizuj amplitudę i czas trwania surowych danych i wygeneruj figury kolorów.</li>
	<li>Aby wykryć drgawki oscylacyjne, należy użyć oprogramowania do pomiaru wartości podstawowej i odchyleń standardowych (SD). Ustaw 3 SD poziomu hałasu jako próg. Amplitudy szczytów podczas oscylacji, które przekraczają ten próg, są wykrywane automatycznie.</li>
	<li>Wykonaj analizę statystyczną za pomocą testu t-Studenta.</li>
	<li>Pomiary ekspresowe i jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) dają w tekście średnią ± SE, gdzie n oznacza liczbę badanych wycinków12.</li>
</ol>

<ol><li>Schiller, Y., Najjar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+response+to+antiepileptic+drugs%3A+effect+of+past+treatment+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantifying the response to antiepileptic drugs: effect of past treatment history.</a> Neurology. 70 (1), 54-65 (2008).</li>
<li>Fregni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+clinical+trial+of+cathodal+DC+polarization+in+patients+with+refractory+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A controlled clinical trial of cathodal DC polarization in patients with refractory epilepsy.</a> Epilepsia. 47 (2), 335-342 (2006).</li>
<li>Auvichayapat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+direct+current+stimulation+for+treatment+of+refractory+childhood+focal+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimul%22%5BJournal%5D)">Transcranial direct current stimulation for treatment of refractory childhood focal epilepsy.</a> Brain Stimul. 6 (4), 696-700 (2013).</li>
<li>Chung, M. G., Lo, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+brain+stimulation%3A+the+potential+for+use+in+the+rehabilitation+of+pediatric+acquired+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Noninvasive brain stimulation: the potential for use in the rehabilitation of pediatric acquired brain injury.</a> Arch Phys Med Rehabil. 96 (4 Suppl), S129-S137 (2015).</li>
<li>Del Felice, A., Magalini, A., Masiero, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow-oscillatory+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+Modulates+Memory+in+Temporal+Lobe+Epilepsy+by+Altering+Sleep+Spindle+Generators%3A+A+Possible+Rehabilitation+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimul%22%5BJournal%5D)">Slow-oscillatory Transcranial Direct Current Stimulation Modulates Memory in Temporal Lobe Epilepsy by Altering Sleep Spindle Generators: A Possible Rehabilitation Tool.</a> Brain Stimul. 8 (3), 567-573 (2015).</li>
<li>Garnett, E. O., Malyutina, S., Datta, A., den Ouden, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Use+of+the+Terms+Anodal+and+Cathodal+in+High-Definition+Transcranial+Direct+Current+Stimulation%3A+A+Technical+Note%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">On the Use of the Terms Anodal and Cathodal in High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation: A Technical Note.</a> Neuromodulation. , (2015).</li>
<li>Biraben, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fear+as+the+main+feature+of+epileptic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Neurosurg.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Fear as the main feature of epileptic seizures.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 70 (2), 186-191 (2001).</li>
<li>Zaatreh, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontal+lobe+tumoral+epilepsy%3A+clinical%2C+neurophysiologic+features+and+predictors+of+surgical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Frontal lobe tumoral epilepsy: clinical, neurophysiologic features and predictors of surgical outcome.</a> Epilepsia. 43 (7), 727-733 (2002).</li>
<li>Karim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+truth+about+lying%3A+inhibition+of+the+anterior+prefrontal+cortex+improves+deceptive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">The truth about lying: inhibition of the anterior prefrontal cortex improves deceptive behavior.</a> Cereb. Cortex. 20 (1), 205-213 (2010).</li>
<li>Keeser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+transcranial+direct+current+stimulation+changes+connectivity+of+resting-state+networks+during+fMRI%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal transcranial direct current stimulation changes connectivity of resting-state networks during fMRI.</a> J. Neurosci. 31 (43), 15284-15293 (2011).</li>
<li>Nelson, J. T., McKinley, R. A., Golob, E. J., Warm, J. S., Parasuraman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+vigilance+in+operators+with+prefrontal+cortex+transcranial+direct+current+stimulation+%28tDCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Enhancing vigilance in operators with prefrontal cortex transcranial direct current stimulation (tDCS).</a> Neuroimage. 85 (Pt 3), 909-917 (2014).</li>
<li>Chang, W. P., Lu, H. C., Shyu, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+direct-current+stimulation+against+cingulate+seizure-like+activity+induced+by+4-aminopyridine+and+bicuculline+in+an+in+vitro+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment with direct-current stimulation against cingulate seizure-like activity induced by 4-aminopyridine and bicuculline in an in vitro mouse model.</a> Exp. Neurol. 265, 180-192 (2015).</li>
<li>Lee, C. M., Chang, W. C., Chang, K. B., Shyu, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+and+input-specific+short-term+plasticity+in+anterior+cingulate+cortical+neurons+with+intact+thalamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization and input-specific short-term plasticity in anterior cingulate cortical neurons with intact thalamic inputs.</a> Eur. J. Neurosci. 25 (9), 2847-2861 (2007).</li>
<li>Chang, W. P., Shyu, B. C. Involvement of the thalamocingulate pathway in the regulation of cortical seizure activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChang%2C+WP+%22Recent+Research+Developments+in+Neuroscience%22">Recent Research Developments in Neuroscience</a>. Pandalai, S. G. 4, Research Signpost. Kerala. 1-27 (2013).</li>
<li>Brummer, S. B., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+considerations+for+safe+electrical+stimulation+of+the+nervous+system+with+platinum+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Electrochemical considerations for safe electrical stimulation of the nervous system with platinum electrodes.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 24 (1), 59-63 (1977).</li>
<li>Durand, D. M., Bikson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+and+control+of+epileptiform+activity+by+electrical+stimulation%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+IEEE%22%5BJournal%5D)">Suppression and control of epileptiform activity by electrical stimulation: a review.</a> Proc. IEEE. 89 (7), 1065-1082 (2001).</li>
<li>Fritsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+current+stimulation+promotes+BDNF-dependent+synaptic+plasticity%3A+potential+implications+for+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning.</a> Neuron. 66 (2), 198-204 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

W niniejszym badaniu zbadano wpływ czasu trwania i orientacji DCS na aktywność podobną do napadu ACC. Aby uzyskać stabilne dane w wycinkach mózgu myszy, kluczowe jest zachowanie integralności szlaku MT-ACC i uniknięcie jego uszkodzenia, zwłaszcza etapy, w których wykonuje się dwa kątowe nacięcia brzuszne i grzbietowe cięcie kory. Co więcej, czas przygotowania wycinka mózgu może również wpływać na aktywność wycinka mózgu, który powinien być jak najkrótszym czasem, aby mózg był świeży i silny. Poprzednie badanie wykazało, ...

Padaczka jest powszechnym zaburzeniem neurologicznym. Trzydzieści procent pacjentów z padaczką cierpi na napady lekooporne1. Przezczaszkowa stymulacja prądem stałym (tDCS) zapewnia nieinwazyjne podejście do kontrolowania lub zmiany aktywności sieci w dużych obszarach mózgu, takich jak napady padaczkowe. Badania kliniczne wykazały, że tDCS skutecznie leczy trudne do opanowania napadypadaczkowe 2 i może wywierać zarówno krótko-, jak i długoterminowe działanie supresyjne na napady3-5. Jednak mechanizm terapeutyczny działania tDCS jest nadal niejasny. Przedstawiony model wycinka mózgu jest metodą in vitro mającą na celu zbadanie, w jaki sposób mechanizm terapeutyczny działania tDCS zmienia objawy aktywności mózgu podobnej do napadów. W związku z tym, aby osiągnąć optymalne efekty, określone parametry stymulacji, w tym orientacja, natężenie pola i czas trwania stymulacji, muszą zostać przetestowane w modelu eksperymentalnym. Wcześniejsze badania wykazały, że orientacja pola elektrycznego jest ważna dla uzyskania efektów terapeutycznych6. W związku z tym możliwe jest przetestowanie i ułożenie orientacji elektrod względem położenia badanego wycinka mózgu.
Padaczka czołowa i napady przedniej kory obręczy (ACC) są często lekooporne7,8. Niektóre badania donosiły o zastosowaniu tDCS w korze obręczy9-11. Wykazano, że tDCS wpływa na czujność, podejmowanie decyzji i emocje poprzez zmianę aktywności ACC i może modulować pobudliwość neuronów i aktywność napadową w tym regionie mózgu12. Dlatego supresyjne działanie tDCS na napady ACC może być pomocne w leczeniu klinicznym i ocenie alternatywnych metod leczenia.
Obecny protokół opisuje przygotowanie elektrody w komorze rejestrującej do DCS wycinka mózgu i jego wpływ na rejestrację aktywności podobnej do napadu za pomocą matrycy wieloelektrodowej (MEA).

<table><tbody><tr><td>< silny> znieczulający: < / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Halocarbon Products Corporation&nbsp;</td><td>NDC 12164-002-25</td><td>4%</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>aCSF (razem:1 L):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza</td><td>MERCK</td><td>1.08337.1000</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>MERCK</td><td>1.06329.0500</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>MERCK</td><td>1.06404.1000</td><td>124 mM</td></tr><tr><td>(+)-L-askorbinian sodu, >=98%</td><td>SIGMA</td><td>A4034-100G</td><td>0,15 g/2 c.c</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu, bezwodny, ReagentPlus</td><td>SIGMA</td><td>M7506-500G</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>MERCK</td><td>1.02382.1000</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu monohydrat</td><td>MERCK</td><td>1.06346.1000</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>May & Baker LTD Dagenham England</td><td>MS 7616</td><td>4,4 mM</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Drugs:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(+)-Bicuculline</td><td>TOCRIS</td><td>0130</td><td>5 &micro; M w aCSF</td></tr><tr><td>4-aminopirydyna</td><td>TOCRIS</td><td>0940</td><td>250 &mikro; M w CSF</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Brain slice Przygotowanie:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>Series 1000</td><td>Blok krojenie na 500 i mikro; m grube plastry</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny><</td><td>silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Komentarze</silny></td></tr><tr><td><silny>System MEA:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondy wieloelektrodowe (MEA): 6 x 10 płaskie MEA</td><td>Multi Channel Systems</td><td>60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10</td><td>średnica elektrody, 30 i mikro; m; rozstaw elektrod, 500 i mikro; m; impedancja, 50 k&Omega; przy 200 Hz</td></tr><tr><td>Sondy wieloelektrodowe (MEA): 8 x 8 MEA&nbsp;</td><td>Ayanda Biosystems</td><td>60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8</td><td>elektroda piramidalna; średnica, 40 &mikro; m; Wysokość końcówki, 50 i mikro; m; rozstaw elektrod, 200 i mikro; m; impedancja, 1,000 k&Omega; przy 200 Hz</td></tr><tr><td>Zastosowano 60-kanałowy wzmacniacz z filtrem pasmowo-przepustowym ustawionym w zakresie od 0,1 Hz do 3 kHz przy 1 200-krotnym wzmocnieniu</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>Oprogramowanie MEA-1060-BC</td><td></td></tr><tr><td>MC Rack z częstotliwością próbkowania 10 KHz</td><td>Systemy</td><td></td> wielokanałowe <td>Oprogramowanie do zbierania danych i rejestracji</td></tr><tr><td>sterowania generatorem impulsów</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>STG 1002</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy kotew warstwowych i dociski</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-26H/10; WI64-0250</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna-minipuls3</td><td>Szybkość perfuzji</td> <td>Gilsom</td><td>MINIPULS3</td>: 8 ml / min</tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>System stymulacji:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izolowany stymulator</td><td>Systemy AM</td><td>Model 2100</td><td>intensywność &plusmn; 350 &mu; A , czas trwania 200 &mu; sec</td></tr><tr><td>Elektroda wolframowa</td><td>AM Systems</td><td>575300</td><td>umieszczona we wzgórzu</td></tr></tbody></table>

stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Katodowa przezczaszkowa stymulacja prądem stałym (tDCS) wywołuje działanie tłumiące napady oporne na leki. Aby wykonać skuteczne działania, parametry stymulacji (np. orientacja, natężenie pola i czas trwania stymulacji) muszą być zbadane w preparatach do wycinków mózgu myszy. Możliwe jest przetestowanie i ułożenie orientacji elektrody względem położenia wycinka mózgu myszy. Obecna metoda zachowuje szlak wzgórzowo-korzeniowy w celu oceny wpływu DCS na aktywność podobną do napadów w przedniej części kory obręczy. Wyniki nagrań z matrycy wielokanałowej wykazały, że katodowy DCS istotnie zmniejszył amplitudę reakcji wywołanych stymulacją i czas trwania aktywności podobnej do napadów 4-aminopirydyny i bicukuliny. Badanie to wykazało również, że katodowe zastosowanie DCS po 15 minutach spowodowało długotrwałą depresję w szlaku wzgórzowo-obręczowym. W niniejszym badaniu zbadano wpływ DCS na plastyczność synaptyczną talamocingulatu i ostre działania podobne do napadów. Obecna procedura może testować optymalne parametry stymulacji, w tym orientację, natężenie pola i czas trwania stymulacji w mysim modelu in vitro. Metoda może również ocenić wpływ DCS na aktywność podobną do napadów korowych zarówno na poziomie komórkowym, jak i sieciowym.

Przygotowanie skrawka wzgórza i kory obręczy oraz konfiguracja systemu rejestracji MEA
Przekrój MT-ACC pobrany od myszy to specjalna preparatyka skrawkowa, która umożliwia badanie właściwości elektrofizjologicznych drogi wzgórzowo- obrębowej. Rysunek 1A przedstawia sposób przygotowania przekroju MT-ACC. Mózg myszy został szybko usunięty i utrzymany w chłodnym, napowietrzonym aCSF (Rysunek 1A, a, b</stron...

Badania wykazały, że katodowa przezczaszkowa stymulacja prądem stałym może powodować efekt tłumiący napady oporne na leki. W tym badaniu opracowano konfigurację eksperymentalną in vitro, w której oceniano stymulację prądem stałym i rejestrację wieloelektrodową aktywności podobnej do napadu w przygotowaniu wycinków mózgu myszy. Ocenie poddano parametry stymulacji prądem stałym.

Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest ocena rozmieszczenia elektrod w komorze rejestracyjnej podczas stymulacji prądem stałym skrawka mózgu oraz analiza wpływu tej stymulacji na aktywność przypominającą napady drgawkowe, rejestrowaną za pomocą wieloelektrodowej macierzy. Pozwala to na lepszą odpowiedź na kluczowe pytania dotyczące stymulacji prądem stałym oraz aktywności przypominającej napady drgawkowe w skrawku mózgu myszy rejestrowanej przez wieloelektrodową macierz. Zaletą tej techniki jest możliwość oceny efektów stymulacji prądem stałym w konkretnych szlakach skrawka mózgu myszy.Procedurę zaprezentują Hsiang Chin oraz Wei-Jen Chang, technicy z mojego laboratorium. W ramach tej procedury wszystkie instrumenty chirurgiczne należy wysterylizować 75% roztworem etanolu przed rozpoczęciem eksperymentu. Następnie należy odsłonić czaszkę zwierzęcia i usunąć pozostałe mięśnie.Następnie, za pomocą kuretek, usuń powierzchnię grzbietową czaszki i przytnij jej boki. Następnie, używając szpatułki, przetnij cebulki węchowe oraz połączenia nerwowe wzdłuż powierzchni brzusznej mózgu przed jego wyjęciem. Szybko przenieś mózg do zlewki wypełnionej lodowatym, natlenionym ACSF.

direct-current-stimulation-multi-electrode-array-recording-seizure

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia protokół wszczepienia wielozębowej liniowej sondy krzemowej do mózgu myszy w celu pomiaru lokalnych potencjałów pola. Procedura polega na przymocowaniu sondy do jednostki stereotaktycznej, ustawieniu jej dokładnie nad docelowym obszarem mózgu, wprowadzeniu jej do mózgu i zabezpieczeniu cementem dentystycznym. Po implantacji zespół zabezpieczany jest obudową. Po powrocie do zdrowia konfiguracja pozwala na rejestrowanie lokalnych potencjałów pola, zapewniając wgląd w...

Rejestrowanie aktywności elektrycznej mózgu u zachowujących się myszy za pomocą liniowych sond krzemowych z wieloma zębami

Ten protokół polega na użyciu układu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrycznej w wycinku mózgu wystawionym na działanie leku wywołującego drgawki. Procedura obejmuje umieszczenie wycinka mózgu w komorze rejestracyjnej MEA, zastosowanie stymulacji elektrycznej w celu wywołania sztucznych napadów i analizę uzyskanych sygnałów.

Monitorowanie aktywności elektrycznej neuronów wywołanej napadami padaczkowymi w wycinkach mózgu za pomocą układów mikroelektrod

W tym filmie badane są efekty przezczaszkowej stymulacji prądem stałym (tDCS) na wycinki mózgu zawierające przednią korę obręczy (ACC) i obszary wzgórza, używając matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru sygnałów elektrycznych. Dostarczając impulsy elektryczne i podając leki wywołujące napady, badanie bada odpowiedź ACC na napady.

Monitorowanie kory mózgowej za pomocą układu wieloelektrodowego w odpowiedzi na czynniki wywołujące napady

Film przedstawia badanie mające na celu ocenę wpływu stymulacji prądem stałym (DCS) na napady padaczkowe w wycinkach mózgu myszy. Wycinki mózgu zawierające połączone obszary przyśrodkowego wzgórza (MT) i przedniej kory obręczy (ACC) umieszcza się w układzie wieloelektrodowym (MEA). Bodźce elektryczne do MT i leki wywołujące napady są stosowane w celu wywołania napadów padaczkowych w ACC. Następnie stosuje się DCS w celu oceny jego wpływu na napady wywołane.

Wpływ stymulacji prądem stałym na wywołane napady padaczkowe w wycinkach mózgu myszy

Ten film pokazuje indukcję zdarzeń ictal w wycinkach kory koronalnej od transgenicznej myszy eksprymującej aktywowane światłem kanały kationowe w korowych pobudzających neuronach piramidowych. Wycinek umieszcza się w komorze nagrywającej, a elektrodę rejestrującą wprowadza się do powierzchownej warstwy korowej. Po perfuzji z lekiem wywołującym drgawki, który blokuje kanały potasowe, neurony stają się nadpobudliwe i generują spontaniczne zdarzenia ictal. Aby wygenerować zdarzenia ictal na...

Generowanie spontanicznych i na żądanie zdarzeń ictal w wycinkach kory mózgowej myszy

Tutaj opisujemy, jak wykonywać zapisy wieloelektrodowe tkanki ludzkiej kory padaczkowej. Szczegółowo zademonstrowano resekcję tkanki padaczkowej, przygotowanie plastrów i zapisy wieloelektrodowe zdarzeń międzynapadowych i ictalowych.

Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.

Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich

Tutaj przedstawiamy protokół użycia komplementarnych systemów układów mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do rejestrowania aktywności podobnej do napadu z wycinków mózgu ex vivo.

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

Opisano procedurę przygotowania skrawków zawierających jądro nadskrzyżowaniowe (SCN) podwzgórza dorosłej myszy oraz szybką metodę hodowli tkanki SCN w warunkach hodowli organotypowej. Ponadto opisano pomiar oscylacyjnej ekspresji białek genów zegarowych z wykorzystaniem dynamicznej technologii reporterowej lucyferazy.

Przygotowanie skrawków, organotypowe hodowanie tkanek i rejestracja aktywności genów zegarowych za pomocą lucyferazy w jądrze nadskrzyżowaniowym

Poznaj metodę stymulacji prądem stałym i wieloelektrodowej rejestracji aktywności napadopodobnej w preparatach wycinków mózgu myszy. Technika ta umożliwia badanie wpływu stymulacji na szlaki neuronalne in vitro.

Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów