Rejestrowanie aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnej w kokulturze neuron-astrocyt

Zacznij od płytki z matrycą wieloelektrodową lub MEA. Każda studzienka zawiera centralnie umieszczony układ elektrod.

Macierz jest pokryta substratem hodowlanym, aby ułatwić adhezję komórek.

Dodaj zawiesinę neuronów ruchowych i astrocytów w postaci kropelki nad matrycą.

Inkubuj, aby umożliwić przyczepienie komórek, a następnie dodaj ciepłą pożywkę do kohodowli uzupełnioną małą cząsteczką, która utrzymuje żywotność komórek.

Podczas inkubacji astrocyty wydzielają czynniki, które sprzyjają dojrzewaniu neuronów i tworzeniu synaps, w wyniku czego powstaje sieć neuronalna.

Umieść MEA w urządzeniu rejestrującym w warunkach fizjologicznych, aby monitorować aktywność neuronalną.

Neurony przekazują sygnały elektryczne, zwane potencjałami czynnościowymi, które przemieszczają się wzdłuż ich aksonów.

Po dotarciu do synapsy sygnał wyzwala uwalnianie neuroprzekaźnika, propagując sygnał do następnego neuronu.

Elektrody w każdej studzience zewnątrzkomórkowo rejestrują sygnały generowane przez neurony połączone synaptycznie.

Wykrycie zsynchronizowanych rytmicznych sygnałów elektrycznych potwierdza powstanie sieci neuronowej.

W dniu powlekania lub wcześniej należy rozpocząć powlekanie 24-dołkowych płytek MEA, najpierw rozcieńczając PLO w wodzie lub PBS. Następnie dodaj od 15 do 20 mikrolitrów PLO do każdej studzienki, tworząc kroplę na środku studzienki, zakrywając obszar elektrody, upewniając się, że elektrody nie zostaną uszkodzone końcówką pipety.

Dodaj wodę do studni otaczających komory, zapewniając odpowiednią wilgotność, i inkubuj PLO w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 do 2 godzin. Następnie, za pomocą plastikowej końcówki do mikropipet, odessać jak najwięcej PLO bez dotykania elektrod. Następnie umyj studnię trzykrotnie 250 mikrolitrami wody.

Za pomocą końcówki do pipet usuń jak najwięcej wody i pozostaw powierzchnię do wyschnięcia ze zdjętą pokrywką. Następnie dodaj od 15 do 20 mikrolitrów rozcieńczonej lamininy, aby pokryć każdy układ elektrod. Po dodaniu wody do komór wilgotnościowych i założeniu pokrywy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny do nocy.

W dniu posiewu, po jednokrotnym przepłukaniu neuronów ruchowych i kultur astrocytów PBS, dodaj 0,05% trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 5 minut, aby podnieść komórki. Zbierz komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej inhibitor trypsyny i umyj płytki pożywką lub zasadą, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.

Granulować komórki przez wirowanie, a następnie za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów ponownie zawiesić neurony ruchowe i astrocyty za pomocą pożywki kohodowlanej zawierającej 20 mikromolów inhibitora ROCK, aby wytworzyć 1 mililitr zawiesiny pojedynczej komórki. Za pomocą hemocytometru policz neurony ruchowe i astrocyty, a podczas liczenia zakryj zawiesiny komórek i umieść je w styropianowym stojaku o temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Odwirować 1 mililitr zawiesiny obu komórek 300 razy g przez 5 minut. Oblicz żądaną objętość i ponownie zawieś granulki. Połączyć wymaganą objętość zawiesin neuronów i astrocytów w równych proporcjach i delikatnie wymieszać, pipetując dwukrotnie, aby dokładnie się połączyć.

Następnie usuń lamininę z każdej studzienki płytki i przenieś 10 mikrolitrów końcowej połączonej zawiesiny komórek do każdej studzienki, tworząc małą kroplę pokrywającą układ elektrod. Inkubować płytki z niezakłóconą kroplą komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut, aby utworzyć początkowe przyczepy na płytkach.

Następnie odpipetować 250 mikrolitrów ciepłej pożywki do współhodowli zawierającej inhibitor ROCK na ściankę każdej studzienki i odpipetować tę samą objętość na przeciwległej ściance każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 do 36 godzin. Następnego dnia należy zbadać płytki pod kątem zanieczyszczeń lub martwych komórek i, jeśli to konieczne, wymienić pożywkę na świeżą pożywkę do kohodowli zawierającą inhibitor ROCK.

W przeciwnym razie wykonuj wymianę połowy pożywki dwa razy w tygodniu, używając pożywki do kohodowli bez inhibitora ROCK, zaczynając od 2 dnia wspólnej hodowli. Aby wykonać nagrywanie, rozpocznij jak najszybciej po pierwszym dniu wspólnej hodowli, ustawiając temperaturę na 37 stopni Celsjusza i dwutlenek węgla na 5%. Następnie należy przenieść płytki do urządzenia rejestrującego i równoważyć przez co najmniej pięć minut przed nagraniem. Rejestruj aktywność wyjściową co drugi dzień lub co tydzień przez 1 do 15 minut, w zależności od projektu eksperymentalnego.