Obrazowanie poklatkowe podziału nerwowych komórek macierzystych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Weźmy wielodołkową płytkę zawierającą przylegające nerwowe komórki macierzyste lub NSC wyizolowane z mózgu transgenicznej myszy. Te NSC zawierają fluorescencyjnie znakowane białko, które jest specyficzne dla pierwszej fazy wzrostu lub G1.

Gdy NSC się dzieli, fluoryzuje w fazie G1 cyklu komórkowego, nie emitując fluorescencji w innych fazach.

Umieść płytkę w komorze obrazowania konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, utrzymywanej w kontrolowanej temperaturze.

Wybierz żądaną soczewkę obiektywu i dostosuj intensywność fluorescencji.

Skonfiguruj parametry obrazowania poklatkowego.

Wybierz opcję dużego obrazu i zaplanuj rejestrowanie obrazu w regularnych odstępach czasu na żądany czas.

Użyj szybkiego skanera rezonansowego, aby uniknąć fotowybielania i utrzymać wysoką rozdzielczość.

Użyj ustawienia jasnego pola, aby zobrazować kształt komórki i użyj odpowiedniego filtra fluorescencyjnego, aby uchwycić fluorescencję.

Rozpocznij obrazowanie poklatkowe NSC, aby uwidocznić różne fazy cyklu komórkowego.

Przygotuj konfokalny laserowy mikroskop skaningowy do obrazowania, podgrzewając dołączoną komorę kontroli temperatury do 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Umieść 96-dołkową płytkę we wstępnie ogrzanej komorze mikroskopu i ustaw ostrość na pierwszym dołku. Następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania i kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie głównym, aby wybrać Przejmij kontrolę nad przejęciem i Wycofanie nabycia, aby otworzyć TI Pad i wybrać plan Apo VC 20x DIC.

Następnie kliknij Przejmij kontrolę nad przejęciem, a następnie otwórz opcje poklatkowe. Ustaw środek każdego dołka jako pozycję stołu montażowego i wybierz opcję Duży obraz na 7 na 7 milimetrów do kwadratu. Obserwuj mozaikowy obraz wokół środka każdej studni. Ustaw nakładanie się dużego obrazu mozaiki na 5% i ustaw częstotliwość tak, aby zdjęcia były robione co 20 minut przez 24 godziny.

W ustawieniach A1 plus wybierz poziom napięcia lampy fotopowielacza dla każdej fluorescencji wymienionej na pasku menu. Wybierz tę opcję, aby uzyskać obrazy za pomocą szybkiego skanera rezonansowego w formacie 512 na 512 pikseli, a następnie użyć DIC do wizualizacji komórek. Następnie wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych. Wybierz przycisk Uruchom teraz w oknie Pobieranie ND, aby rozpocząć pobieranie.