Name: Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Poznaj metodę całokomórkowej rejestracji klamrowej neuronów tektalnych Xenopus laevis. Technika ta pozwala badać wzorce łączności nerwowej podczas rozwoju układu wzrokowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez grant NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Wyoming. Wszystkie zabiegi, w tym zapisy elektrofizjologiczne, przeprowadzane są w temperaturze pokojowej, około 23 °C. Wszystkie opisane tutaj metody są zoptymalizowane pod kątem rejestrowania neuronów tektalnych z kijanek między stadium rozwojowym 42 a 49 (etapy według Neiuwkoopa i Faber15).
1. Przygotowanie In Vivo
<ol>
	<li>Znieczul kijankę.
	<ol>
		<li>Umieść kijankę na małej szalce Petriego zawierającej roztwór Steinberga z 0,01% MS-222 na około 5 minut. 
		UWAGA: MS-222 aka "Tricaine" jest powszechnym środkiem znieczulającym dla ryb i. Kijanki są hodowane w roztworze Steinberga w mM: 0,067 KCl, 0,034 Ca(NO3)2•4H2O, 0,083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.</li>
		<li>Upewnij się, że kijanka jest głęboko znieczulona (nie reaguje i nie przestaje pływać) przed przejściem do kroku 2. Upewnij się, że kijanka jest głęboko znieczulona (nie reaguje i nie pływa</li>).
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj znieczuloną kijankę do zanurzonego silikonowego bloku na podłodze naczynia do sekcji/nagrywania.
	<ol>
		<li>Za pomocą jednorazowej pipety transferowej przenieś znieczuloną kijankę do naczynia preparacyjnego/rejestrującego zawierającego zewnętrzny roztwór rejestrujący (115 mM NaCl, 2 mM KCl, 3 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM glukozy; dostosuj pH do 7,25 za pomocą 10 N NaOH, osmolarność 255 mOsm).
		<ol>
			<li>Aby zminimalizować spontaniczne drgania mięśni, dodaj bloker receptora acetylocholiny, tubokurarynę (100 μM) do roztworu zewnętrznego. (Zazwyczaj odbywa się to za pomocą pipety o pojemności 200 μl, aby dodać 100 μl 10 ml bulionu tubocuraryny o pojemności 10 ml do 10 ml roztworu zewnętrznego).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Za pomocą szpilek przeciw owadom przymocuj kijankę, grzbietem do góry, do zanurzonego bloku elastomeru silikonowego (takiego jak Sylgard 184, szczegóły w Tabeli Materiałów), który został przyklejony do podłogi naczynia sekparacyjnego. 
		Uwaga: Rozmieszczenie szpilek ma kluczowe znaczenie: umieść je po obu stronach mózgu, wystarczająco ogonowo, aby uniknąć przebicia aferentnych aksonów RGC, które wystają z oka i wchodzą do mózgu tuż przed tektum wzrokowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zafiletuj mózg wzdłuż linii środkowej.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać wyraźny widok mózgu, usuń skórę pokrywającą mózg, wykonując powierzchowne nacięcie wzdłuż linii środkowej za pomocą sterylnej igły 25-G.</li>
		<li>Zaokrąglij mózg wzdłuż tej samej osi linii środkowej, wkładając igłę do cewy nerwowej i delikatnie pociągając w górę (grzbietowo), tak aby grzbietowa część rurki została czysto przecięta (odcięta), pozostawiając nienaruszoną płytę podłogową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
		UWAGA: Ważne jest, aby płyta podłogowa cewy nerwowej pozostała nienaruszona, ponieważ aferentne bodźce sensoryczne dostają się do tectum przez płytę podłogową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń przezroczystą błonę komorową, która pokrywa neurony tektalne.
	<ol>
		<li>Przenieś naczynie nagrywające na stanowisko do elektrofizjologii i użyj potłuczonej szklanej końcówki pipety, aby usunąć błonę komorową pokrywającą tektalne ciała komórek neuronów. Złam końcówkę, delikatnie przeciągając ją po delikatnej wycieraczce roboczej.</li>
		<li>Wkręć pipetę w uchwyt pipety i opuść ją do osłony optycznej za pomocą mikromanipulatora.</li>
		<li>Użyj złamanej pipety, aby oderwać błonę komorową od tectum. 
		UWAGA: Nie jest konieczne usuwanie membrany z całego tectum; Wystarczy małe okienko, które zapewni dostęp do wielu neuronów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj nagrania z całego zacisku łaty komórkowej. 
	UWAGA: Podejście od tego momentu jest podobne do przeprowadzania nagrań całych komórek z wycinków mózgu myszy, jak opisano w Segev i wsp.16(Rysunek 1C).</li>
	<li>Rejestruj reakcje neuronów tektalnych na cały błysk światła rzucany na siatkówkę.
	<ol>
		<li>Aby rzutować całe pole światła na siatkówkę, umieść światłowód w pobliżu oka kijanki. Na drugim końcu światłowodu znajduje się dioda LED w linii z rezystorem zmiennym, który pozwala na kontrolowanie luminancji światła. Wyzwalaj diodę LED przez wyjście cyfrowe amplifier. W ten sposób można rejestrować rozbłyski całego pola o różnym natężeniu światła (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie całego mózgu
<ol>
	<li>Wykonaj kroki od 1.1 do 1.3. 
	Uwaga: Nie ma potrzeby stosowania tubokuraryny w roztworze zewnętrznym do tego preparatu.</li>
	<li>Odizoluj mózg.
	<ol>
		<li>Użyj igły 25-G, aby przeciąć tyłomózgowie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Aby odizolować cały mózg od kijanki, delikatnie przeciągnij igłę pod mózgiem, w kierunku ogonowo-rostralnym, aby przeciąć całą boczną i brzuszną tkankę łączną oraz włókna nerwowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj mózg do bloku elastomeru silikonowego.
	<ol>
		<li>Po całkowitym uwolnieniu przymocuj mózg do bloku elastomeru krzemowego, umieszczając jedną szpilkę przez jedną z opuszki węchowych, a drugą szpilkę przez tyłomózgowie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). Jest to optymalna konfiguracja do nagrywania z neuronów tektalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś naczynie zawierające przypięty preparat całego mózgu z lunety prosektoryjnej do stanowiska do elektrofizjologii. Usunąć błonę komorową za pomocą pipety z potłuczonego szkła, jak opisano w kroku 1.4.</li>
	<li>Umieść bipolarną elektrodę stymulującą na skrzyżowaniu wzrokowym (gdzie akson przechodzi od każdego oka krzyżującego się w śródmózgowiu), aby bezpośrednio aktywować aksony RGC.
	<ol>
		<li>Umieść bipolarną elektrodę stymulującą rostral i prawie przylegającą do dużej środkowej komory. Skrzyżowanie wzrokowe znajduje się bezpośrednio rostralnie do dużej środkowej komory (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).
		<ol>
			<li>Delikatnie opuść elektrodę stymulującą w dół na skrzyżowanie optyczne, tak aby w tkance powstało małe wgniecenie. Elektroda bipolarna napędzana jest stymulatorem impulsów, który pozwala na precyzyjną kontrolę siły stymulacji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj zapis całego zacisku łaty komórkowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C) zgodnie z opisem Segev i wsp.16</li>
</ol>
3. Poziome przygotowanie wycinka mózgu
<ol>
	<li>Wykonaj kroki od 2.1 do 2.3.</li>
	<li>Użyj żyletki, aby wyciąć najbardziej boczną czwartą część (która in vivo odpowiada najbardziej grzbietowej ćwiartce) z jednej strony jednego tektum optycznego. To cięcie jest wykonane równolegle do płaszczyzny rostralno-ogonowej, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 3A.</li>
	<li>Ponownie przypnij mózg do boku elastomeru silikonowego przekrojoną stroną skierowaną do góry (tak, aby somata i neuropil były bezpośrednio dostępne do nagrywania) i powierzchni komorowej mózgu skierowanej od bloku elastomeru silikonowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B) (tak, aby można było umieścić elektrodę bipolarną na skrzyżowaniu wzrokowym).</li>
	<li>Wykonaj zapis całego zacisku łaty komórkowej lub lokalnego potencjału pola (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C) zgodnie z opisem Segev i wsp.16</li>
</ol>

<ol><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).</li>
<li>Pratt, K. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40139-015-0075-1">Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole.</a> Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).</li>
<li>Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+function+of+the+Xenopus+tadpole+retinotectal+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).</li>
<li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+regulation+of+voltage-gated+intrinsic+currents+in+the+developing+optic+tectum+of+the+Xenopus+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole.</a> J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).</li>
<li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+transmission+in+a+developing+visual+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit.</a> J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).</li>
<li>Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+analysis+of+electrophysiological+diversity+of+Xenopus+visual+neurons+during+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity.</a> Elife. 4, 11351(2015).</li>
<li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li>
<li>Wu, G., Malinow, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8875937">Cline H.T. of a central glutamatergic synapse.</a> Science. , 972-976 (1996).</li>
<li>Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory-evoked+spiking+behavior+emerges+via+an+experience-dependent+plasticity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism.</a> Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).</li>
<li>Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transcription+of+BDNF+enhances+visual+acuity+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development.</a> Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).</li>
<li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705(2008).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+avoidance+in+Xenopus+tadpoles+is+correlated+with+the+maturation+of+visual+responses+in+the+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum.</a> J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+horizontal+brain+slice+preparation%3A+a+novel+approach+for+visualizing+and+recording+from+all+layers+of+the+tadpole+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum.</a> J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland. New York. (1994).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).</li>
<li>Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Relationships+Impact+Neuronal+Tuning+within+a+Phylogenetically+Ancient+Vertebrate+Brain+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure.</a> Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).</li>
<li>Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+and+inhibition+in+recurrent+networks+mediate+collision+avoidance+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles.</a> Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).</li>
<li>Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+see%3A+patterned+visual+activity+and+the+development+of+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function.</a> Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).</li>
<li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+integration+in+mesencephalic+trigeminal+neurons+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles.</a> J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wszystkie metody opisane w tej pracy są zoptymalizowane pod kątem rejestrowania neuronów tektalnych z kijanek między stadium rozwojowym 42 a 49 (według Neiuwkoopa i Fabera15). Na etapie 42 kijanki są wystarczająco duże i wystarczająco rozwinięte, aby szpilki owadów można było umieścić po obu stronach mózgu w celu nagrań in vivo i przeprowadzenia całej sekcji mózgu. Na wcześniejszych etapach, gdy kijanki są zasadniczo dwuwymiarowe (tj. płaskie), opisane tutaj podejścia nie są opty...

Obwód siatkówki jest głównym składnikiem układu wzrokowego. Składa się z RGC w oku, które rzutują swoje aksony do tektum wzrokowego, gdzie tworzą połączenia synaptyczne z postsynaptycznymi neuronami tektalnymi. Obwód siatkówki kijanki Xenopus jest popularnym modelem rozwojowym do badania tworzenia i funkcjonowania obwodów nerwowych. Istnieje wiele atrybutów obwodu siatkówkowego tej kijanki, które czynią z niej potężny model eksperymentalny1,2,3. Jedną z głównych cech, na której skupia się ten artykuł, jest możliwość przeprowadzania nagrań klamer całych komórek z neuronów tektalnych, in vivo lub przy użyciu preparatu całego mózgu. Dzięki sprzętowi do elektrofizjologii wyposażonemu we wzmacniacz, który obsługuje tryby nagrywania cęgów napięcia i prądu, zapisy z użyciem cęgów krosowych całych komórek pozwalają na scharakteryzowanie elektrofizjologii neuronu w wysokiej rozdzielczości. W rezultacie, zapisy klamer całych komórek z neuronów tektalnych na kluczowych etapach tworzenia obwodu siatkówkowego dostarczyły szczegółowego i wszechstronnego zrozumienia rozwoju i plastyczności intrinsic4,5,6,7 i synaptic8,9,10,11 właściwości. Połączenie zapisów neuronów tektalnych z klamrą całej komórki, zdolności do ekspresji genów lub morfolin będących przedmiotem zainteresowania w tych neuronach12, oraz metody oceny zachowania kierowanego wzrokowo za pomocą ustalonego testu unikania wzrokowego13 promuje identyfikację powiązań między cząsteczkami, funkcją obwodu i zachowaniem.
Ważne jest, aby zauważyć, że rodzaj danych o wysokiej rozdzielczości uzyskanych z nagrań z klamrami całych komórek nie jest możliwy przy użyciu nowszych metod obrazowania, takich jak genetyczny wskaźnik wapnia GCaMP6, ponieważ chociaż użycie wskaźników wapnia pozwala na obrazowanie dynamiki wapnia w dużych populacjach neuronów jednocześnie, nie ma bezpośredniego ani oczywistego sposobu, aby uzyskać określone parametry elektryczne poprzez pomiar fluorescencji delta w somatach, I nie ma sposobu, aby napięcie clampować neuron w celu zmierzenia zależności prąd-napięcie. Wyraźnie widać, że te dwa odrębne podejścia, zapisy elektrofizjologiczne i obrazowanie wapnia, mają nienakładające się na siebie mocne strony i generują różne rodzaje danych. W związku z tym najlepsze podejście zależy od konkretnego pytania eksperymentalnego, które jest poruszane.
Tutaj opisujemy naszą metodę pozyskiwania nagrań klamr z całych komórek z neuronów tektum wzrokowego kijanki za pomocą preparatu in vivo, preparatu całego mózgu oraz nowszego zmodyfikowanego preparatu całego mózgu, który został opracowany w naszym laboratorium<klasa sup="xref">14. W sekcji Reprezentatywne wyniki pokazujemy eksperymentalne zalety każdego preparatu oraz różne rodzaje danych, które można uzyskać. Ograniczenia i mocne strony różnych preparatów, a także wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów znajdują się w sekcji Dyskusja.

<table><tbody><tr><td>Stemi Stereo 508</td><td>Zeiss</td><td>495009-0006-000&nbsp;</td><td>Mikroskop preparacyjny</td></tr><tr><td>MS-222 "Tricane"</td><td>Finquel</td><td>ARF5G</td><td>znieczulenie ogólne</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Służy do przygotowania roztworu Stienberga i roztworu zewnętrznego</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Służy do przygotowania roztworu Stienberga i roztworu zewnętrznego</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td>Służy do przygotowania roztworu Stienberga i roztworu zewnętrznego</td></tr><tr><td>Tetrahyran azotanu wapnia (Ca(NO3)&bull; 4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124-500G</td><td>Służy do przygotowania roztworu Stienberga&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Służy do przygotowania roztworu Steinberga</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>Służy do przygotowania zewnętrznego roztworu rejestrującego</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-01</td><td>Służy do przygotowania zewnętrznego roztworu do nagrywania</td></tr><tr><td>D-glukoza bezwodna</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Służy do przygotowania zewnętrznego roztworu rejestrującego</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tubokuraryny pentahydrat</td><td>Sigma</td><td>T2379</td><td>Nikotynowy antagonista receptora acetylocholiny</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów Fine</td><td>Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Szpilki ze stali nierdzewnej o średnicy 0,1 mm</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>761028</td><td>Zestaw wstępnie zważonych monomerów i utwardzaczy</td></tr><tr><td>Sterylna polistyrenowa szalka Petriego - 60x15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4052</td><td>Małe szalki Petriego</td></tr><tr><td>Igła PrecisionGlide 25Gx5/8 (.0,5mm X 16mm)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Igły do strzykawek</td></tr><tr><td>1mL Strzykawka tuberkulinowa z końcówką ślizgową&nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Jednorazowe, sterylne strzykawki</td></tr><tr><td>Szkło do pipet borokrzemianowych</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10HP</td><td>Wyciągnięte do żądanych specyfikacji za pomocą maszyny do ciągnięcia pipet</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet płonących/brązowych Sutter</td><td>Instruments</td><td>P-97</td><td>Produkuje mikropipety do zapisu elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes</td><td>Kimtech Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>Delicate Zadaniowe niestrzępiące się wycieraczki</td></tr><tr><td>Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>1-CV-7B</td><td>Cęgi prądowe i zaciski napięciowe Headstage</td></tr><tr><td>MP-285 Manipulator z napędem z kontrolerem</td> stołowym <td>Sutter Instrument</td><td>MP-285/T</td><td>Sterowanie do headstage na stanowisku elektrofizjologicznym</td></tr><tr><td>Dioda LED sprzężona światłowodem (zielona)</td><td>Thorlabs</td><td>M530F2</td><td>światłowodowy w połączeniu z zieloną diodą LED</td></tr><tr><td>Klasterowa elektroda bipolarna (25&micro; średnica m)</td><td>FHC</td><td>30207</td><td>Bipolarna elektroda stymulująca</td></tr><tr><td>ISO-Flex Stymulator</td><td>A.M.P.I. (Izrael)&nbsp;</td><td>Skontaktuj się z producentem</td><td>Elastyczny izolator bodźców</td></tr><tr><td>Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Wzmacniacz do nagrywania cęgów napięciowych i prądowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1322A digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-135</td><td>System akwizycji danych do rejestracji elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Axio Examiner.A1</td><td>Zeiss</td><td>491404-0001-000&nbsp;</td><td>Mikroskop do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Stół laboratoryjny Micro-G</td><td>TMC</td><td>63-533</td><td>Stół powietrzny do mikroskopu elektrofizjologicznego</td></tr><tr><td>Komputer stacjonarny Inspiron 620 z 64-bitowym systemem Windows 7 Komputer</td><td>Dell</td><td>D06D001</td><td>z oprogramowaniem do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Kamera CCD c2400</td><td>Hamamatsu</td><td>70826-5</td><td>Kamera ze sprzężeniem ładunkowym do obrazowania elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Żyletki ze stali nierdzewnej na godzinie 7 O'Clock Super Platinum</td><td>Gillette</td><td>CMM01049</td><td>Ostrza do golenia ze stali nierdzewnej pokrytej platyną</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Jednorazowe pipety transferowe z polietylenu</td></tr></tbody></table>

preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych xenopus laevis

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Obwód siatkówki kijanki Xenopus, składający się z komórek zwojowych siatkówki (RGC) w oku, które tworzą synapsy bezpośrednio na neuronach w tektum wzrokowym, jest popularnym modelem do badania, jak obwody neuronowe same się organizują. Możliwość prowadzenia nagrań całych komórek z neuronów tektalnych i rejestrowania reakcji wywołanych przez RGC, zarówno in vivo, jak i przy użyciu preparatu dla całego mózgu, wygenerowała dużą ilość danych o wysokiej rozdzielczości na temat mechanizmów leżących u podstaw normalnego i nieprawidłowego tworzenia i funkcjonowania obwodów. Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić przygotowanie in vivo, oryginalne przygotowanie całego mózgu, a ostatnio opracowane poziome przygotowanie wycinków mózgu w celu uzyskania nagrań klamrowych całych komórek z neuronów tektalnych. Każdy preparat ma unikalne zalety eksperymentalne. Preparat in vivo umożliwia rejestrację bezpośredniej odpowiedzi neuronów tektalnych na bodźce wzrokowe rzutowane na oko. Przygotowanie całego mózgu pozwala na aktywację aksonów RGC w wysoce kontrolowany sposób, a poziome przygotowanie wycinków mózgu umożliwia rejestrację ze wszystkich warstw tectum.

Aby zarejestrować odpowiedzi wywołane światłem, na siatkówkę rzuca się błysk światła na całe pole, podczas gdy wynikową odpowiedź rejestruje się z poszczególnych neuronów tekta (Rycina 4A). Ten konkretny protokół został opracowany w celu zmierzenia zarówno odpowiedzi neuronu na włączenie światła (odpowiedź „On”), jak i na jego wyłączenie 15 s później, aby zmierzyć odpowiedź „Off”. Neurony tekta zazwyczaj wykazują silne odpowiedzi On i Off (pr...

W tym artykule omawiamy trzy preparaty mózgowe używane do rejestracji klamer z całych komórek w celu zbadania obwodu siatkówkowego kijanek Xenopus laevis. Każdy preparat, z własnymi specyficznymi zaletami, przyczynia się do eksperymentalnej wykonalności kijanki Xenopus jako modelu do badania funkcji obwodów neuronalnych.

Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie zapisów elektrofizjologicznych całej komórki z neuronów tektum nerwu wzrokowego kijanki, aby poznać ich wzorzec połączeń podczas rozwoju i ostatecznie zrozumieć, jak powstają i funkcjonują obwody nerwowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju neuronalnego, takie jak to, w jaki sposób neurony zmieniają się w trakcie rozwoju i jak funkcjonują obwody, które powodują zachowanie. Główną zaletą tych preparatów jest to, że pozwalają na elektrofizjologiczny zapis neuronów tektum wzrokowego, aby zapewnić wgląd w funkcję rozwijających się obwodów neuronalnych.Procedurę zademonstruje Zhenyu Lui, doktorant w moim laboratorium. Za pomocą pipety do usuwania zanieczyszczeń przenieś znieczuloną kijankę do naczynia rejestrującego sekcję zawierającą zewnętrzny roztwór do nagrywania. Przymocuj znieczuloną kijankę do zanurzonego silikonowego bloku na podłodze naczynia do nagrywania sekcji.Aby uzyskać wyraźny widok mózgu, usuń skórę pokrywającą mózg, wykonując powierzchowne nacięcie wzdłuż linii środkowej za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 25. Wyfiletuj mózg wzdłuż tej samej osi linii środkowej, wkładając igłę do cewy nerwowej i delikatnie pociągając w górę, tak aby grzbietowa część rurki została czysto przecięta, pozostawiając nienaruszoną płytkę podłogową. Aby wyizolować mózg, najpierw użyj igły o rozmiarze 25, aby przeciąć tyłomózgowie.Następnie delikatnie przesuń igłę pod mózgiem w kierunku ogonowym do rostralnego, aby przeciąć całą boczną i brzuszną tkankę łączną oraz włókna nerwowe. Następnie przymocuj mózg do bloku elastomeru silikonowego, umieszczając jedną szpilkę przez jedną z opuszki węchowych, a drugą szpilkę przez tyłomózgowie. Jest to optymalna konfiguracja do nagrywania z neuronów tektalnych.Następnie przenieś naczynie zawierające przypięty preparat całego mózgu z lunety prosektoryjnej do stanowiska do elektrofizjologii. Usuń błonę komorową za pomocą pipety z potłuczonego szkła. Aby bezpośrednio aktywować aksony RGC, delikatnie opuść bipolarną elektrodę stymulującą na skrzyżowanie wzrokowe, tak aby powstało małe wgniecenie w tkance.Bipolarna elektroda stymulująca powinna być rostralna i prawie przylegać do dużej środkowej komory, w której znajduje się skrzyżowanie wzrokowe. Elektroda bipolarna napędzana jest stymulatorem impulsów, który pozwala na precyzyjną kontrolę siły stymulacji. Aby przygotować poziomy wycinek mózgu, zacznij od przygotowania całego mózgu.Następnie użyj żyletki, aby wyciąć najbardziej boczną czwartą część jednej strony jednego z boków jednej tarczy optycznej. To cięcie jest wykonane równolegle do rostralnej płaszczyzny ogonowej. Następnie ponownie przypnij mózg do boku elastomeru silikonowego pokrojoną stroną skierowaną do góry, tak aby somata i neuropil były bezpośrednio dostępne w celu zapisu, a powierzchnia komorowa mózgu była skierowana od bloku elastomeru silikonowego, tak aby można było umieścić elektrodę bipolarną na skrzyżowaniu wzrokowym.Następnie wykonaj rejestrację całego zacisku krosowego komórki lub potencjału lokalnego pola. Poniżej znajduje się schemat przedstawiający konfigurację poziomego przygotowania wycinka mózgu. Należy zauważyć, że chociaż elektroda stymulująca pozostaje na skrzyżowaniu wzrokowym, pipeta rejestrująca jest teraz ustawiona tak, aby uzyskać dostęp do komórek we wszystkich warstwach tektalnych odsłoniętych przez poziome przygotowanie wycinka mózgu.Jest to reakcja wywołana przez RGC ze strony neuronu znajdującego się w powierzchownej warstwie tectum. Na tym rysunku zarejestrowane potencjały pola w neuropolu i przekształcone gęstości źródła prądu są pokazane na wykresie obrazu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 10 minut i zwykle trwa to do trzech lub czterech godzin.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać przygotowanie całego mózgu i poziomego wycinka mózgu do nagrań całych komórek w celu ilościowego określenia właściwości elektrycznych neuronów tektalnych i ich połączeń.

preparations-protocols-for-whole-cell-patch-clamp-recording-xenopus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Ten film demonstruje technikę całokomórkowego patch-clamp do elektrofizjologicznego zapisu z płaskiej siatkówki myszy. Cienka szklana pipeta z elektrodą służy do zbliżania się do gwiazdotwórczych komórek amakrynowych (SAC) w siatkówce. Po uformowaniu uszczelki stosuje się ssanie w celu pęknięcia membrany i utworzenia konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. Na koniec mierzy się przepływ jonów przez receptory synaptyczne SAC za pomocą konfiguracji.

Ustanawianie opaski krosowej całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z siatkówki myszy z płaskim mocowaniem

Film demonstruje metodę badania pobudliwości komórek neuronalnych wyrażających białko fluorescencyjne za pomocą cęgów prądowych dla całych komórek. W trybie cęgowym generowane są potencjały czynnościowe wskazujące na pobudliwość neuronów.

Badanie pobudliwości neuronów fluorescencyjnych za pomocą klamry krosowej dla całych komórek

Ten film demonstruje procedurę wykonywania zapisów elektrofizjologicznych w neuronach istoty żelowej (SG) wycinków rdzenia kręgowego, przy użyciu technik całokomórkowych kropek do analizy wzorców uruchamiania neuronów. Metoda ta pozwala na badanie reakcji neuronalnych na bodźce w neuronach SG rdzenia kręgowego.

Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Ten film demonstruje badanie pobudliwości neuronów czuciowych w zwojach korzenia grzbietowego za pomocą techniki zacisku łatkowego do pomiaru potencjału reozasady i błony, analizując reakcje neuronów na przyrostowe wstrzyknięcia prądu.

Nagrania klamry krosowej całej komórki na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Prezentujemy protokół, który łączy izolację komórek i zapis z użyciem całego patch-clampu komórkowego w celu zmierzenia właściwości elektrycznych pierwotnych zdysocjowanych komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura. Protokół ten pozwala na badanie właściwości funkcjonalnych pierwotnych komórek nabłonka najądrza w celu dalszego wyjaśnienia fizjologicznej roli najądrza.

Nagrania całokomórkowe patch-clamp izolowanych pierwotnych komórek nabłonka z najądrza

Poznaj metodę całokomórkowej rejestracji klamrowej neuronów tektalnych Xenopus laevis. Technika ta pozwala badać wzorce łączności nerwowej podczas rozwoju układu wzrokowego.

Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów