Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis
15 marca 2018
W tym artykule omawiamy trzy preparaty mózgowe używane do rejestracji klamer z całych komórek w celu zbadania obwodu siatkówkowego kijanek Xenopus laevis. Każdy preparat, z własnymi specyficznymi zaletami, przyczynia się do eksperymentalnej wykonalności kijanki Xenopus jako modelu do badania funkcji obwodów neuronalnych.
Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie zapisów elektrofizjologicznych całej komórki z neuronów tektum nerwu wzrokowego kijanki, aby poznać ich wzorzec połączeń podczas rozwoju i ostatecznie zrozumieć, jak powstają i funkcjonują obwody nerwowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju neuronalnego, takie jak to, w jaki sposób neurony zmieniają się w trakcie rozwoju i jak funkcjonują obwody, które powodują zachowanie. Główną zaletą tych preparatów jest to, że pozwalają na elektrofizjologiczny zapis neuronów tektum wzrokowego, aby zapewnić wgląd w funkcję rozwijających się obwodów neuronalnych.
Procedurę zademonstruje Zhenyu Lui, doktorant w moim laboratorium. Za pomocą pipety do usuwania zanieczyszczeń przenieś znieczuloną kijankę do naczynia rejestrującego sekcję zawierającą zewnętrzny roztwór do nagrywania. Przymocuj znieczuloną kijankę do zanurzonego silikonowego bloku na podłodze naczynia do nagrywania sekcji.
Aby uzyskać wyraźny widok mózgu, usuń skórę pokrywającą mózg, wykonując powierzchowne nacięcie wzdłuż linii środkowej za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 25. Wyfiletuj mózg wzdłuż tej samej osi linii środkowej, wkładając igłę do cewy nerwowej i delikatnie pociągając w górę, tak aby grzbietowa część rurki została czysto przecięta, pozostawiając nienaruszoną płytkę podłogową. Aby wyizolować mózg, najpierw użyj igły o rozmiarze 25, aby przeciąć tyłomózgowie.
Następnie delikatnie przesuń igłę pod mózgiem w kierunku ogonowym do rostralnego, aby przeciąć całą boczną i brzuszną tkankę łączną oraz włókna nerwowe. Następnie przymocuj mózg do bloku elastomeru silikonowego, umieszczając jedną szpilkę przez jedną z opuszki węchowych, a drugą szpilkę przez tyłomózgowie. Jest to optymalna konfiguracja do nagrywania z neuronów tektalnych.
Następnie przenieś naczynie zawierające przypięty preparat całego mózgu z lunety prosektoryjnej do stanowiska do elektrofizjologii. Usuń błonę komorową za pomocą pipety z potłuczonego szkła. Aby bezpośrednio aktywować aksony RGC, delikatnie opuść bipolarną elektrodę stymulującą na skrzyżowanie wzrokowe, tak aby powstało małe wgniecenie w tkance.
Bipolarna elektroda stymulująca powinna być rostralna i prawie przylegać do dużej środkowej komory, w której znajduje się skrzyżowanie wzrokowe. Elektroda bipolarna napędzana jest stymulatorem impulsów, który pozwala na precyzyjną kontrolę siły stymulacji. Aby przygotować poziomy wycinek mózgu, zacznij od przygotowania całego mózgu.
Następnie użyj żyletki, aby wyciąć najbardziej boczną czwartą część jednej strony jednego z boków jednej tarczy optycznej. To cięcie jest wykonane równolegle do rostralnej płaszczyzny ogonowej. Następnie ponownie przypnij mózg do boku elastomeru silikonowego pokrojoną stroną skierowaną do góry, tak aby somata i neuropil były bezpośrednio dostępne w celu zapisu, a powierzchnia komorowa mózgu była skierowana od bloku elastomeru silikonowego, tak aby można było umieścić elektrodę bipolarną na skrzyżowaniu wzrokowym.
Następnie wykonaj rejestrację całego zacisku krosowego komórki lub potencjału lokalnego pola. Poniżej znajduje się schemat przedstawiający konfigurację poziomego przygotowania wycinka mózgu. Należy zauważyć, że chociaż elektroda stymulująca pozostaje na skrzyżowaniu wzrokowym, pipeta rejestrująca jest teraz ustawiona tak, aby uzyskać dostęp do komórek we wszystkich warstwach tektalnych odsłoniętych przez poziome przygotowanie wycinka mózgu.
Jest to reakcja wywołana przez RGC ze strony neuronu znajdującego się w powierzchownej warstwie tectum. Na tym rysunku zarejestrowane potencjały pola w neuropolu i przekształcone gęstości źródła prądu są pokazane na wykresie obrazu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 10 minut i zwykle trwa to do trzech lub czterech godzin.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać przygotowanie całego mózgu i poziomego wycinka mózgu do nagrań całych komórek w celu ilościowego określenia właściwości elektrycznych neuronów tektalnych i ich połączeń.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje techniki rejestracji patch-clamp w konfiguracji whole-cell w celu zbadania obwodu siatkówkowo-dachowego u kijanek Xenopus laevis. Wykorzystując różne preparaty mózgowe, badanie ma na celu zrozumienie wzorców połączeń neuronów w dachu optycznym kijanki podczas rozwoju oraz ogólnej funkcji obwodów neuronalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Obwody neuronalne
Wstęp
- Badanie sposobów formowania się i funkcjonowania obwodów neuronalnych w rozwijających się organizmach.
- Obwód retinotektalny ma kluczowe znaczenie dla przetwarzania bodźców wzrokowych u płazów.
- Kijanki Xenopus laevis stanowią cenny model do badania połączeń neuronalnych.
- Rejestracje z całej komórki (whole cell recordings) dostarczają szczegółowych informacji na temat aktywności neuronów.
Cel badania
- Zrozumienie wzorców łączności między neuronami w opuszkach wzrokowych.
- Analiza zmian zachodzących w neuronach w trakcie rozwoju.
- Zbadanie wpływu obwodów neuronalnych na zachowanie.
Zastosowane metody
- Do rejestracji elektrofizjologicznych wykorzystano metodę patch clamp w konfiguracji whole-cell.
- Model biologiczny obejmował wypreparowane mózgi kijanek w celu badania neuronów wzgórza optycznego.
- Nie wspomniano o żadnych przepływach pracy z zakresu multiomiki.
- Konkretne etapy obejmowały unieruchomienie kijanki, izolację mózgu oraz wykonanie celowanych pomiarów.
- Zastosowane metody umożliwiają rejestrację w kluczowym oknie czasowym wynoszącym 10 minut, a cała procedura zazwyczaj trwa kilka godzin.
Główne wyniki
- Przygotowane preparaty umożliwiły pomyślną rejestrację aktywności neuronów w tectum.
- Zaobserwowano zmiany elektrofizjologiczne wskazujące na łączność neuronalną.
- Wyniki stały się podstawą do dyskusji nad funkcjonalnymi implikacjami obwodu siatkówkowo-tekta lnego.
- Otrzymane wyniki przyczyniają się do zrozumienia rozwoju obwodów neuronalnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia skuteczne metody badania łączności neuronalnej w rozwijających się mózgach kijanek.
- Badanie to pogłębia zrozumienie funkcji obwodów neuronalnych podczas rozwoju.
- Wyniki mają szersze znaczenie dla analizy procesów neurologicznych i zachowań u płazów.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Rejestracja metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell u kijanek Xenopus laevis umożliwia wysokorozdzielcze badanie formowania i funkcji obwodów neuronalnych, dostarczając mechanistycznych informacji na temat łączności synaptycznej i pobudliwości neuronów podczas rozwoju. Podejście to wspiera walidację celów w neuronauce, pozwalając na bezpośredni pomiar odpowiedzi neuronalnych na określone bodźce, takie jak aktywność w wzgórzu optycznym wywołana przez komórki zwoju siatkówki. Adaptacyjność tej metody w preparatach in vivo, całego mózgu oraz w poziomej sekcji zwiększa powtarzalność i skalowalność w procesie przedklinicznego ograniczania ryzyka związanego z celami neurorozwojowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację odpowiedzi neuronalnych na bodźce sensoryczne, co pozwala na wyjaśnienie łączności funkcjonalnej w rozwijających się obwodach.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki bezpośrednim odczytom elektrofizjologicznym aktywności neuronalnej, co zmniejsza niejednoznaczność w ocenie oddziaływania na cel.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi zmianami w pobudliwości neuronów wzgórza oraz integracji synaptycznej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszego przesiewania związków poprzez opracowanie stabilnych, rejestrowalnych preparatów neuronalnych o określonych właściwościach odpowiedzi na bodziec.
- Wyniki ilościowe: Generowanie pomiarów elektrofizjologicznych, takich jak prądy postsynaptyczne i potencjały polowe, co umożliwia analizę zależności dawka-odpowiedź oraz kwantyfikację efektów działania związków.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Przygotowanie horyzontalnych przekrojów mózgu umożliwia rejestrację we wszystkich warstwach tectum, co zwiększa przepustowość i powtarzalność w przypadku wielokrotnych sesji eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Modeluje procesy neurorozwojowe istotne dla zaburzeń związanych z błędami w okablowaniu obwodów neuronalnych, wspierając poszukiwania translacyjnych biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkryć z walidacją, umożliwiając spójną rejestrację funkcji neuronalnych w różnych punktach czasowych rozwoju.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Wspiera kryteria go/no-go w oparciu o fenotypy elektrofizjologiczne, redukując ryzyko niepowodzeń w późnych etapach programów neurorozwojowych.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając funkcjonalną walidację celów neuronalnych przed optymalizacją wiodących związków, a jej wyniki dostarczają informacji służących zarówno do wyboru celu, jak i zrozumienia mechanizmów działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez rejestrację odpowiedzi wywołanych w neuronach tekton po stymulacji aksonów komórek zwojowych siatkówki.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki powtarzalnym preparatom całego mózgu i plastrów, dostarczając mierzalnych wyników elektrofizjologicznych do przesiewania związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych, takich jak amplitudy prądu i latencja, co ułatwia porównywanie różnych warunków doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Odnosi się do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie właściwości obwodów istotnych dla danej choroby w obrębie preparatów, co wspiera dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę elektrofizjologiczną, którą można dostosować do wielu kontekstów eksperymentalnych, co ogranicza redundantne opracowywanie metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniej rejestracji neuronalnej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację między laboratoriami dzięki zdefiniowanym protokołom przygotowawczym dla metod in vivo, całego mózgu oraz metod z wykorzystaniem skrawków tkankowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrycie nieskutecznych związków, co redukuje inwestycje w nieopłacalne cele.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko poprzez powiązanie wyników elektrofizjologicznych z funkcją na poziomie obwodów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii i technik mikrochirurgicznej dyssekcji w celu uzyskania powtarzalnych preparatów mózgu.
- Zależność od stabilnych roztworów do rejestracji pozakomórkowej oraz sprawnego sprzętu do stymulacji w celu uzyskania wiarygodnych odpowiedzi wywołanych.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów stymulacji i ustawień rejestracji między zespołami, aby zapewnić porównywalność danych.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych może wymagać dostosowania metod dyssekcji i wysiewania w zależności od wielkości i dostępności mózgu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność sukcesu od operatora oraz stabilność preparatu podczas przedłużających się sesji rejestracyjnych.
