Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie białek fluorescencyjnych, takie jak to, w jaki sposób białka fluorescencyjne mogą wpływać na swoich partnerów fuzyjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia szybką i łatwo skalowalną ocenę wpływu białek fluorescencyjnych i ich partnerów w fuzji. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w zachowanie białek fluorescencyjnych, może być również zastosowana do innych genetycznie kodowanych znaczników.

Procedurę tę zademonstruje również Sonja Di Gregorio, która jest doktorantką na Uniwersytecie Zachodnim. Każde białko fluorescencyjne, które jest testowane tą metodą, jest najpierw klonowane do wektora ekspresji drożdży, który koduje indukowaną galaktozą wersję eksonu HTT znakowanego FLAG, zawierającego albo nietoksyczne powtórzenie 25Q, albo toksyczne powtórzenie 72Q związane z chorobą Huntingtona. Klony są selekcjonowane i weryfikowane przez sekwencjonowanie, a następnie przekształcane w drożdże.

Aby przygotować hodowle komórkowe do różnych testów, należy umieścić na płytce agarowej na płytce agarowej zawierającej pożywkę selekcyjną z glukozą jako źródłem węgla na klonach drożdży zawierających znacznik 25Q lub 72Q z interesującym białkiem fluorescencyjnym na płytce agarowej zawierającej pożywkę selekcyjną drożdży z glukozą jako źródłem węgla. W tym samym czasie drożdże smugowe przenoszące drożdże 25Q lub 72Q zoptymalizowane pod kątem monomerycznego superfolderu GFP, aby służyć jako kontrola pozytywna. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.

Wybierz do trzech pojedynczych kolonii z każdej płytki i zaszczep pięć mililitrów syntetycznej kompletnej pożywki uzupełnionej 2% glukozą jako źródłem węgla. Inkubuj kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przenieś 200 mikrolitrów każdej nocnej kultury do probówki mikrowirówkowej i odwiruj w celu osadzenia komórek.

Umyć co najmniej trzy razy sterylną wodą destylowaną. Ważne jest, aby dobrze umyć komórki, aby wyeliminować wszelkie ślady glukozy, które mogłyby przyczynić się do zahamowania indukcji promotora GAL1. Przygotuj komórki, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawiesić je w syntetycznym kompletnym podłożu zawierającym 2% galaktozę jako źródło węgla w celu wywołania ekspresji fuzji polyQ.

Jako kontrolę, ponownie zawiesić komórki w pożywce zawierającej glukozę. Inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza w rotatorze probówkowym przez noc. Następnego ranka zmierz gęstość optyczną każdej kultury przy 600 nanometrach za pomocą spektrofotometru.

Wyrównaj gęstość komórek do gęstości optycznej 600 2 na 100 mikrolitrów syntetycznego kompletnego podłoża na sterylnej 96-dołkowej płytce. Przygotować cztery pięciokrotne rozcieńczenia każdej próbki, pipetując 20 mikrolitrów próbki z poprzedniego dołka do 80 mikrolitrów pożywki w następnym dołku. Użyj narzędzia do przypinania drożdży, aby umieścić komórki na selektywnych płytkach i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa dni.

Zobrazuj płyty za pomocą urządzenia do dokumentacji obrazu. Przygotuj kultury komórkowe do tego testu, a następnie zmierz OD600 w każdej kulturze za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć komórki do OD600 1 na 300 mikrolitrów pożywki na 96-dołkowej płytce.

Przygotować każdą próbkę w trzech egzemplarzach. Inkubować płytkę w inkubatorze z czytnikiem płytek z możliwością wytrząsania. Ustaw liczbę próbek, temperaturę na 30 stopni Celsjusza, absorbancję na 600 nanometrów, długość eksperymentów na 24 godziny, a odstępy między pomiarami na 15 minut.

Wybierz tryb ciągłego potrząsania. Po zakończeniu eksperymentu utwórz krzywą wzrostu i określ ilościowo obszar pod krzywą za pomocą naukowego oprogramowania do tworzenia wykresów. Wklej dane do tabeli XY z trzema wartościami replikacji.

Krzywa wzrostu zostanie pokazana w folderze wykresów po lewej stronie. Aby określić ilościowo obszar pod krzywą, wybierz opcję Analizuj w lewym górnym rogu i kliknij opcję Obszar pod krzywą w analizach XY. Rozpocznij tę procedurę od 10-krotnego rozcieńczenia przygotowanych komórek w pożywce wzrostowej.

Przenieś 200 mikrolitrów każdej próbki do ośmiodołkowej komory obrazowania. Zobrazuj komórki za pomocą standardowego szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego. Dostosuj ustawienia obrazowania do akwizycji obrazu.

Ponieważ agregaty 72Q są znacznie jaśniejsze niż rozproszony sygnał 25Q, często wymagane jest użycie różnych ustawień akwizycji między różnymi plazmidami, aby uniknąć nasycenia sygnału fluorescencyjnego. Przetwarzaj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu. W tym protokole dot blot służy do badania poziomów ekspresji białek.

Przygotować bufor do wytwarzania lizatów białkowych, dodając cztery mikromole fluorku fenylometylosulfonylu i koktajl inhibitorów proteazy do buforu do lizy. Osadzać pięć mililitrów każdej kultury przez noc przez odwirowanie. Ponownie zawieś ogniwa w 200 mikrolitrach szklanych kulek i 200 mikrolitrach buforu do lizy.

Wiruj przez 30 sekund przez 12 rund, oblodzając między rundami. Odwirować w temperaturze 12 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut i zebrać supernatant. Użyj aparatu do mikrofiltracji, aby wykryć równe ilości białka całkowitego na membranie nitrocelulozowej.

Wstępnie zwilż membranę PBS i zmontuj aparat. Podłącz go do źródła podciśnienia i upewnij się, że są dokręcone. Załaduj próbki, włącz próżnię i pozwól próbce przefiltrować się grawitacyjnie przez membranę.

Osusz błonę w mleku beztłuszczowym PBS 05%Tween 5% przez 30 minut. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem antyflagowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umyj membranę trzy razy po 10 minut za pomocą PBS 05%Tween.

Inkubować błonę z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym w mleku beztłuszczowym PBS 05%Tween 5% w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Umyj membranę trzy razy po 10 minut za pomocą PBS 05%Tween. Następnie zobrazuj błonę za pomocą systemu dokumentacji amino blot.

Drożdże eksygające ekson HTT 25Q lub 72Q połączone ze zoptymalizowanym pod kątem drożdży monomerycznym superfolderem GFP lub zoptymalizowanym pod kątem drożdży znacznikiem monomerycznym BFP2 hodowano w pożywce glukozowej lub galaktozowej przez noc i albo nakrapiano na płytkach agarowych, albo inkubowano dalej w płynnym podłożu. Podczas gdy 72Q zoptymalizowany przez drożdże monomeryczny superfolder GFP indukuje znaczny defekt wzrostu. Zoptymalizowany pod kątem drożdży znacznik monomeryczny BFP2 72Q wykazuje fenotyp wzrostu podobny do nietoksycznych odpowiedników 25Q, co wskazuje, że charakter znacznika fluorescencyjnego może utrudniać ekspansję poliQ w komórkach.

Ocena agregacji fuzji fluorescencyjnych poliQ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pokazuje, że superfolder monomeryczny GFP zoptymalizowany pod kątem drożdży 72Q wykazuje znaczną agregację, podczas gdy zoptymalizowany pod kątem drożdży 72Q znacznik monomeryczny BFP2 wykazuje rozproszony sygnał cytoplazmatyczny podobny do nietoksycznych odpowiedników 25Q. Ponieważ poziomy ekspresji różnych fuzji polyQ mogą wpływać na toksyczność, przeprowadzono badania dot blot w celu oceny poziomu białka. Przedstawiono wyniki pięciokrotnego rozcieńczenia lizatów komórkowych.

Nie zapominaj, że technika ta pozwala na szybkie porównanie niescharakteryzowanych i fluorescencyjnych białek z wariantami GFP, ale nie może bezpośrednio ocenić oligomeryzacji. Po tej procedurze można wykonać inne pomiary, na przykład test wrzodów w komórkach ssaków, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak status monomeryczny białek fluorescencyjnych.