Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie zapisów elektrofizjologicznych całej komórki z neuronów tektum nerwu wzrokowego kijanki, aby poznać ich wzorzec połączeń podczas rozwoju i ostatecznie zrozumieć, jak powstają i funkcjonują obwody nerwowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju neuronalnego, takie jak to, w jaki sposób neurony zmieniają się w trakcie rozwoju i jak funkcjonują obwody, które powodują zachowanie. Główną zaletą tych preparatów jest to, że pozwalają na elektrofizjologiczny zapis neuronów tektum wzrokowego, aby zapewnić wgląd w funkcję rozwijających się obwodów neuronalnych.

Procedurę zademonstruje Zhenyu Lui, doktorant w moim laboratorium. Za pomocą pipety do usuwania zanieczyszczeń przenieś znieczuloną kijankę do naczynia rejestrującego sekcję zawierającą zewnętrzny roztwór do nagrywania. Przymocuj znieczuloną kijankę do zanurzonego silikonowego bloku na podłodze naczynia do nagrywania sekcji.

Aby uzyskać wyraźny widok mózgu, usuń skórę pokrywającą mózg, wykonując powierzchowne nacięcie wzdłuż linii środkowej za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 25. Wyfiletuj mózg wzdłuż tej samej osi linii środkowej, wkładając igłę do cewy nerwowej i delikatnie pociągając w górę, tak aby grzbietowa część rurki została czysto przecięta, pozostawiając nienaruszoną płytkę podłogową. Aby wyizolować mózg, najpierw użyj igły o rozmiarze 25, aby przeciąć tyłomózgowie.

Następnie delikatnie przesuń igłę pod mózgiem w kierunku ogonowym do rostralnego, aby przeciąć całą boczną i brzuszną tkankę łączną oraz włókna nerwowe. Następnie przymocuj mózg do bloku elastomeru silikonowego, umieszczając jedną szpilkę przez jedną z opuszki węchowych, a drugą szpilkę przez tyłomózgowie. Jest to optymalna konfiguracja do nagrywania z neuronów tektalnych.

Następnie przenieś naczynie zawierające przypięty preparat całego mózgu z lunety prosektoryjnej do stanowiska do elektrofizjologii. Usuń błonę komorową za pomocą pipety z potłuczonego szkła. Aby bezpośrednio aktywować aksony RGC, delikatnie opuść bipolarną elektrodę stymulującą na skrzyżowanie wzrokowe, tak aby powstało małe wgniecenie w tkance.

Bipolarna elektroda stymulująca powinna być rostralna i prawie przylegać do dużej środkowej komory, w której znajduje się skrzyżowanie wzrokowe. Elektroda bipolarna napędzana jest stymulatorem impulsów, który pozwala na precyzyjną kontrolę siły stymulacji. Aby przygotować poziomy wycinek mózgu, zacznij od przygotowania całego mózgu.

Następnie użyj żyletki, aby wyciąć najbardziej boczną czwartą część jednej strony jednego z boków jednej tarczy optycznej. To cięcie jest wykonane równolegle do rostralnej płaszczyzny ogonowej. Następnie ponownie przypnij mózg do boku elastomeru silikonowego pokrojoną stroną skierowaną do góry, tak aby somata i neuropil były bezpośrednio dostępne w celu zapisu, a powierzchnia komorowa mózgu była skierowana od bloku elastomeru silikonowego, tak aby można było umieścić elektrodę bipolarną na skrzyżowaniu wzrokowym.

Następnie wykonaj rejestrację całego zacisku krosowego komórki lub potencjału lokalnego pola. Poniżej znajduje się schemat przedstawiający konfigurację poziomego przygotowania wycinka mózgu. Należy zauważyć, że chociaż elektroda stymulująca pozostaje na skrzyżowaniu wzrokowym, pipeta rejestrująca jest teraz ustawiona tak, aby uzyskać dostęp do komórek we wszystkich warstwach tektalnych odsłoniętych przez poziome przygotowanie wycinka mózgu.

Jest to reakcja wywołana przez RGC ze strony neuronu znajdującego się w powierzchownej warstwie tectum. Na tym rysunku zarejestrowane potencjały pola w neuropolu i przekształcone gęstości źródła prądu są pokazane na wykresie obrazu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 10 minut i zwykle trwa to do trzech lub czterech godzin.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać przygotowanie całego mózgu i poziomego wycinka mózgu do nagrań całych komórek w celu ilościowego określenia właściwości elektrycznych neuronów tektalnych i ich połączeń.