Name: Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach wykorzystującą białka fluorescencyjne do badania agregacji białek. Technika ta umożliwia szybką i skalowalną analizę wpływu tagów fluorescencyjnych na partnerów fuzji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez grant operacyjny z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem dla M.L.D. i P.L. Prezentowana tutaj praca jest wspierana przez nagrodę John R. Evans Leader Fund przyznawaną przez Kanadyjską Fundację na rzecz Innowacji oraz fundusz uzupełniający z Ontario Research Fund dla P.L. Y.J. jest wspierany przez stypendium magisterskie na doktorat od dziekana Schulich School of Medicine and Dentistry na University of Western Ontario. S.D.G. jest wspierany przez stypendium doktoranckie z ALS Canada.

1. Generacja nowych fluorescencyjnie oznaczonych Httex1 Reporters dla ekspresji w drożdżach
Uwaga: Ta sekcja została zmodyfikowana w stosunku do protokołu przez Jiang et al.16 oraz Albakri et al.19.
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery do amplifikacji sekwencji kodującej białko fluorescencyjne lub zainteresowanie metodą PCR. Starter do przodu powinien zawierać sekwencję lidera, która wspomaga enzym restrykcyjny podczas trawienia (GATC), a następnie miejsce restrykcyjne SpeI (ACTAGT) i 20 zasad za ATG (z wyłączeniem ATG) interesującego genu białka fluorescencyjnego. Odwrócony starter powinien zawierać sekwencję prowadzącą (GATC), po której następuje miejsce restrykcyjne SalI (GTCGAC) i odwrotne dopełnienie 20 zasad przed kodonem stop sekwencji FP (w tym stop).</li>
	<li>Korzystając ze starterów zaprojektowanych w kroku 1.1, przeprowadź reakcję PCR za pomocą termocyklera z następującymi ustawieniami: podgrzewać do 95 °C przez 1 minutę i cyklować w temperaturze 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 2 minuty na kB produktu PCR. Wykonanie 18 cykli jest wystarczające.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję PCR na żelu agarozowym (0,5% w Tris-acetate-EDTA). Powinna istnieć pojedyncza wstęga odpowiadająca oczekiwanemu rozmiarowi produktu. Wyizoluj fragment za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.</li>
	<li>Protokół wykorzystuje wektor Httex1 zawierający 25 (nietoksycznych) i 72 (związanych z HD, wykazujących silną agregację) powtórzeń polyQ. Trawić zarówno fragmenty PCR, jak i wektor enzymami restrykcyjnymi SpeI i SalI przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Oczyść strawiony wektor, uruchamiając go na żelu agarozowym, jak w kroku 1.3.</li>
	<li>Oczyść strawiony fragment PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.</li>
	Zremisować powstały strawiony fragment PCR i plazmidy p415-GAL1-FLAG-25/72QpolyQ1 za pomocą ligazy T4 (1 h w temperaturze pokojowej).<li> Użyj reakcji 10 μl (1 μl enzymu T4, 1 μl buforu 10X, 6 μl fragmentu PCR i 2 μl wektora).</li>
	<li>Przekształć 2 μl reakcji ligacji w 50 μl komórek kompetentnych dla Escherichia coli i inkubować je na lodzie przez 30 minut. Następnie poddać ogniwa szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 30 s. Dodać 1 ml pożywki SOC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w shakerze. Płytka 200 μl reakcji na płytce LB-agar zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Wybierz trzy pojedyncze kolonie bakteryjne, hoduj je przez noc w 3 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C w wytrząsarce i ekstrahuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu.</li>
	<li>Sprawdź plazmid, trawiąc 500 ng DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych SpeI i SalI przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i przeprowadź reakcję na żelu agarozowym (0,5% w tris-octanie-EDTA). Powinny być dwa prążki o odpowiednich rozmiarach wektora (~7 kb) i wstawki (rozmiar różni się w zależności od interesującego genu). Następnie zweryfikuj plazmid przez sekwencjonowanie.</li>
	Przekształć plazmidy p415-GAL1-FLAG-polyQ-FP w szczep drożdży W303 zgodnie ze standardowym protokołem transformacji drożdży2.<li></li>
</ol>
2. Test wykrywania
<ol>
	<li>Na płytce agarowej zawierającej pożywkę selekcyjną drożdży (syntetyczny complete-SC bez leucyny) z glukozą jako źródłem węgla należy umieścić na płytce agarowej zawierającej pożywkę selekcyjną drożdży (syntetyczny complete-SC bez leucyny) z glukozą jako źródłem węgla. W tym samym czasie również smuga 25Q/72Q-ymsfGFP, która służy jako kontrola pozytywna. 
	Uwaga: Konstrukty 25Q/72Q, które nie zawierają znacznika fluorescencyjnego, nie są toksyczne i mogą służyć jako kontrola negatywna.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.</li>
	<li>Wybierz do trzech pojedynczych kolonii z tabliczki.</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml SC uzupełnionego 2% glukozą jako źródłem węgla.</li>
	<li>Osad 200 μL każdej kultury na noc i umyj ją 3x sterylną wodą destylowaną.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce SC zawierającej 2% galaktozy jako źródło węgla, aby indukować ekspresję fuzji polyQ. Inkubować pożywkę galaktozy przez noc w temperaturze 30 °C w rotatorze probówkowym. Jako kontrolę powtórz ten krok, używając pożywek zawierających glukozę.</li>
	<li>Następnego ranka wyrównaj gęstość komórek do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) 0,2 na 100 μl pożywki SC na sterylnej 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Przygotować cztery pięciokrotne rozcieńczenia każdej próbki sterylną wodą, pipetując 20 μl próbki z poprzedniego dołka do 80 μl pożywki w następnym dołku.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia do przypinania drożdży narysować komórki na selektywnych płytkach (zawierających glukozę lub galaktozę) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Zobrazuj płyty za pomocą urządzenia do dokumentacji obrazu.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja wzrostu komórek w hodowli płynnej
<ol>
	<li>Przygotuj hodowle komórkowe, postępując zgodnie z krokami 2.1 - 2.5 niniejszego protokołu.</li>
	<li>Zmierz OD600 za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki do OD600 0,1 na 300 μl pożywki na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Zbadaj każdą próbkę w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Inkubować płytkę w czytniku/inkubatorze z możliwością wytrząsania. Ustawić liczbę próbek, temperaturę na poziomie 30 °C, absorbancję na 600 nm, czas trwania eksperymentów na 24 godziny, odstępy między pomiarami na 15 minut i wybrać tryb ciągłego wytrząsania.</li>
	<li>Utwórz krzywą wzrostu i określ ilościowo obszar pod krzywą za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów naukowych. Zalecany jest GraphPad Prism 7. Wklej dane do tabeli XY z trzema wartościami replikacji. Krzywa wzrostu zostanie wyświetlona w folderze Wykresy po lewej stronie. Aby określić ilościowo obszar pod krzywą, wybierz opcję Analizuj w lewym górnym rogu i kliknij opcję Obszar pod krzywą w analizach XY.</li>
</ol>
4. Mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Przygotuj hodowle komórkowe, postępując zgodnie z krokami 2.1 - 2.5 niniejszego protokołu.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki 10x w pożywce wzrostowej i przenieść 200 μl każdej próbki do 8-dołkowych komór obrazowania.</li>
	<li>Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw Plan Aprochromoat 63X (1,4 NA) w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: Użycie mikroskopu konfokalnego jest opcjonalne. Można również zastosować standardowy mikroskop fluorescencyjny o szerokim polu widzenia.</li>
	<li>Dostosuj otwór otworkowy i moc lasera, aby uzyskać optymalną akwizycję obrazu. Ponieważ agregaty 72Q są znacznie jaśniejsze niż rozproszony sygnał 25Q, często wymagane jest użycie różnych ustawień akwizycji między różnymi plazmidami, aby uniknąć nasycenia sygnału fluorescencyjnego.</li>
	<li>Przetwarzaj obrazy za pomocą ImageJ20 lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazów. Na tym etapie pożądany jest procent komórek, w których agregacja jest wyświetlana ręcznie.</li>
</ol>
5. Plama punktowa
Uwaga: W tym protokole, dot blot jest używany do badania poziomów ekspresji białka. Przygotuj hodowle komórkowe, postępując zgodnie z krokami 2.1 - 2.5 niniejszego protokołu.
<ol>
	<li>Wytwarzaj lizaty białkowe za pomocą szklanych kulek w buforze do lizy (100 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 1 mM EDTA; 5% glicerolu, 1 mM ditiotreitol [DTT]). Bezpośrednio przed użyciem dodać inhibitory proteazy, 4 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PSMF) i koktajl inhibitorów proteazy. Osad 5 ml nocnej kultury i ponownie zawieś ją w 200 μl szklanych kulek i 200 μl buforu do lizy. Wir 30 s przez 12 rund. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zebrać sklarowany nad osadem.</li>
	<li>Wykryć równą ilość białek ogółem na membranie nitrocelulozowej za pomocą aparatu do mikrofiltracji. Wstępnie zwilż membranę PBS i zmontuj aparat. Podłącz do źródła podciśnienia i upewnij się, że są dokręcone. Włącz próżnię i pozwól próbce przefiltrować się grawitacyjnie przez membranę.</li>
	<li>Zablokuj membranę w PBS- 0,05% Tween/5% mleka beztłuszczowego.</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-FLAG przez noc w temperaturze 4 °C. Zalecany jest monoklonalny anty-FLAG M1.</li>
	<li>Umyj membranę 3x po 10 min za pomocą PSB- 0,05% Tween.</li>
	<li>Inkubować błonę z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym (anty-mysią IgG) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w PBS-0,05% Tween/5% mleku beztłuszczowym.</li>
	<li>Umyj membranę 3x 10 min z PSB- 0,05% Tween.</li>
	<li>Image-blot przy użyciu systemu dokumentacji immunoblot.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+proteins%3A+advanced+imaging+applications+and+future+design%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li>
<li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670(2015).</li>
<li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles%3A+serious+pitfalls+and+some+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li>
<li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Pédelacq, J. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li>
<li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%2C+mutagenesis%2C+and+oligomerization+of+DsRed%2C+a+red+fluorescent+protein+from+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li>
<li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li>
<li>Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li>
<li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li>
<li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li>
<li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li>
<li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+%5Bversion+1%3B+referees%3A+1+approved%2C+1+approved+with+reservations%5D%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242(2018).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li>
<li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li>
<li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+blue%2C+green%2C+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902(2013).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838(2008).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li>
<li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
<li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li>
<li>Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule wykorzystano różne testy do pomiaru agregacji ekspansji Httex1 polyQ i ich wpływu na wzrost drożdży jako model do zbadania, w jaki sposób różne białka fluorescencyjne zmieniają swoich partnerów fuzyjnych w kontekście reporterów fluorescencyjnych. Używając wariantu GFP (ymsfGFP) jako kontroli pozytywnej, wykazaliśmy, że wykrywa to znaczące zmiany w toksyczności i agregacji poliQ między różnymi znacznikami fluorescencyjnymi i pozwala na bezpośrednie i szybkie porównanie wydajności fuzji poliQ-FP w...

Od czasu początkowej charakterystyki białka zielonej fluorescencji (GFP) z Aequorea victoria1, opracowano szeroką paletę genetycznie kodowanych FPs, co pozwala biologom komórkowym na jednoczesne lokalizowanie i śledzenie wielu zdarzeń/białek komórkowych w żywych komórkach2,3. FP pochodzą z wielu organizmów, od meduz po koralowce, a zatem wykazują specyficzne właściwości biofizyczne, które znacznie wykraczają poza ich odpowiednie spektrum fluorescencyjne. Właściwości te obejmują między innymi jasność, fotostabilność i skłonność do oligomeryzacji2,4. Wybór monomerycznych FP jest ważnym aspektem w wyborze odpowiedniego znacznika podczas projektowania reportera fluorescencyjnego, w celu zminimalizowania niewłaściwych interakcji i zmian funkcji partnera fuzji oraz maksymalizacji wydajności reportera dla danego przedziału komórkowego4,5,6. Chociaż GFP z biegiem czasu ewoluował w celu zminimalizowania efektu dodania znacznika fluorescencyjnego do partnera fuzyjnego5,7,8, to, jak nowe warianty FP radzą sobie w porównaniu z GFP, pozostaje trudne do oceny.
Istnieje niewiele metod charakteryzujących zachowanie FPs. Większość z nich polega na testowaniu właściwości biofizycznych FP przy użyciu podejść biochemicznych, takich jak protokoły ultrawirowania i filtracji żelowej9,10,11,12. Takie metody mają zastrzeżenie polegające na stosowaniu oczyszczonych FP w roztworze, oferując niewielki wgląd w ich zachowanie w nienaruszonych komórkach. Opracowanie zorganizowanego testu gładkiej retikulum endoplazmatycznego (OSER) oferuje ilościową ocenę tendencji FP do oligomeryzacji w żywych komórkach13 poprzez testowanie zdolności nadekspresji FP do reorganizacji kanalików retikulum endoplazmatycznego w okółki OSER14. Technika ta może z powodzeniem wykrywać zmiany między monomerycznymi i oligomerycznymi wariantami GFP i innych FP. Opiera się jednak głównie na nadekspresji w przejściowo transfekowanych komórkach, a kwantyfikacja i analiza obrazu mogą być czasochłonne, chyba że technika ta zostanie przyjęta jako zautomatyzowany przepływ pracy zbierania i analizy danych.
Aby uzupełnić te podejścia, stworzyliśmy test, który wykorzystuje wpływ znaczników fluorescencyjnych na toksyczność i agregację ekspansji polyQ w drożdżach15,16. Ekspansja odcinka polyQ z więcej niż 36 powtórzeniami w pierwszym eksonie genu kodującego białko huntingtyny (Htt) jest związana z chorobą Huntingtona17,18. Ekspresja ekspandowanego Httex1 w drożdżach powoduje silną agregację nieprawidłowo sfałdowanego białka Htt w połączeniu z poważnym defektem wzrostu. Co ciekawe, na te fenotypy duży wpływ mają sekwencje flankujące odcinek polyQ, w tym FPs15,16. Racjonalizowano, że różne właściwości FP mogą w różny sposób wpływać na toksyczność polyQ u drożdży. Rzeczywiście, w porównaniu z FP podobnymi do GFP, białka czerwonej fluorescencji i ich wyewoluowane formy wykazały zmniejszoną toksyczność i agregację16. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy protokół oceny wpływu FP nowej generacji na toksyczność i agregację poliQ w drożdżach. Test ten pozwala na szybką i potencjalnie wysoką zawartość wariantów FP, która może być stosowana równolegle z wcześniej scharakteryzowanymi technikami w celu optymalnej charakterystyki nowych FP i może ocenić, jak zachowują się w porównaniu z GFP.

<table><tbody><tr><td>5-alfa Kompetentny E. coli (wysoka wydajność)</td><td>New Englanfd Biolab</td><td>C2987</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>New Englanfd Biolab</td><td>R3133</td><td>Preferowane są enzymy o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New Englanfd Biolab</td><td>R0138</td><td>Preferowane są enzymy o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB-Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>Agilent Technologies</td><td>600382</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy EPOCH2</td><td>BioTek Instruments inc</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>Replikator szpilek drożdżowych</td><td>V& P Scientific inc.</td><td></td><td></td>VP407AH</tr><tr><td>Imager SPI</td><td>S& P Robotics inc.</td><td>spImager-M</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 800 konfokalny z AryScan</td><td>Carl Zeiss Mikroskopia</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe komory obrazowania Lab-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>Aparat Bio-Dot</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Chemi Doc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-FLAG M1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3040</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG alexa 555</td><td>Termo&nbsp;</td><td>A32727</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MiniPrep Plazmidu</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu plazmidowego</td> Zestaw do oczyszczania PCR <td>Fisher Scientific</td><td>K0831</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Prizm</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13354</td><td></td></tr></tbody></table>

wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Do badania lokalizacji i transportu białek za pomocą obrazowania żywych komórek, badacze często polegają na fuzji interesującego ich białka z fluorescencyjnym reporterem. Stale rozwijająca się lista genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych (FP) przedstawia użytkownikom kilka alternatyw, jeśli chodzi o projektowanie fuzji fluorescencyjnej. Każdy FP ma określone właściwości optyczne i biofizyczne, które mogą wpływać na właściwości biochemiczne, komórkowe i funkcjonalne powstałych fuzji fluorescencyjnych. Na przykład kilka FP ma tendencję do tworzenia niespecyficznych oligomerów, które są podatne na utrudnianie funkcji partnera fuzyjnego. Niestety, istnieje tylko kilka metod testowania wpływu FP na zachowanie reportera fluorescencyjnego. W tym miejscu opisujemy prostą metodę, która umożliwia szybką ocenę wpływu FP za pomocą testów toksyczności poliglutaminy (polyQ) w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Białka huntingtyny ekspandowanej PolyQ są związane z początkiem choroby Huntingtona (HD), w której ekspandowana huntingtyna agreguje się w toksyczne oligomery i ciała inkluzyjne. Agregacja i toksyczność ekspansji polyQ w drożdżach są w dużym stopniu zależne od sekwencji otaczających region polyQ, w tym obecności znaczników fluorescencyjnych, zapewniając w ten sposób idealną platformę eksperymentalną do badania wpływu FP na zachowanie ich partnera fuzyjnego.

Białka FP posiadają różne właściwości biofizyczne, w tym tendencję do oligomeryzacji, co może wpływać na zachowanie ich partnerów fuzyjnych w kontekście reporterów fluorescencyjnych. Niniejszy protokół opisuje prostą metodę, w której wiele białek FP może zostać połączonych z toksycznymi ekspansjami polyQ. Ponieważ toksyczność polyQ jest silnie zależna od sekwencji flankujących odcinek polyQ15, test ten umożliwia szybkie i bezpośrednie porównanie fluorescencyjnych r...

Ten artykuł opisuje protokoły do oceny wpływu białek fluorescencyjnych na agregację i toksyczność nieprawidłowo sfałdowanej ekspansji poliglutaminy w celu szybkiej oceny nowo niescharakteryzowanego białka fluorescencyjnego w kontekście reporterów fluorescencyjnych.

Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie białek fluorescencyjnych, takie jak to, w jaki sposób białka fluorescencyjne mogą wpływać na swoich partnerów fuzyjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia szybką i łatwo skalowalną ocenę wpływu białek fluorescencyjnych i ich partnerów w fuzji. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w zachowanie białek fluorescencyjnych, może być również zastosowana do innych genetycznie kodowanych znaczników.Procedurę tę zademonstruje również Sonja Di Gregorio, która jest doktorantką na Uniwersytecie Zachodnim. Każde białko fluorescencyjne, które jest testowane tą metodą, jest najpierw klonowane do wektora ekspresji drożdży, który koduje indukowaną galaktozą wersję eksonu HTT znakowanego FLAG, zawierającego albo nietoksyczne powtórzenie 25Q, albo toksyczne powtórzenie 72Q związane z chorobą Huntingtona. Klony są selekcjonowane i weryfikowane przez sekwencjonowanie, a następnie przekształcane w drożdże.Aby przygotować hodowle komórkowe do różnych testów, należy umieścić na płytce agarowej na płytce agarowej zawierającej pożywkę selekcyjną z glukozą jako źródłem węgla na klonach drożdży zawierających znacznik 25Q lub 72Q z interesującym białkiem fluorescencyjnym na płytce agarowej zawierającej pożywkę selekcyjną drożdży z glukozą jako źródłem węgla. W tym samym czasie drożdże smugowe przenoszące drożdże 25Q lub 72Q zoptymalizowane pod kątem monomerycznego superfolderu GFP, aby służyć jako kontrola pozytywna. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.Wybierz do trzech pojedynczych kolonii z każdej płytki i zaszczep pięć mililitrów syntetycznej kompletnej pożywki uzupełnionej 2% glukozą jako źródłem węgla. Inkubuj kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przenieś 200 mikrolitrów każdej nocnej kultury do probówki mikrowirówkowej i odwiruj w celu osadzenia komórek.Umyć co najmniej trzy razy sterylną wodą destylowaną. Ważne jest, aby dobrze umyć komórki, aby wyeliminować wszelkie ślady glukozy, które mogłyby przyczynić się do zahamowania indukcji promotora GAL1. Przygotuj komórki, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawiesić je w syntetycznym kompletnym podłożu zawierającym 2% galaktozę jako źródło węgla w celu wywołania ekspresji fuzji polyQ.Jako kontrolę, ponownie zawiesić komórki w pożywce zawierającej glukozę. Inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza w rotatorze probówkowym przez noc. Następnego ranka zmierz gęstość optyczną każdej kultury przy 600 nanometrach za pomocą spektrofotometru.Wyrównaj gęstość komórek do gęstości optycznej 600 2 na 100 mikrolitrów syntetycznego kompletnego podłoża na sterylnej 96-dołkowej płytce. Przygotować cztery pięciokrotne rozcieńczenia każdej próbki, pipetując 20 mikrolitrów próbki z poprzedniego dołka do 80 mikrolitrów pożywki w następnym dołku. Użyj narzędzia do przypinania drożdży, aby umieścić komórki na selektywnych płytkach i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa dni.Zobrazuj płyty za pomocą urządzenia do dokumentacji obrazu. Przygotuj kultury komórkowe do tego testu, a następnie zmierz OD600 w każdej kulturze za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć komórki do OD600 1 na 300 mikrolitrów pożywki na 96-dołkowej płytce.Przygotować każdą próbkę w trzech egzemplarzach. Inkubować płytkę w inkubatorze z czytnikiem płytek z możliwością wytrząsania. Ustaw liczbę próbek, temperaturę na 30 stopni Celsjusza, absorbancję na 600 nanometrów, długość eksperymentów na 24 godziny, a odstępy między pomiarami na 15 minut.Wybierz tryb ciągłego potrząsania. Po zakończeniu eksperymentu utwórz krzywą wzrostu i określ ilościowo obszar pod krzywą za pomocą naukowego oprogramowania do tworzenia wykresów. Wklej dane do tabeli XY z trzema wartościami replikacji.Krzywa wzrostu zostanie pokazana w folderze wykresów po lewej stronie. Aby określić ilościowo obszar pod krzywą, wybierz opcję Analizuj w lewym górnym rogu i kliknij opcję Obszar pod krzywą w analizach XY. Rozpocznij tę procedurę od 10-krotnego rozcieńczenia przygotowanych komórek w pożywce wzrostowej.Przenieś 200 mikrolitrów każdej próbki do ośmiodołkowej komory obrazowania. Zobrazuj komórki za pomocą standardowego szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego. Dostosuj ustawienia obrazowania do akwizycji obrazu.Ponieważ agregaty 72Q są znacznie jaśniejsze niż rozproszony sygnał 25Q, często wymagane jest użycie różnych ustawień akwizycji między różnymi plazmidami, aby uniknąć nasycenia sygnału fluorescencyjnego. Przetwarzaj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu. W tym protokole dot blot służy do badania poziomów ekspresji białek.Przygotować bufor do wytwarzania lizatów białkowych, dodając cztery mikromole fluorku fenylometylosulfonylu i koktajl inhibitorów proteazy do buforu do lizy. Osadzać pięć mililitrów każdej kultury przez noc przez odwirowanie. Ponownie zawieś ogniwa w 200 mikrolitrach szklanych kulek i 200 mikrolitrach buforu do lizy.Wiruj przez 30 sekund przez 12 rund, oblodzając między rundami. Odwirować w temperaturze 12 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut i zebrać supernatant. Użyj aparatu do mikrofiltracji, aby wykryć równe ilości białka całkowitego na membranie nitrocelulozowej.Wstępnie zwilż membranę PBS i zmontuj aparat. Podłącz go do źródła podciśnienia i upewnij się, że są dokręcone. Załaduj próbki, włącz próżnię i pozwól próbce przefiltrować się grawitacyjnie przez membranę.Osusz błonę w mleku beztłuszczowym PBS 05%Tween 5% przez 30 minut. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem antyflagowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umyj membranę trzy razy po 10 minut za pomocą PBS 05%Tween.Inkubować błonę z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym w mleku beztłuszczowym PBS 05%Tween 5% w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Umyj membranę trzy razy po 10 minut za pomocą PBS 05%Tween. Następnie zobrazuj błonę za pomocą systemu dokumentacji amino blot.Drożdże eksygające ekson HTT 25Q lub 72Q połączone ze zoptymalizowanym pod kątem drożdży monomerycznym superfolderem GFP lub zoptymalizowanym pod kątem drożdży znacznikiem monomerycznym BFP2 hodowano w pożywce glukozowej lub galaktozowej przez noc i albo nakrapiano na płytkach agarowych, albo inkubowano dalej w płynnym podłożu. Podczas gdy 72Q zoptymalizowany przez drożdże monomeryczny superfolder GFP indukuje znaczny defekt wzrostu. Zoptymalizowany pod kątem drożdży znacznik monomeryczny BFP2 72Q wykazuje fenotyp wzrostu podobny do nietoksycznych odpowiedników 25Q, co wskazuje, że charakter znacznika fluorescencyjnego może utrudniać ekspansję poliQ w komórkach.Ocena agregacji fuzji fluorescencyjnych poliQ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pokazuje, że superfolder monomeryczny GFP zoptymalizowany pod kątem drożdży 72Q wykazuje znaczną agregację, podczas gdy zoptymalizowany pod kątem drożdży 72Q znacznik monomeryczny BFP2 wykazuje rozproszony sygnał cytoplazmatyczny podobny do nietoksycznych odpowiedników 25Q. Ponieważ poziomy ekspresji różnych fuzji polyQ mogą wpływać na toksyczność, przeprowadzono badania dot blot w celu oceny poziomu białka. Przedstawiono wyniki pięciokrotnego rozcieńczenia lizatów komórkowych.Nie zapominaj, że technika ta pozwala na szybkie porównanie niescharakteryzowanych i fluorescencyjnych białek z wariantami GFP, ale nie może bezpośrednio ocenić oligomeryzacji. Po tej procedurze można wykonać inne pomiary, na przykład test wrzodów w komórkach ssaków, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak status monomeryczny białek fluorescencyjnych.

effect-fluorescent-proteins-on-fusion-partners-using-polyglutamine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Niniejszy manuskrypt opisuje trzy komplementarne protokoły służące do oceny toksyczności białek z ekspansją poliglutaminy (polyQ) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokoły te można łatwo zmodyfikować w celu monitorowania toksyczności innych błędnie sfałdowanych białek w drożdżach.

Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Ten film demonstruje test oparty na obrazowaniu in vivo, który pozwala określić spadek proteostazy spowodowany starzeniem się. W teście wykorzystuje Caenorhabditis elegans eksprymujące białko fuzyjne poliglutaminy YFP w mięśniach ścian ciała w celu zmierzenia związanej z wiekiem agregacji poliglutaminy i indukcji proteotoksyczności, co prowadzi do paraliżu.

Fluorescencyjny test paraliżu reporterowego: technika oceny związanego z wiekiem postępującego tworzenia się fluorescencyjnego reportera poliglutaminy i związanego z nim paraliżu w Caenorhabditis elegans

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Modyfikacja genów za pośrednictwem PCR może być wykorzystana do generowania fuzji białek fluorescencyjnych u gatunków Candida, co ułatwia wizualizację i ocenę ilościową komórek i białek drożdży. W niniejszym artykule przedstawiono strategię konstruowania fuzji białek fluorescencyjnych (Eno1-FP) w parapsilosie Candida.

Generowanie fuzji białek fluorescencyjnych u gatunków Candida

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Poznaj metodę oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach wykorzystującą białka fluorescencyjne do badania agregacji białek. Technika ta umożliwia szybką i skalowalną analizę wpływu tagów fluorescencyjnych na partnerów fuzji.

Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Przeglądaj więcej filmów