Name: Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Poznaj metody transmisyjnej mikroskopii elektronowej do obrazowania morfologii egzosomów i lokalizacji białek. Technika ta umożliwia szczegółową analizę struktury pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i ma zastosowanie w diagnostyce chorób, w tym nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Program Rozwoju Bio i Technologii Medycznych Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) i finansowane przez rząd koreański (MSIP&MOHW) (nr 2016M3A9B6904244). Dziękujemy również członkom Centrum Badań Biokonwergencji Medycznej za oczyszczenie egzosomu.

1. Przygotowanie bloku, sekcjonowanie, barwienie i obrazowanie egzosomów
<ol>
	<li>Osad z egzosomów z supernatantu hodowli komórek HCT116 należy uzyskać poprzez wirowanie przy 100,000 x g przez 1,5 h23. Usunąć supernatant hodowli i ostrożnie utrwalić oczyszczony osad egzosomów w 1 mL 2,5% glutaraldehydu w 0,1 M roztworze kodylanu sodu (pH 7,0) przez 1 h w temperaturze 4 °C. Aby przygotować 0,1 M kodylan sodu, rozpuścić 4,28 g kwasu kodylanowego w 160 mL wody destylowanej (DW). Dostosować pH do 7,4 za pomocą 0,1 M HCl, a następnie dopełnić wodą destylowaną do objętości 200 mL.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i przemyć osady 1 mL 0,1 M buforu kodylanu sodu w temperaturze pokojowej. Powtórzyć czynność trzykrotnie, przy czym każda wymiana buforu powinna trwać 10 min.</li>
	<li>Przystąpić do utrwalania wtórnego próbek w 1 mL 2% czetrotlenku osmu przez 1 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i przemyć trzykrotnie 0,1 M buforem kodylanu sodu w odstępach 10 min.</li>
	<li>Inkubować przez 10 min w gradacji acetonu (odpowiednio 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%) na wytrząsarce.</li>
	<li>Usunąć aceton i inkubować w roztworze mieszaniny zatapiającej o niskiej lepkości z acetonem w stosunku 3:1 przez 30 min. Osad egzosomów znajduje się w probówce.</li>
	<li>Usunąć medium i dodać medium składające się z mieszaniny zatapiającej o niskiej lepkości z acetonem w stosunku 1:1, a następnie inkubować przez 30 min.</li>
	<li>Usunąć medium i dodać medium składające się z mieszaniny zatapiającej o niskiej lepkości z acetonem w stosunku 1:3, a następnie inkubować przez 30 min.</li>
	<li>Usunąć medium i dodać 100% mieszaniny zatapiającej o niskiej lepkości, a następnie inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zatopić próbkę w czystej mieszaninie zatapiającej o niskiej lepkości przy użyciu formy do zatapiania i polimeryzować przez 24 h w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Przygotować skrawki o grubości 60 nm za pomocą ultramikrotomu.</li>
	<li>Przeprowadzić podwójne barwienie 2% octanem uranylu przez 20 min oraz cytrynianem ołowia przez 10 min. 
	Aby przygotować roztwór ołowia według metody Reynoldsa, dodać 1,33 g azotanu ołowiu i 1,76 g cytrynianu sodu do łącznie 50 mL wody destylowanej.</li>
	<li>Obserwować siatkę pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy 80 kV.</li>
	<li>Kliknąć „Acquire”, a następnie wybrać „File” i „Save as” w systemie kamery CCD pod mikroskopem elektronowym przy 80 kV. Zastosować automatyczne ustawienia czasu ekspozycji.</li>
</ol>
2. Immunobarwienie przekrojów i obrazowanie (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Wyciąć ultrascienkie sekcje o grubości 60 nm za pomocą ultramikrotomu i zebrać je na siatce niklowej.</li>
	<li>Inkubować siatki w 50 µL kilka kropli 0,02 M glicyny przez 10 min w celu zablokowania wolnych grup aldehydowych.</li>
	<li>Płukać w 100 μL trzykrotnie w wodzie destylowanej (DW), za każdym razem przez 10 min. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h w buforze PBS zawierającym 1% BSA.</li>
	<li>Inkubować siatki w 50 - 100 µL krople przeciwciała anty-KRS24 (1:100 w buforze PBS zawierającym 0,1% BSA) przez 1 h (W razie potrzeby krok ten należy przeprowadzić w 4 °C na noc.)</li>
	<li>Przemyj siatki pięcioma oddzielnymi kroplami (50 µL) w buforze PBS zawierającym 0,1% BSA przez 10 min każdy.</li>
	<li>Przenieś siatki do kropel 2nd przeciwciała przez 1 h (przeciwciała przeciwko IgG królika sprzężone z cząsteczkami złota 10 nm (1:100) w PBS zawierającym 0,1% BSA).</li>
	<li>Przemyj siatki pięcioma oddzielnymi kroplami (50 µL) w buforze PBS zawierającym 0,1% BSA co 10 min.</li>
	<li>Przeprowadź podwójne barwienie: najpierw 2% octanem uranylu przez 20 min w ciemności, a następnie cytrynianem ołowiu według metody Reynolda przez 10 min.</li>
	<li>Kliknij „Acquire”, a następnie „File” i „Save as” w systemie kamery CCD pod TEM przy 80 kV. Czas ekspozycji ustalono zgodnie z ustawieniami automatycznymi.</li>
</ol>
<img alt="Sekwencyjny proces wykrywania wirusów za pomocą testu immunochemicznego: próbki, chip, analiza, wyświetlanie wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56482/56482fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Proces przygotowania próbek i immunostainingu. (A) Podwójnie utrwalony egzosom zostaje odwodniony i infiltrowany niskolepką żywicą do zatapiania. (B) Zatapianie w żywicy. (C) Wycinanie ultraz cienkich sekcji nożem diamentowym. (D) Układ do znakowania złotem koloidalnym. Siatki z ultracienkimi sekcjami są umieszczane na kropelkach cieczy na parafilmie, który spoczywa na mokrym ręczniku papierowym. Każdą sekcję inkubuje się z kropelkami 50 - 100 µL przeciwciał, a następnie przemywa buforem. (E) Podwójne barwienie octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Pokrywkę przykrywa się folią aluminiową w celu barwienia metalami ciężkimi. (F) Roztwór barwiący jest usuwany za pomocą papieru filtrowanego. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56482/56482fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Barwienie negatywne
<ol>
	<li>Poddać działaniu wyładowań koronowych miedziane siatki EM o oczkach 200, pokryte cienką warstwą formvaru/węgla, przez 1 min przy użyciu urządzenia do glow discharge.</li>
	<li>Utrwalić oczyszczone egzosomy w 1 mL 2% paraformaldehydu (PFA) przez 5 min. 
	Uwaga: Opary paraformaldehydu są toksyczne. Wszystkie prace należy prowadzić w wentylowanej dygestorium.</li>
	<li>Nanieść 5 - 7 µL zawiesiny egzosomów na siatkę i inkubować przez 1 min. Jeśli stężenie egzosomów jest zbyt wysokie, rozcieńczyć je do 1/2 - 1/5.</li>
	<li>Niezwłocznie zabarwić, nanieksując za pomocą strzykawki około 20 kropli przefiltrowanego 1% roztworu octanu uranylu (UA) na powierzchnię siatki EM.</li>
	<li>Usunąć nadmiar roztworu UA z siatki, dotykając jej krawędzi papierem filtracyjnym.</li>
	<li>Szybko wypłukać siatkę kroplą wody. Krok ten usunie nadmiar roztworu barwiącego.</li>
	<li>Położyć siatkę na stole, trzymając ją pęsetą, i częściowo przykryć siatkę szalką Petriego, aby wyschła przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przechowywać siatkę w pudełku na siatki EM do późniejszej obserwacji za pomocą TEM przy 80 kV.</li>
</ol>
4. Całe preparaty do immunobarwienia
<ol>
	<li>Poddaj działaniu wyładowań Glow-discharge miedziane siatki EM o oczku 200, pokryte cienką warstwą formvaru/węgla, przez 30 s.</li>
	<li>Utrwalone oczyszczone egzosomy za pomocą 1 ml 2% Paraformaldehydu (PFA) przez 5 min. 
	Uwaga: Opary paraformaldehydu są toksyczne. Wszystkie prace należy prowadzić w wentylowanej komorze dyfuzyjnej.</li>
	<li>Załaduj 5 - 7 µL naniesionego na siatkę roztworu egzosomów i inkubować przez 5 min. Płukać za pomocą 100 µL buforem PBS trzykrotnie po 10 min każdorazowo.</li>
	<li>poddać siatki działaniu 50 µL 0,05 M glicyny przez 10 min w celu zablokowania wolnych grup aldehydowych.</li>
	<li>Przenieść siatki do kropli buforu blokującego (PBS zawierający 1% BSA) na 30 min.</li>
	<li>Inkubować siatki w 50 - 100 µL przeciwciało anty-PD-L1 (1:100 w PBS zawierającym 0,1% BSA) przez 1 h (jeśli to konieczne, ten etap należy przeprowadzić w 4 °C (przez noc).</li>
	<li>Przemyć siatkę pięcioma oddzielnymi kroplami (50 µL) w PBS zawierającym 0,1% BSA po 10 min każdorazowo.</li>
	<li>Przenieś siatkę do kropli 2nd przeciwciała przez 1 h. Przeciwciała anty-mysie IgG sprzężone z cząsteczkami złota o rozmiarze 9–11 nm, rozcieńczone 1:100 w PBS zawierającym 0,1% BSA.</li>
	<li>Przemyć siatkę pięcioma oddzielnymi kroplami (50 µL) buforu PBS zawierającego 0,1% BSA przez 10 min każdy. Przemyć siatkę dwiema oddzielnymi kroplami (50 µL) wody destylowanej (DW). Przeprowadzić barwienie negatywne 2% octanem uranylu zgodnie z opisem w punktach od 3.4 do 3.8.</li>
	<li>Siatkę należy przechowywać w pudełku na siatki EM do późniejszej obserwacji za pomocą TEM przy napięciu 80 kV.</li>
</ol>

<ol><li>Friend, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+cell+lines+derived+from+a+patient+with+Hodgkin%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease.</a> Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).</li>
<li>Dvorak, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+shedding+and+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tumor shedding and coagulation.</a> Science. 212 (4497), 923-924 (1981).</li>
<li>Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Composition%2C+Biological+Relevance%2C+and+Methods+of+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study.</a> Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).</li>
<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+improved+methods+to+characterize+their+morphology%2C+RNA+content%2C+and+surface+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers.</a> Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. , (2017).</li>
<li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+current+knowledge+of+their+composition%2C+biological+functions%2C+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li>
<li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+it+out%3A+regulation+of+exosome+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Sorting it out: regulation of exosome loading.</a> Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2Fmicrovesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).</li>
<li>Zaharie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-Carried+microRNA-375+Inhibits+Cell+Progression+and+Dissemination+via+Bcl-2+Blocking+in+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastrointestin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer.</a> J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).</li>
<li>Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+-+a+promising+avenue+for+the+detection+and+treatment+of+infectious+diseases%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?</a> Eur J Pharm Biopharm. , (2017).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
<li>Liu, X., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+electron+microscopy+reconstruction+of+the+exosome+complex+using+the+random+conical+tilt+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+exosomes+secreted+from+macrophages+extracted+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods.</a> Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).</li>
<li>Mazzeo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+by+eosinophils%3A+A+possible+role+in+asthma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis.</a> J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).</li>
<li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva%2C+using+correlative+AFM%2C+FESEM%2C+and+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162(2016).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
<li>Kim, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-8+controls+the+secretion+of+inflammatory+lysyl-tRNA+synthetase+in+exosomes+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells.</a> J Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).</li>
<li>Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biologic+characterization+of+exosomes+and+microvesicles+as+facilitators+of+HIV-1+infection+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages.</a> J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).</li>
<li>Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+mediate+cell+contact-independent+ephrin-Eph+signaling+during+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance.</a> J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>van Niel, G., Heyman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+cell+cytoskeleton+and+intracellular+trafficking.+II.+Intestinal+epithelial+cell+exosomes%3A+perspectives+on+their+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono protokół szczegółowej obserwacji struktury egzosomu i znakowania jego specyficznych białek. Barwienie ujemne zostało uznane za najlepszą metodę obrazowania egzosomów17. Ta konwencjonalna technika pokazała strukturę egzosomów w kształcie miseczki. Jednak ten kształt miseczki jest formą artefaktu, który może wystąpić w wyniku procesu suszenia. Wyniki Cryo-TEM wykazały, że egzosomy mają idealnie kulistą strukturę w roztworze wodnym25,26<sup ...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to dwuwarstwowe pęcherzyki lipidowe wydzielane przez komórki, a ich rozmiar waha się od 30 do 300 nm. EV zostały po raz pierwszy zgłoszone w 1978 roku, z dowodami z pęcherzyków pacjentów z chorobą Hodgkina1. Doniesiono, że pęcherzyki te mają wielkość od 40 do 120 nanometrów. W 1980 roku doniesiono, że EV są zaangażowane w układ krzepnięcia i zakrzepicę, tworzenie skrzepu krwi w naczyniu krwionośnym u pacjentów z rakiem2. Po 30 latach stwierdzono, że EV są ważnym czynnikiem sprzyjającym inwazji guza, ucieczce immunologicznej i angiogenezie3. Ponadto badano funkcje EV jako regulatorów interakcji komórkowych w obszarach zapalenia, zaburzeń immunologicznych, chorób neurologicznych i raka4. Ponieważ EV zawierają specyficzne biomolekuły, takie jak białka, mRNA i mikroRNA5, przeanalizowano ich potencjalne zastosowanie w diagnostyce i terapii6,7. EV to kategoria składająca się z podgrup, w tym egzosomów, prostasomów, onkosomów, deksosomów, mikrocząstek, promininosomów, argosomów i pęcherzyków podobnych do egzosomów, w zależności od ich pochodzenia komórkowego i funkcji biologicznej3. Ponadto, na podstawie ich biogenezy, te EV można podzielić na mikropęcherzyki (zrzucane mikropęcherzyki, 100 - 1000 nm) i egzosomy (30 - 300 nm)8,9. Wśród nich egzosom został opisany jako komunikator komórkowy dla odpowiedzi immunologicznej10, cancer11,12, oraz infectious disease13.
Zainteresowanie egzosomami jako biomarkerem do wczesnej diagnozy gwałtownie rośnie, a oczyszczaniu i charakterystyce egzosomów muszą towarzyszyć techniki obrazowania molekularnego. Różne rozmiary i morfologie egzosomów, w zależności od ich pochodzenia i funkcji14, można rozróżnić za pomocą technik mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikroskopia elektronowa. Większość egzosomów została zwizualizowana za pomocą negatywnie wybarwionej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)15,16,17, a wyniki te zostały potwierdzone przez immunoznakowanie specyficznego białka w całym pęcherzyku mount18. Kilka grup badawczych opisało strukturę za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, mikroskopii sił atomowych19,20 i Cryo-TEM21,22. Jednak, chociaż techniki te są przydatne do badania struktury egzosomu, są niewystarczające do obserwacji położenia określonych białek znajdujących się wewnątrz egzosomu. W związku z tym wprowadziliśmy protokół obrazowania egzosomów z etykietowaniem określonego białka. Zastosowaliśmy przygotowanie bloków, ultracienkie sekcje i barwienie immunologiczne w celu ustalenia szczegółowej lokalizacji białka w egzosomie. Porównano to z barwieniem ujemnym i barwieniem immunologicznym całej góry, które jest tradycyjnie stosowane do charakterystyki egzosomu.

<table><tbody><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>EMS</td><td>16200</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu&nbsp;</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Tetroksynek osmu 1 g kryształ</td><td>EMS</td><td>19100</td><td>Stosować tylko w acetonie pod wyciągiem</td></tr><tr><td></td><td>JUNSEI</td><td>1B2031</td><td></td></tr><tr><td>Spurr medium</td><td>TED PELLA</td><td>18108</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-mikrotom</td><td>Leica</td><td>UCT</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>Niebezpieczna substancja chemiczna</td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>Hitachi</td><td>H7600</td><td></td></tr><tr><td>siatka niklowa</td><td>EMS</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Siatka miedziana</td><td>EMS</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>glicyna</td><td>SIGMA</td><td>022K5404</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>SIGMA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Aurion</td><td>25557</td><td></td></tr><tr><td>1.</td> Oczyszczanie przeciwciał <td></td><td></td><td>w trybie ręcznym&nbsp;</td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie CD274 (B7-H1, PD-L1)</td><td>BioLegend</td><td>329710</td><td>Cała góra Immumogold</td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz IgG2b, &kappa; Isotype Ctrl</td><td>BioLegend</td><td>401202</td><td>Całe mocowanie Immumogold (Kontrola)</td></tr><tr><td>2nd Anty-mysia igG sprzężona 9-11 nm cząstka złota</td><td>sigma</td><td>G7652</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>JEOL</td><td>JEM2200FS</td><td></td></tr><tr><td>Wyładowanie jarzeniowe</td><td>JEOL</td><td>JFC1100E</td><td></td></tr><tr><td>Siatka węglowa</td><td>EMS</td><td>121119</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Siatka miedziana powlekana węglem Formvar (200 meh)</td><td>EMS</td><td>FCF200-CU</td><td></td></tr><tr><td>Powlekana węglem Formvar&nbsp; Siatka niklowa (200 oczek)</td><td>EMS</td><td>FCF200-NI</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Egzosomy to nano-rozmiarowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez płyny ustrojowe i znane są z tego, że reprezentują cechy komórek, które je wydzielają. Zawartość i morfologia wydzielanych pęcherzyków odzwierciedla zachowanie komórek lub stan fizjologiczny, na przykład wzrost komórek, migrację, rozszczepienie i śmierć. Rola egzosomów może w dużym stopniu zależeć od wielkości, a wielkość egzosomów waha się od 30 do 300 nm. Najczęściej stosowaną metodą obrazowania egzosomów jest barwienie ujemne, podczas gdy inne wyniki opierają się na kriotransmisyjnej mikroskopii elektronowej, skaningowej mikroskopii elektronowej i mikroskopii sił atomowych. Typowa morfologia egzosomu oceniana za pomocą barwienia ujemnego ma kształt miseczki, ale dalsze szczegóły nie są jeszcze jasne. Egzosom dobrze scharakteryzowany przez badania strukturalne jest niezbędny, szczególnie w dziedzinach medycznych i farmaceutycznych. Dlatego morfologia zależna od funkcji powinna być weryfikowana za pomocą technik mikroskopii elektronowej, takich jak znakowanie określonego białka w szczegółowej strukturze egzosomu. Aby zaobserwować szczegółową strukturę, porównano ultracienkie przekroje i negatywy barwione obrazy egzosomów. W tym protokole sugerujemy transmisyjną mikroskopię elektronową do obrazowania egzosomów, w tym barwienie ujemne, barwienie immunologiczne całej góry, przygotowanie bloku, cienki przekrój i znakowanie immuno-złotem.

Obecnie egzosomy są klasyfikowane pod względem rozmiaru i kształtu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Rysunek 2 przedstawia egzosom barwiony negatywnie oraz egzosom znakowany immunochemicznie w preparacie całego obiektu. Rysunek 3 przedstawia egzosom w przekroju oraz egzosomy znakowane immunochemicznie po wykonaniu cienkich skrawków. Barwienie złotem koloidalnym z użyciem przeciwciał przeciwko specyficznym białkom ...

Ten protokół opisuje różne techniki niezbędne do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w tym barwienie ujemne, ultracienkie sekcje dla szczegółowej struktury i znakowanie immuno-złote w celu określenia pozycji określonych białek w egzosomach.

Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja morfologii oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i przeprowadzenie specyficznej lokalizacji białka w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w okresie badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, takie jak kategoryzacja egzosomu i specyficznych białek znajdujących się w jego wnętrzu. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do obserwacji porcji określonych białek znajdujących się zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz egzosomu.Implikacją tej techniki jest zapewnienie diagnozy kilku chorób, w tym raka i infekcji bakteryjnych. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w egzosom, można ją również zastosować do innych próbek biologicznych, inkubacji mikrokomórek i specyficznej lokalizacji białek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą zmagać się z zanieczyszczeniem podczas niespecyficznego wiązania cząsteczki immunozłota.Korzystając ze standardowych technik, przygotuj egzosomy w kulturze. Następnie należy ultraodwirować supernatant hodowli komórek HCT116 w celu osadzenia egzosomów z pożywki. Po granulowaniu ostrożnie usunąć supernatant hodowli.Aby utrwalić oczyszczoną osadkę egzosomu, dodaj jeden mililitr 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1-molowym roztworze kakodylanu oldium o pH 7,0. Inkubuj pęcherzyki lipidowej warstwy bocznej przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń utrwalacz i przepłucz granulki jednym mililitrem 0,1-molowego roztworu buforowego kakodylanu sodu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie utrwalić próbki jednym mililitrem 2% tetratlenku osmu przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń utrwalacz i przepłucz osad egzosomu trzykrotnie 0,1-molowym buforem kakodylanu sodu, zmieniając bufor co dziesięć minut. Następnie odwodnić próbkę, potrząsając nią przez 10 minut w serii stopniowanych stężeń acetonu.Następnie wymieszaj roztwór składający się z trzech części acetonu i jednej części mieszanki do zatapiania o niskiej lepkości. Zastąp aceton tą mieszaniną i inkubuj próbkę przez 30 minut. Kontynuuj zwiększanie stosunku podłoża do zatapiania o niskiej lepkości, inkubując przez 30 minut z każdym krokiem.Na koniec inkubuj osad egzosomu w 100% mieszaniny do zatapiania o niskiej lepkości przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia zanurz próbkę w czystej mieszance do zatapiania o niskiej lepkości za pomocą formy do zatapiania i piecz przez 24 godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Za pomocą ultramikrotomu przygotuj skrawki o grubości 60 nanometrów.Umieść skrawki na siatce niklowej i dwukrotnie zabarwij niektóre z nich 2% octanem uranylu przez 20 minut, a następnie cytrynianem ołowiu przez 10 minut. Następnie umieść zabarwiony fragment w transmisyjnym mikroskopie elektronowym i obejrzyj próbkę przy użyciu 80 kilowoltów i postępuj zgodnie z automatycznymi ustawieniami czasu ekspozycji. Mając w zasięgu wzroku obraz egzosomu, uzyskaj i zapisz obraz za pomocą oprogramowania mikroskopu.Na początek inkubuj siatki zawierające niebarwione sekcje o grubości 60 nanometrów w 50 mikrolitrowych kroplach 0,02 molowej glicyny przez 10 minut, aby ugasić wolne grupy aldehydowe. Następnie opłucz sekcje w 100 mikrolitrach wody destylowanej trzy razy po 10 minut każda. Po ostatnim płukaniu inkubować skrawki przez godzinę w temperaturze pokojowej w PBS zawierającym 1% BSA.Następnie inkubować siatki w kroplach przeciwciała anty-KRS o pojemności od 50 do 100 mikrolitrów przez godzinę. Następnie umyj kratki pięć razy przez 10 minut każda w kropli PBS zawierającej 0,1% BSA. Następnie przenieś siatki do kropli odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego i inkubuj skrawki przez godzinę w temperaturze pokojowej.Teraz umyj kratki pięć razy przez 10 minut, każda z osobną kroplą PBS zawierającą 0,1% BSA. Podwójnie zabarwić skrawki 2% octanem uranylu przez 20 minut w ciemności, a następnie cytrynianem ołowiu Reynoldsa przez 10 minut. Umieść zabarwiony wycinek w transmisyjnym mikroskopie elektronowym i obejrzyj próbkę przy użyciu 80 kilowoltów i zobrazuj je, jak pokazano wcześniej.Aby przeprowadzić barwienie negatywne, utrwal oczyszczone egzosomy po izolacji jednym mililitrem 2% paraformaldehydu przez pięć minut. Cienkie, pokryte folią węglową, pokryte formvarem/węglowem, miedziane siatki EM o oczkach 200 wyładowań jarzeniowych przez jedną minutę, a następnie załadować od pięciu do siedmiu mikrolitrów roztworu zawiesiny egzosomu na siatkę i inkubować przez jedną minutę. Jeśli stężenie egzosomu jest zbyt wysokie, rozcieńczyć stężenie do odpowiedniego poziomu.Natychmiast zabarwić egzosomy około 20 kroplami przefiltrowanego 1% roztworu octanu uranylu na powierzchni siatki EM. Usuń nadmiar roztworu octanu uranylu z siatki, stykając krawędź kratki z bibułą filtracyjną, a następnie szybko spłucz siatkę kroplą wody. Użyj pęsety, aby umieścić siatkę na stole i częściowo przykryj siatkę naczyniem hodowlanym.Pozostaw siatkę do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zobrazuj siatkę lub przechowuj ją w pudełku z siatką mikroskopu elektronowego do przyszłych obserwacji. Zacznij od potraktowania cienkich siatek miedzianych EM pokrytych folią węglową o oczkach 200 wyładowań jarzeniowych przez 30 sekund. Następnie załaduj pięć do siedmiu mikrolitrów egzosomów utrwalonych w 2% roztworze paraformaldehydu na siatkę i inkubuj je tam przez pięć minut.Następnie spłucz egzosomy 100 mikrolitrami PBS, trzy razy każdy przez 10 minut. Potraktuj siatki zawierające egzosom 50 mikrolitrami 0,5 molowego roztworu glicyny przez 10 minut, aby ugasić wolne grupy aldehydowe. Następnie przenieś siatki do kropli PBS zawierającej 1% BSA i blokuj przez 30 minut.Teraz inkubuj siatki z 50 do 100 mikrolitrami przeciwciała anty-PD-L1 przez godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyć siatkę pięcioma oddzielnymi kroplami PBS zawierającymi 0,1% BSA przez 10 minut każda, a następnie przenieść siatkę do kropli przeciwciała drugorzędowego na jedną godzinę. Następnie umyj siatkę pięcioma oddzielnymi kroplami PBS zawierającymi 0,1% BSA przez 10 minut każda, a następnie umyj siatkę dwiema oddzielnymi kroplami wody destylowanej.Po zakończeniu wykonaj barwienie ujemne octanem 2% uranylu, jak pokazano wcześniej, i zobrazuj próbki lub przechowuj je w siatce EM do przyszłych obserwacji. Zaobserwowana tutaj morfologia egzosomów jest produktem barwienia ujemnego. Te egzosomy wykazują typową morfologię w kształcie miseczki, która jest artefaktem, który może wystąpić podczas procesu suszenia.Dodatkowe informacje można uzyskać za pomocą barwienia immunogold na całej górze, takich jak lokalizacja określonych białek w egzosomie. Tutaj białe strzałki wskazują lokalizację PD-L1. Na przekrojonych obrazach pęcherzyki wykazywały strukturę światła, która jest znana jako cecha strukturalna egzosomów.One również mogą być barwione immunozłotem w celu identyfikacji określonych białek w egzosomach. Po opanowaniu, technikę barwienia immunogold można przeprowadzić w komórkach włóknistych po prostym przygotowaniu i pocięciu, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można zastosować inną metodę, taką jak podwójne barwienie immunologiczne, aby jednocześnie zidentyfikować lokalizację dwóch różnych białek.Po każdym rozwoju technika ta może być stosowana w dziedzinie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do badania diagnoz chorób w biopsjach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować określoną lokalizację białka w egzosomie. Nie zapominaj, że pracują z roztworami utrwalającymi, takimi jak chlorhydrat, paraformaldehyd i tetratlenek osmu, które mogą być bardzo niewyraźne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak wentylowany wyciąg i rękawice lateksowe.

sample-preparation-imaging-exosomes-transmission-electron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje standardową metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji makrocząsteczek biologicznych przy użyciu mikroskopii elektronowej (EM) z barwieniem negatywowym. W tym protokole wyjaśniamy, jak uzyskać strukturę 3D kompleksu egzosomu Saccharomyces cerevisiae w średniej rozdzielczości, stosując metodę rekonstrukcji z losowym nachyleniem stożkowym (RCT).

Rekonstrukcja kompleksu egzosomu metodą kriotomografii elektronowej pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem metody losowych przechyłów stożkowych

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Ten film opisuje technikę przygotowania cienkiego odcinka osadzonych egzosomów. Sekcje te można następnie barwić i obrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu zbadania cech strukturalnych egzosomów.

Sekcje, barwienie i obrazowanie TEM osadzonych egzosomów: protokół do wizualizacji cech strukturalnych egzosomów za pomocą TEM

Ten film opisuje procedurę negatywnego barwienia oczyszczonych egzosomów. Ujemnie barwione egzosomy są obrazowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ta technika pomaga uwidocznić morfologię egzosomów.

Barwienie ujemne oczyszczonych egzosomów: procedura wizualizacji morfologii egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

W tym artykule przedstawiono metodę izolacji egzosomów z krwi pełnej i dalszej analizy za pomocą śledzenia nanocząstek za pomocą półautomatycznego instrumentu. Prezentowana technologia zapewnia niezwykle czułą metodę wizualizacji i analizy cząstek w ciekłej zawiesinie.

Innowacyjna metoda kwantyfikacji egzosomów i pomiaru wielkości

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Kliniczne tłumaczenie biomarkerów pochodzących z egzosomów dla chorych i złośliwych komórek jest utrudnione przez brak szybkich i dokładnych metod kwantyfikacji. W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych podtypów egzosomów w próbkach surowicy lub osocza o małej objętości.

Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Opisano krok po kroku procedurę bezznacznikowego unieruchamiania egzosomów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek płynnych oraz ich obrazowania za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Obrazy AFM służą do oszacowania wielkości pęcherzyków w roztworze i scharakteryzowania innych właściwości biofizycznych.

Obrazowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii sił atomowych

Tutaj prezentujemy protokół produkcji dużej liczby egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą bioreaktora 3D.

Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D

Egzosomy mają znaczny potencjał kliniczny, ale ich praktyczne zastosowanie jest ograniczone ze względu na łatwą klirens in vivo i słabą stabilność. Mikroigły stanowią rozwiązanie, umożliwiając miejscowe dostarczanie poprzez przebijanie barier fizjologicznych i zachowanie stanu suchego, rozwiązując w ten sposób ograniczenia podawania egzosomów i rozszerzając ich użyteczność kliniczną.

Wytwarzanie i charakterystyka plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów

Tutaj prezentujemy protokół izolowania egzosomów pochodzących z śledziony myszy za pomocą kombinacji trawienia z kolagenazą typu I i ultrawirowania.

Izolacja i charakterystyka egzosomów pochodzących z tkanek śledziony myszy

Poznaj metody transmisyjnej mikroskopii elektronowej do obrazowania morfologii egzosomów i lokalizacji białek. Technika ta umożliwia szczegółową analizę struktury pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i ma zastosowanie w diagnostyce chorób, w tym nowotworów.

Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów