Jaka jest znaczność białek mitochondriów w neuronach?

Białka mitochondriów są niezbędne do produkcji energii i metabolizmu komórkowego, wpływając na zdrowie i funkcjonowanie neuronów.

Jak działa cytometria przepływowa w tym kontekście?

Cytometria przepływowa analizuje fizyczne i chemiczne cechy komórek poprzez przeprowadzenie ich przez laser i wykrywanie emitowanej fluorescencji.

Jakie są główne wyzwania w oznakowaniu białek mitochondriów?

Wyzwania obejmują zapobieganie niespecyficznemu wiązaniu i zapewnienie odpowiedniej penetracji przeciwciał do błon mitochondrialnych.

Czy tę metodę można zastosować do innych typów komórek?

Tak, protokół można dostosować do różnych typów komórek, które wymagają analizy mitochondriów.

Jakie są zastosowania tego badania?

Zastosowania obejmują badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi, zaburzeniami metabolicznymi i dysfunkcją mitochondriów.

Jak można interpretować wyniki?

Wyniki mogą wskazywać na zdrowie mitochondriów i ich rolę w funkcjonowaniu neuronów i chorobach.

Pomiar wielu parametrów mitochondrialnych w neuronach za pomocą cytometrii przepływowej

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 views • 2:09 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weź utrwalone i przepuszczalne neurony w probówce.

Dodaj bufor blokujący, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych.

Odwirować zawiesinę i usunąć supernatant. Następnie ponownie zawieś neurony w buforze.

Przenieść zawiesinę równomiernie do probówek zawierających nieoznakowane i znakowane fluoroforem przeciwciała pierwszorzędowe.

Inkubacja, pozwalająca przeciwciałom specyficznie wiązać się z mitochondrialnymi łańcuchami oddechowymi lub podjednostkami kompleksu MRC, białkiem związanym z mitochondrialnym DNA i mitochondrialnym białkiem błony zewnętrznej w neuronach.

Usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała.

Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które wiążą się z nieoznakowanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Odwirować mieszaninę i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić neurony w buforze i przenieść je do probówek mikrowirówek.

Wykonaj cytometrię przepływową, aby wykryć sygnały fluorescencyjne na znakowanych neuronach, odpowiadające poziomom ekspresji podjednostek kompleksu MRC i pomiarowi względnych poziomów mitochondrialnego DNA.

Zablokować próbki w 1 mililitrze buforu blokującego i przemyć komórki przez odwirowanie PBS, jak pokazano. Aby wykryć różne kompleksy i podjednostki mitochondrialne, należy inkubować komórki przez 30 minut z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi opisanymi w manuskrypcie. Po jednokrotnym umyciu komórek PBS, inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut.

Pod koniec inkubacji umyć i ponownie zawiesić komórki w PBS, jak pokazano. Przenieś zawiesinę komórkową do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej, przechowywanej w ciemności, na lodzie. Następnie przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym i wykryj sygnały, a następnie przefiltruj jedną za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 530/30.