Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja morfologii oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i przeprowadzenie specyficznej lokalizacji białka w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w okresie badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, takie jak kategoryzacja egzosomu i specyficznych białek znajdujących się w jego wnętrzu. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do obserwacji porcji określonych białek znajdujących się zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz egzosomu.

Implikacją tej techniki jest zapewnienie diagnozy kilku chorób, w tym raka i infekcji bakteryjnych. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w egzosom, można ją również zastosować do innych próbek biologicznych, inkubacji mikrokomórek i specyficznej lokalizacji białek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą zmagać się z zanieczyszczeniem podczas niespecyficznego wiązania cząsteczki immunozłota.

Korzystając ze standardowych technik, przygotuj egzosomy w kulturze. Następnie należy ultraodwirować supernatant hodowli komórek HCT116 w celu osadzenia egzosomów z pożywki. Po granulowaniu ostrożnie usunąć supernatant hodowli.

Aby utrwalić oczyszczoną osadkę egzosomu, dodaj jeden mililitr 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1-molowym roztworze kakodylanu oldium o pH 7,0. Inkubuj pęcherzyki lipidowej warstwy bocznej przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń utrwalacz i przepłucz granulki jednym mililitrem 0,1-molowego roztworu buforowego kakodylanu sodu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie utrwalić próbki jednym mililitrem 2% tetratlenku osmu przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń utrwalacz i przepłucz osad egzosomu trzykrotnie 0,1-molowym buforem kakodylanu sodu, zmieniając bufor co dziesięć minut. Następnie odwodnić próbkę, potrząsając nią przez 10 minut w serii stopniowanych stężeń acetonu.

Następnie wymieszaj roztwór składający się z trzech części acetonu i jednej części mieszanki do zatapiania o niskiej lepkości. Zastąp aceton tą mieszaniną i inkubuj próbkę przez 30 minut. Kontynuuj zwiększanie stosunku podłoża do zatapiania o niskiej lepkości, inkubując przez 30 minut z każdym krokiem.

Na koniec inkubuj osad egzosomu w 100% mieszaniny do zatapiania o niskiej lepkości przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia zanurz próbkę w czystej mieszance do zatapiania o niskiej lepkości za pomocą formy do zatapiania i piecz przez 24 godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Za pomocą ultramikrotomu przygotuj skrawki o grubości 60 nanometrów.

Umieść skrawki na siatce niklowej i dwukrotnie zabarwij niektóre z nich 2% octanem uranylu przez 20 minut, a następnie cytrynianem ołowiu przez 10 minut. Następnie umieść zabarwiony fragment w transmisyjnym mikroskopie elektronowym i obejrzyj próbkę przy użyciu 80 kilowoltów i postępuj zgodnie z automatycznymi ustawieniami czasu ekspozycji. Mając w zasięgu wzroku obraz egzosomu, uzyskaj i zapisz obraz za pomocą oprogramowania mikroskopu.

Na początek inkubuj siatki zawierające niebarwione sekcje o grubości 60 nanometrów w 50 mikrolitrowych kroplach 0,02 molowej glicyny przez 10 minut, aby ugasić wolne grupy aldehydowe. Następnie opłucz sekcje w 100 mikrolitrach wody destylowanej trzy razy po 10 minut każda. Po ostatnim płukaniu inkubować skrawki przez godzinę w temperaturze pokojowej w PBS zawierającym 1% BSA.

Następnie inkubować siatki w kroplach przeciwciała anty-KRS o pojemności od 50 do 100 mikrolitrów przez godzinę. Następnie umyj kratki pięć razy przez 10 minut każda w kropli PBS zawierającej 0,1% BSA. Następnie przenieś siatki do kropli odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego i inkubuj skrawki przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Teraz umyj kratki pięć razy przez 10 minut, każda z osobną kroplą PBS zawierającą 0,1% BSA. Podwójnie zabarwić skrawki 2% octanem uranylu przez 20 minut w ciemności, a następnie cytrynianem ołowiu Reynoldsa przez 10 minut. Umieść zabarwiony wycinek w transmisyjnym mikroskopie elektronowym i obejrzyj próbkę przy użyciu 80 kilowoltów i zobrazuj je, jak pokazano wcześniej.

Aby przeprowadzić barwienie negatywne, utrwal oczyszczone egzosomy po izolacji jednym mililitrem 2% paraformaldehydu przez pięć minut. Cienkie, pokryte folią węglową, pokryte formvarem/węglowem, miedziane siatki EM o oczkach 200 wyładowań jarzeniowych przez jedną minutę, a następnie załadować od pięciu do siedmiu mikrolitrów roztworu zawiesiny egzosomu na siatkę i inkubować przez jedną minutę. Jeśli stężenie egzosomu jest zbyt wysokie, rozcieńczyć stężenie do odpowiedniego poziomu.

Natychmiast zabarwić egzosomy około 20 kroplami przefiltrowanego 1% roztworu octanu uranylu na powierzchni siatki EM. Usuń nadmiar roztworu octanu uranylu z siatki, stykając krawędź kratki z bibułą filtracyjną, a następnie szybko spłucz siatkę kroplą wody. Użyj pęsety, aby umieścić siatkę na stole i częściowo przykryj siatkę naczyniem hodowlanym.

Pozostaw siatkę do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zobrazuj siatkę lub przechowuj ją w pudełku z siatką mikroskopu elektronowego do przyszłych obserwacji. Zacznij od potraktowania cienkich siatek miedzianych EM pokrytych folią węglową o oczkach 200 wyładowań jarzeniowych przez 30 sekund. Następnie załaduj pięć do siedmiu mikrolitrów egzosomów utrwalonych w 2% roztworze paraformaldehydu na siatkę i inkubuj je tam przez pięć minut.

Następnie spłucz egzosomy 100 mikrolitrami PBS, trzy razy każdy przez 10 minut. Potraktuj siatki zawierające egzosom 50 mikrolitrami 0,5 molowego roztworu glicyny przez 10 minut, aby ugasić wolne grupy aldehydowe. Następnie przenieś siatki do kropli PBS zawierającej 1% BSA i blokuj przez 30 minut.

Teraz inkubuj siatki z 50 do 100 mikrolitrami przeciwciała anty-PD-L1 przez godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyć siatkę pięcioma oddzielnymi kroplami PBS zawierającymi 0,1% BSA przez 10 minut każda, a następnie przenieść siatkę do kropli przeciwciała drugorzędowego na jedną godzinę. Następnie umyj siatkę pięcioma oddzielnymi kroplami PBS zawierającymi 0,1% BSA przez 10 minut każda, a następnie umyj siatkę dwiema oddzielnymi kroplami wody destylowanej.

Po zakończeniu wykonaj barwienie ujemne octanem 2% uranylu, jak pokazano wcześniej, i zobrazuj próbki lub przechowuj je w siatce EM do przyszłych obserwacji. Zaobserwowana tutaj morfologia egzosomów jest produktem barwienia ujemnego. Te egzosomy wykazują typową morfologię w kształcie miseczki, która jest artefaktem, który może wystąpić podczas procesu suszenia.

Dodatkowe informacje można uzyskać za pomocą barwienia immunogold na całej górze, takich jak lokalizacja określonych białek w egzosomie. Tutaj białe strzałki wskazują lokalizację PD-L1. Na przekrojonych obrazach pęcherzyki wykazywały strukturę światła, która jest znana jako cecha strukturalna egzosomów.

One również mogą być barwione immunozłotem w celu identyfikacji określonych białek w egzosomach. Po opanowaniu, technikę barwienia immunogold można przeprowadzić w komórkach włóknistych po prostym przygotowaniu i pocięciu, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można zastosować inną metodę, taką jak podwójne barwienie immunologiczne, aby jednocześnie zidentyfikować lokalizację dwóch różnych białek.

Po każdym rozwoju technika ta może być stosowana w dziedzinie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do badania diagnoz chorób w biopsjach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować określoną lokalizację białka w egzosomie. Nie zapominaj, że pracują z roztworami utrwalającymi, takimi jak chlorhydrat, paraformaldehyd i tetratlenek osmu, które mogą być bardzo niewyraźne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak wentylowany wyciąg i rękawice lateksowe.