Why measure mitochondrial respiratory chain subunits for target validation?

Quantifying mitochondrial respiratory chain complex subunits enables assessment of target engagement effects on neuronal energy metabolism, supporting mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs.

How does isolating mitochondrial protein expression as an independent variable support discovery pipelines?

Isolating mitochondrial protein expression allows researchers to link specific targets or compounds to changes in energy metabolism, clarifying biological function in early discovery.

What do quantitative measurements of mitochondrial DNA levels enable in neuronal studies?

Quantitative mitochondrial DNA measurements provide a proxy for mitochondrial content and biogenesis, enabling normalization of functional readouts and assessment of organelle density.

Why are replication requirements important for cross-functional collaboration in mitochondrial profiling?

Replication ensures consistent, reproducible quantification of mitochondrial parameters across teams and sites, supporting reliable data transfer in target validation and assay development.

What statistical analysis capabilities are required before implementing this flow cytometry method?

Implementation requires the ability to analyze mean fluorescence intensity, calculate coefficients of variation, and apply statistical tests to compare mitochondrial protein expression across experimental conditions.

Pomiar wielu parametrów mitochondrialnych w neuronach za pomocą cytometrii przepływowej

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronauka

0 wyświetleń • 2:09 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weź utrwalone i przepuszczalne neurony w probówce.

Dodaj bufor blokujący, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych.

Odwirować zawiesinę i usunąć supernatant. Następnie ponownie zawieś neurony w buforze.

Przenieść zawiesinę równomiernie do probówek zawierających nieoznakowane i znakowane fluoroforem przeciwciała pierwszorzędowe.

Inkubacja, pozwalająca przeciwciałom specyficznie wiązać się z mitochondrialnymi łańcuchami oddechowymi lub podjednostkami kompleksu MRC, białkiem związanym z mitochondrialnym DNA i mitochondrialnym białkiem błony zewnętrznej w neuronach.

Usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała.

Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które wiążą się z nieoznakowanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Odwirować mieszaninę i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić neurony w buforze i przenieść je do probówek mikrowirówek.

Wykonaj cytometrię przepływową, aby wykryć sygnały fluorescencyjne na znakowanych neuronach, odpowiadające poziomom ekspresji podjednostek kompleksu MRC i pomiarowi względnych poziomów mitochondrialnego DNA.

Zablokować próbki w 1 mililitrze buforu blokującego i przemyć komórki przez odwirowanie PBS, jak pokazano. Aby wykryć różne kompleksy i podjednostki mitochondrialne, należy inkubować komórki przez 30 minut z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi opisanymi w manuskrypcie. Po jednokrotnym umyciu komórek PBS, inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut.

Pod koniec inkubacji umyć i ponownie zawiesić komórki w PBS, jak pokazano. Przenieś zawiesinę komórkową do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej, przechowywanej w ciemności, na lodzie. Następnie przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym i wykryj sygnały, a następnie przefiltruj jedną za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 530/30.