Transmisyjne obrazowanie mikroskopowe elektronów endocytozy pęcherzyków synaptycznych w neuronach hipokampa myszy

Zacznij od potraktowania mysich neuronów hipokampa buforem o wysokiej zawartości potasu zawierającym peroksydazę chrzanową lub HRP.

Wysoki poziom potasu depolaryzuje neurony presynaptyczne, wywołując egzocytozę pęcherzyków synaptycznych. Neurony następnie odzyskują błony pęcherzyków synaptycznych poprzez endocytozę, poprzez włączenie HRP do nowo powstałych pęcherzyków. Napraw neurony aldehydem glutarowym i umyj, aby usunąć nadmiar aldehydu glutarowego.

Dodaj nadtlenek wodoru i podłoże chromogenne, które jest utleniane przez HRP, tworząc osady o gęstości elektronów. Umyć, aby usunąć wszelkie nieprzereagowane podłoże.

Potraktuj tetratlenkiem osmu, aby zwiększyć kontrast membrany, a następnie zmyj nadmiar odczynnika. Następnie dodaj octan uranylu, aby zwiększyć kontrast organelli.

Odwodnić neurony za pomocą zwiększenia stężenia etanolu i zanurzyć je w żywicy.

Mikroskopijnie identyfikuj obszary o dużej gęstości komórek i wycinaj je. Następnie przygotuj ultracienkie sekcje.

Przenieś fragment na miedzianą siatkę i zabarwij go środkami kontrastowymi.

Korzystając z transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pęcherzyki zawierające HRP wyglądają jak struktury o dużej gęstości elektronów.

Stymuluj kulturę neuronów hipokampa, dodając 1,5 mililitra roztworu stymulującego o wysokiej zawartości potasu do każdej studzienki w temperaturze pokojowej przez 90 sekund. Na tym etapie należy przygotować 0,1-molowy bufor kakodylanu sodu o pH 7,4. Utrwalić komórki 4% aldehydem glutarowym w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie przemyj komórki trzykrotnie 0,1-molowym buforem kakodylanu sodu za każdym razem przez siedem minut. Następnie przygotuj roztwór DAB i przefiltruj go filtrem 0,22 mikrometra. Następnie nałóż 1,5 mililitra roztworu DAB na komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie przemyj komórki trzykrotnie 0,1-molowym buforem kakodylanu sodu za każdym razem przez siedem minut. Po utrwaleniu inkubuj neurony z 1,5 mililitra 1% tetratlenku osmu w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez jedną godzinę w czterech stopniach Celsjusza.

Następnie przemyj neurony trzy razy 1,5 mililitra 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu za każdym razem przez siedem minut. Następnie należy przygotować 0,1-molowy bufor octanu sodu z octanem sodu i lodowatym kwasem octowym. Przemyj komórki trzykrotnie 1,5 mililitra 0,1-molowego buforu octanowego za każdym razem przez siedem minut.

Następnie inkubuj komórki z 1,5 mililitra 1% octanu uranylu w 0,1 molowym buforze octanowym przez 1 godzinę w czterech stopniach Celsjusza. Następnie umyj komórki trzykrotnie 1,5 mililitra 0,1-molowego buforu octanowego przez siedem minut za każdym razem. W dygestorium odwodnić kulturę neuronalną pojedynczymi 1,5 mililetowymi płukaniami 50%, 70% i 90% etanolu przez siedem minut przy każdym płukaniu, a następnie trzema płukaniami 1,5 mililitra 100% etanolu przez siedem minut za każdym razem.

Następnie utwórz żywicę epoksydową i dokładnie wymieszaj i przechowuj ją w próżni, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Infiltrować próbkę, zastępując etanol 50% żywicą epoksydową w etanolu na wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 70% żywicą epoksydową i etanolem przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.

Zamień roztwór żywicy epoksydowej na 100% żywicę epoksydową i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Wykonaj dwie wymiany świeżej 100% żywicy epoksydowej. Każda wymiana jest inkubowana przez godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Następnie dodaj świeżą 100% żywicę epoksydową i pozwól jej stwardnieć w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez noc, a następnie w 60 stopniach Celsjusza przez ponad 36 godzin.

Następnie usuń każdą próbkę z płytki wielodołkowej za pomocą piły ręcznej jubilera. Za pomocą mikroskopu światła odwróconego wybierz obszary zainteresowania, które mają gęste skupiska komórek. Następnie wytnij bloki o wymiarach 4 na 5 na 8 milimetrów w kostkę do przekrojenia. Następnie przeciwbarwić skrawki przez zanurzenie w 1% wodnym octanie uranylu na 15 minut, a następnie 3% wodnym roztworem cytrynianu ołowiu na 5 minut, aby poprawić kontrast próbek.