JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:09 min. • July 8th, 2025
Weź utrwalone i przepuszczalne neurony w probówce.
Dodaj bufor blokujący, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych.
Odwirować zawiesinę i usunąć supernatant. Następnie ponownie zawieś neurony w buforze.
Przenieść zawiesinę równomiernie do probówek zawierających nieoznakowane i znakowane fluoroforem przeciwciała pierwszorzędowe.
Inkubacja, pozwalająca przeciwciałom specyficznie wiązać się z mitochondrialnymi łańcuchami oddechowymi lub podjednostkami kompleksu MRC, białkiem związanym z mitochondrialnym DNA i mitochondrialnym białkiem błony zewnętrznej w neuronach.
Usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała.
Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które wiążą się z nieoznakowanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi.
Odwirować mieszaninę i wyrzucić supernatant.
Ponownie zawiesić neurony w buforze i przenieść je do probówek mikrowirówek.
Wykonaj cytometrię przepływową, aby wykryć sygnały fluorescencyjne na znakowanych neuronach, odpowiadające poziomom ekspresji podjednostek kompleksu MRC i pomiarowi względnych poziomów mitochondrialnego DNA.
Zablokować próbki w 1 mililitrze buforu blokującego i przemyć komórki przez odwirowanie PBS, jak pokazano. Aby wykryć różne kompleksy i podjednostki mitochondrialne, należy inkubować komórki przez 30 minut z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi opisanymi w manuskrypcie. Po jednokrotnym umyciu komórek PBS, inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut.
Pod koniec inkubacji umyć i ponownie zawiesić komórki w PBS, jak pokazano. Przenieś zawiesinę komórkową do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej, przechowywanej w ciemności, na lodzie. Następnie przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym i wykryj sygnały, a następnie przefiltruj jedną za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 530/30.