Pomiar aktywności neuronalnej w wycinku mózgu myszy po długotrwałej inkubacji

Zabezpiecz wycinek mózgu myszy w komorze nagraniowej, wypełniony natlenionym aCSF po długotrwałej inkubacji.

Komórki w plasterku są załadowane wskaźnikiem wapnia, ułatwiającym wewnątrzkomórkowe pomiary wapnia.

Weź pipetę rejestracyjną składającą się z elektrody w roztworze elektrolitu.

Zidentyfikuj neuron docelowy. Umieść pipetę rejestrującą z dodatnim ciśnieniem na błonie komórkowej, tworząc wgłębienie.

Zastosuj podciśnienie, aby uzyskać szczelne uszczelnienie.

Ponadto zastosuj impulsy podciśnienia, rozrywając membranę i ustanawiając konfigurację całej komórki.

Perfuzja płynu mózgowo-rdzeniowego o wysokim stężeniu potasu, który depolaryzuje błonę neuronu.

Depolaryzacja otwiera kanały sodowe, wyzwalając potencjał czynnościowy, który z kolei aktywuje kanały wapniowe bramkowane napięciem i umożliwia napływ wapnia.

Jony wapnia wiążą się ze wskaźnikiem, wzmacniając fluorescencję, którą można uwidocznić przy odpowiednim oświetleniu.

Wzrost fluorescencji wewnątrzkomórkowej, spowodowany napływem wapnia po zastosowaniu potasu, wskazuje na żywotność neuronów po długotrwałej inkubacji.

W celu nagrania umieść tkankę w zanurzonej komorze zapisowej pod mikroskopem i perfuzuj ją natlenowanym aCSF z natężeniem przepływu od 4 do 5 mililitrów na minutę. Przytrzymaj tkankę za pomocą specjalnie wykonanej harfy. Następnie przygotuj kilka pipet rejestrujących za pomocą ściągacza do mikropipet, aby uzyskać końcową rezystancję od 5 do 6 megaomów.

Napełnij pipetę 3 do 4 mikrolitrami roztworu wewnętrznego, a następnie umieść roztwór na lodzie. Następnie zwizualizuj komórki za pomocą kamery CCD w IR-DIC. Umieść pipetę na błonie komórkowej za pomocą mikromanipulatora. Utrzymuj nadciśnienie przez port ssący w uchwycie pipety. Gdy pipeta znajdzie się na kuwecie, zastosuj delikatne podciśnienie do pipety, aby uzyskać gigaomowe uszczelnienie.

Następnie rozerwij błonę komórkową za pomocą krótkiego podciśnienia. Następnie rozpocznij rejestrację prądu lub cęgów cęgowych całego ogniwa. Dla pojedynczej długości fali wzbudzenia przepływu 4 przefiltruj światło wzbudzenia przez filtr pasmowo-przepustowy od 460 do 490 nanometrów i wyemitowane światło przez filtr pasmowo-przepustowy od 515 do 550 nanometrów.