Name: Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę podwójnej synchronizacji tymidynowej komórek HeLa i mikroskopię konfokalną do badania ról mitotycznych wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr Kozo Tanaka z Uniwersytetu Tohoku, Japonia za udostępnienie komórek HeLa stabilnie eksprymujących mCherry-Histone H2B i GFP-α-tubulinę. Prace te były wspierane przez grant NCI dla DV (R00CA178188) oraz przez fundusze startowe z Northwestern University.

1. Podwójna blokada i uwalnianie tymidyny: preparaty odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% FBS, penicyliną i streptomycyną.</li>
	<li>Przygotować 100 mM zapasu tymidyny w sterylnej wodzie i przechowywać w porcjach w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Protokół obrazowania progresji mitotycznej komórek stałych (Rysunek 1A)
<ol>
	<li>W dniu 1 wysiewaj ~ 2 x 105 komórek HeLa do dołków 6-dołkowej płytki ze szkiełkiem nakrywkowym (sterylizowanym 70% etanolem i promieniowaniem UV) i 2 ml pożywki DMEM. Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>1. blok tymidyny: W dniu 2 dokładnie wymieszaj wymaganą objętość tymidyny ze świeżymi pożywkami DMEM (100 mM bulionu, 2 mM stężenie końcowe).</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki zawierającej tymidynę do komórek w każdym dołku płytki 6-dołkowej i inkubować przez 18 godzin.</li>
	<li>W dniu 3 odessać pożywkę i umyć komórki dwukrotnie 2 ml 1x PBS i raz świeżym, wstępnie podgrzanym DMEM; hodować komórki w świeżym, wstępnie podgrzanym pożywce DMEM przez 9 godzin, aby uwolnić komórki z bloku.</li>
	<li>2. blok tymidyny: Ponownie dodaj 2 ml pożywki zawierającej tymidynę (końcowe stężenie 2 mM) do komórek w każdym dołku płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować przez kolejne 18 godzin.</li>
	<li>W 4 dniu odessać pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie 2 ml 1x PBS i raz świeżym, wstępnie podgrzanym DMEM.</li>
	<li>Rozcieńczyć siRNA (kontrolne i Cdt1) i odczynnik do transfekcji w pożywce wzrostowej wolnej od surowicy oddzielnie przez 10 minut. Wymieszać je ze sobą i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenie siRNA użyte w każdej transfekcji wynosiło 100 nM. Dodaj mieszaninę reakcyjną do komórek, które zostały wypłukane z tymidyny.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 9-10 godzin, aby uwolnić się od zablokowania i utrwalić komórki na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 4% PFA przez 20 minut w temperaturze RT. 
	Uwaga: PFA jest toksyczny, należy nosić odpowiednią ochronę.</li>
	<li>Komórki immunostainowe, po przepuszczalności 0,5% (v/v) detergentu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i dwukrotnym przemyciu komórek 1x PBS przez 5 minut każda.
	<ol>
		<li>Zablokuj komórki z 1% BSA (w/v) w 1x PBS przez 1 godzinę w RT, a następnie potraktuj komórki 50 μl przeciwciał pierwszorzędowych (mysie przeciwciało anty-α-tubulinowe rozcieńczone w stosunku 1:1,000, królicze przeciwciało anty-Zwint1 rozcieńczone w 1:400 i mysie anty-fosfo-ɣ H2AX rozcieńczone w 1:300) w 1% (w/v) BSA w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 oC.</li>
		<li>Po trzykrotnym wypłukaniu komórek 1x PBS, potraktuj komórki 50 μl przeciwciał drugorzędowych dla każdego szkła nakrywkowego (Alexa 488 i czerwień rodaminowa w rozcieńczeniach 1:250 w 1% (w/v) BSA w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po umyciu komórek 1x PBS dwukrotnie przez 5 minut każde, potraktuj komórki DAPI (0,1 μg / ml w 1x PBS) przez 5 minut w RT.</li>
		<li>Po dwukrotnym umyciu komórek 1x PBS przez 5 minut każde, umieścić szkiełko nakrywkowe skierowane do odpowiednich mediów montażowych na przezroczystym mikroskopijnym szkiełku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zobrazuj komórki pod kątem białek barwionych immunologicznie za pomocą 60-krotnego lub 100-krotnego lub 1,4-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju NA 1,4 NA, zamontowanego na odwróconym mikroskopie konfokalnym o wysokiej rozdzielczości, wyposażonym w odpowiednią kamerę, zgodnie z wymaganiami dotyczącymi wymaganej jakości obrazów.</li>
	<li>Rejestruj obrazy w temperaturze pokojowej jako stosy z o grubości 0,2 μm za pomocą oprogramowania odpowiedniego dla mikroskopu.</li>
</ol>
3. Protokół obrazowania progresji mitotycznej na żywo komórek (Rysunek 3A)
<ol>
	<li>W dniu 1 wysiewaj około 0,5-1 x 105 komórek HeLa stabilnie eksprymujących mCherry-H2B i GFP-α-tubulinę (nieznacznie zmienną w zależności od typu komórki i białek, które wyrażają) do 35-milimetrowych szklanych naczyń z dnem 1,5 ml pożywki DMEM i hoduj je w wilgotnym inkubatorze przez 24 godziny w temperaturze 37 oC i 5% CO2 .</li>
	<li>1. blok tymidyny: W drugim dniu dodaj 1,5 ml pożywki zawierającej tymidynę do komórek w naczyniu (100 mM tymidyny, 2 mM stężenie końcowe).</li>
	<li>Inkubować przez 18 godzin.</li>
	<li>W dniu 3 odessać pożywkę zawierającą tymidynę i trzykrotnie przemyć komórki, dwa razy 2 ml 1x PBS i raz świeżym, wstępnie podgrzanym DMEM.</li>
	<li>Rozcieńczyć siRNA (kontrolne i Hec1) i odczynnik do transfekcji pożywką wzrostową wolną od surowicy oddzielnie przez 10 minut. Wymieszać je ze sobą i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenie siRNA użyte w każdej transfekcji wynosiło 100 nM. Dodaj mieszaninę reakcyjną do komórek, które zostały wypłukane z tymidyny.</li>
	<li>Hoduj komórki w 1,5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki DMEM przez 8 godzin, aby uwolnić komórki z bloku.</li>
	<li>2. blok tymidyny: Dodaj 1,5 ml pożywki zawierającej tymidynę (2 mM stężenie końcowe) do komórek w naczyniu.</li>
	<li>Inkubować przez kolejne 18 godzin.</li>
	<li>W 4 dniu odessać pożywkę i umyć komórki trzykrotnie, dwa razy 2 ml 1x PBS i raz świeżym, wstępnie podgrzanym DMEM. Następnie hoduj komórki w świeżym, podgrzanym podłożu Leibovitza (L-15) uzupełnionym 10% FBS i 20 mM HEPES o pH 7,0 przez 8 godzin, aby uwolnić komórki z bloku.</li>
	<li>Umieść czaszę w komorze kontroli temperatury ustawionej w mikroskopie konfokalnym o wysokiej rozdzielczości, który włączył się już co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem obrazowania w celu ustabilizowania temperatury na scenie i eksperymentalnej.</li>
	<li>Ustaw ostrość w jasnym polu za pomocą obiektywu 60x, aż komórki będą widoczne, a następnie ręcznie przesiej stół montażowy do wybranego obszaru.</li>
	<li>Ustaw światło/moc/ekspozycję/ekspozycję, parametry akwizycji obrazu i czas trwania eksperymentu za pomocą wybranego oprogramowania do akwizycji obrazu mikroskopu. Do pozyskiwania obrazów należy używać filtrów GFP (wzbudzenie 488; emisja 385 nm) i mCherry (wzbudzenie 561 nm i emisja 385 nm).</li>
	<li>Wykonaj eksperyment poklatkowy, oddzielnie rejestrując pulsacyjne obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencji co 10 minut przez okres do 16 godzin.</li>
	<li>Rejestruj obrazy jako dwanaście płaszczyzn z oddzielonych od siebie 1,0 μm po 9 godzinach od uwolnienia z podwójnego bloku tymidynowego za pomocą oprogramowania odpowiedniego dla mikroskopu.</li>
	<li>Przeanalizuj obrazy śledzące poszczególne komórki pod kątem progresji mitotycznej i na koniec zmontuj odpowiedni film za pomocą oprogramowania źródłowego Fiji/ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li>
<li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle%2C+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. J. 3, 379-392 (1963).</li>
<li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+and+miracles+of+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The life and miracles of kinetochores.</a> EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li>
<li>Musacchio, A., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+View+of+Kinetochore+Assembly+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function.</a> Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+HeLa+cells+in+G1+or+G2+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases.</a> Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).</li>
<li>Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microRNA+expression+profiles+during+the+cell+cycle+in+synchronized+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells.</a> BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).</li>
<li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li>
<li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1%2C+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li>
<li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li>
<li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li>
<li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li>
<li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li>
<li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li>
<li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li>
<li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1%2FMad2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li>
<li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).</li>
<li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Najważniejszą zaletą podwójnej synchronizacji tymidyny jest to, że zapewnia ona zwiększoną wielkość próbki komórek mitotycznych w krótkim czasie, przy czym wiele z tych komórek jednocześnie wchodzi w mitozę, umożliwiając w ten sposób również analizy wyrównania chromosomów, tworzenia wrzeciona dwubiegunowego i segregacji chromosomów ze znacznie wyższą wydajnością.
Wiele regulatorowych kompleksów białkowych i szlaków sygnałowych jest poświęconych zapewnieniu prawidłowego postępu poprzez mitozę, ...

W cyklu komórkowym komórki przechodzą serię wysoce regulowanych i czasowo kontrolowanych zdarzeń w celu dokładnego powielania ich genomu i proliferacji. U ssaków cykl komórkowy składa się z interfazy i fazy M. W interfazie, która składa się z trzech etapów - G1, S i G2, komórka duplikuje swój genom i ulega wzrostowi, który jest niezbędny do normalnej progresji cyklu komórkowego1,2. W fazie M, która składa się z mitozy (profaza, prometafaza, metafaza, anafaza i telofaza) i cytokinezy, komórka rodzicielska wytwarza dwie genetycznie identyczne komórki potomne. W mitozie chromatydy siostrzane zduplikowanego genomu są kondensowane (profaza) i są wychwytywane w swoich kinetochorach przez mikrotubule zmontowanego wrzeciona mitotycznego (prometafaza), które napędza ich wyrównanie na płytce metafazowej (metafaza), a następnie ich równa segregacja, gdy chromatydy siostrzane są dzielone w kierunku i transportowane do przeciwległych biegunów wrzeciona (anafaza). Dwie komórki potomne są fizycznie oddzielone przez aktywność pierścienia kurczliwego opartego na aktynie (telofaza i cytokineza). Kinetochor jest wyspecjalizowaną strukturą białkową, która gromadzi się w regionie centromerowym chromatyd i służy jako miejsca przyczepu mikrotubul wrzeciona. Jego główną funkcją jest sterowanie wychwytywaniem, wyrównywaniem chromosomów i pomoc w korygowaniu nieprawidłowego mocowania mikrotubul wrzeciona, jednocześnie pośrednicząc w punkcie kontrolnym montażu wrzeciona w celu utrzymania wierności segregacji chromosomów3,4.
Technika synchronizacji komórek służy jako idealne narzędzie do zrozumienia molekularnych i strukturalnych zdarzeń związanych z postępem cyklu komórkowego. Podejście to zostało wykorzystane do wzbogacenia populacji komórek w określonych fazach do różnych rodzajów analiz, w tym profilowania ekspresji genów, analiz komórkowych procesów biochemicznych i wykrywania subkomórkowej lokalizacji białek. Zsynchronizowane komórki ssaków mogą być wykorzystywane nie tylko do badania pojedynczych produktów genowych, ale także do podejść obejmujących analizę całych genomów, w tym analizę ekspresji genów w mikromacierzach5, wzorce ekspresji miRNA6, regulacja translacyjna7, oraz analiza proteomiczna modyfikacji białek8. Synchronizacja może być również wykorzystana do badania wpływu ekspresji genów lub knock-down lub knock-out białek lub substancji chemicznych na postęp cyklu komórkowego.
Komórki mogą być synchronizowane na różnych etapach cyklu komórkowego. Zarówno metody fizyczne, jak i chemiczne są szeroko stosowane do synchronizacji komórek. Najważniejszym kryterium synchronizacji komórek jest to, że synchronizacja powinna być niecytotoksyczna i odwracalna. Ze względu na potencjalne niekorzystne konsekwencje komórkowe synchronizacji komórek przez czynniki farmakologiczne, metody zależne od substancji chemicznych mogą być korzystne w badaniu kluczowych zdarzeń cyklu komórkowego. Na przykład hydroksymocznik, amfidikolina, mimozyna i lowastatyna mogą być używane do synchronizacji komórek w fazie G1/S, ale ze względu na ich wpływ na szlaki biochemiczne, które hamują, aktywują mechanizmy punktów kontrolnych cyklu komórkowego i zabijają ważną część komórek9,10. Z drugiej strony, hamowanie replikacji DNA przez sprzężenie zwrotne poprzez dodanie tymidyny do pożywki wzrostowej, znane jako "blok tymidynowy", może zatrzymać cykl komórkowy w określonych punktach11,12,13. Komórki można również synchronizować w fazie G2/M poprzez traktowanie nokodazolem i RO-33069,14. Nokodazol, który zapobiega tworzeniu się mikrotubul, ma stosunkowo wysoką cytotoksyczność. Co więcej, komórki zatrzymane przez nokodazol mogą przedwcześnie powrócić do interfazy w wyniku poślizgu mitotów. Podwójne komórki zatrzymujące blok tymidyny w fazie G1 / S, a po uwolnieniu z bloku stwierdzono, że komórki przechodzą synchronicznie przez G2 i do mitozy. Normalny postęp cyklu komórkowego dla komórek uwolnionych z bloku tymidynowego można zaobserwować pod mikroskopią konfokalną o wysokiej rozdzielczości za pomocą utrwalenia komórek lub obrazowania na żywo. Efekt zaburzeń białek mitotycznych można badać konkretnie, gdy komórki wchodzą i przechodzą mitozę po uwolnieniu z podwójnego bloku tymidyny. Cdt1, wielofunkcyjne białko, bierze udział w licencjonowaniu pochodzenia replikacji DNA w fazie G1 i jest również wymagane do przyłączania mikrotubul kinetochorowych podczas mitozy15. Aby zbadać funkcję Cdt1 podczas mitozy, należy przyjąć metodę, która pozwala uniknąć wpływu jego wyczerpania na licencjonowanie replikacji w fazie G1, jednocześnie powodując jego wyczerpanie specyficznie tylko w fazie G2 / M. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły oparte na podwójnym bloku tymidyny w celu zbadania mitotycznej roli białek pełniących wiele funkcji na różnych etapach cyklu komórkowego zarówno za pomocą obrazowania stałych, jak i żywych komórek.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Sklep pod adresem 4 &deg; C</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Sklep pod adresem 4 & deg; C.</td></tr><tr><td>Leibovitz' s (1x) L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td>Przechowywać pod adresem 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Pożywka o obniżonej surowicy (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>319-85-070</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Penicylina i streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063 (Pen Strep)</td> <td>Rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Dharmafect2</td><td>GE Dharmacon</td><td>T-2002-02</td><td>Przechowywać w 4 &stopni; C</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>103056</td><td>Rozpuszczony w sterylnej destylowanej wodzie</td></tr><tr><td>Cdt1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 10</td></tr><tr><td>Hec1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 13</td></tr><tr><td>Komórki HeLa eksprymujące GFP-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komórki HeLa eksprymujące GFP-&alfa;-tubulinę i mCherry H2B</td><td>Hojny prezent od dr Kozo Tanaka z Tohoku uniwersytet, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>F8775</td><td>Toksyczny, wymaga ostrożności</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>D9542</td><td>Toksyczny, wymaga ostrożności</td></tr><tr><td>Mysia anty-&alfa;-tubulina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc32293</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Królik ant-Zwint1</td><td>Bethyl</td><td>A300-781A</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Mysi anty-fosfo-&gamma; H2AX (Ser139)</td><td>Upstate Biotechnology</td><td>05-626, klon JBW301</td><td>1:300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Rodamine Red-X</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>BioLite 6 well multidish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Szklane naczynie denne</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse TiE</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirująca tarcza do konfokalnego</td><td>Kamera Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra 888 EM-CCD Andor</td><td></td><td>iXon Ultra EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Laser o długości fali 4</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System inkubacji do mikroskopów</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS-elements</td><td>firmy Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Badanie różnych zdarzeń regulacyjnych cyklu komórkowego w sposób zależny od fazy dostarcza jasnego zrozumienia wzrostu i podziału komórek. Stwierdzono, że synchronizacja populacji komórek na określonych etapach cyklu komórkowego jest bardzo przydatna w takich eksperymentalnych przedsięwzięciach. Synchronizacja komórek poprzez leczenie substancjami chemicznymi, które są stosunkowo mniej toksyczne, może być korzystna w porównaniu ze stosowaniem farmakologicznych leków hamujących do badania następujących po sobie zdarzeń cyklu komórkowego i uzyskania specyficznego wzbogacenia wybranych etapów mitotycznych. W tym miejscu opisujemy protokół synchronizacji komórek ludzkich na różnych etapach cyklu komórkowego, w tym zarówno w fazie S, jak i w fazie M z procedurą podwójnej blokady i uwalniania tymidyny w celu zbadania funkcjonalności białek mitotycznych w wyrównaniu i segregacji chromosomów. Protokół ten okazał się niezwykle przydatny do badania mitotycznych ról wielofunkcyjnych białek, które mają ustalone funkcje interfazowe. W naszym przypadku mitotyczna rola Cdt1, białka krytycznego dla licencjonowania pochodzenia replikacji w fazie G1, może być skutecznie badana tylko wtedy, gdy Cdt1 specyficzny dla G2/M może zostać wyczerpany. Opisujemy szczegółowy protokół usuwania Cdt1 specyficznego dla G2/M przy użyciu podwójnej synchronizacji tymidyny. Wyjaśniamy również protokół utrwalania komórek i obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości po uwolnieniu tymidyny. Metoda jest również przydatna do analizy funkcji białek mitotycznych zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i zaburzonych, takich jak Hec1, składnik kompleksu Ndc80, ponieważ umożliwia uzyskanie dużych rozmiarów próbek komórek mitotycznych do analizy komórek stałych i żywych, jak pokazujemy tutaj.

Badanie progresji mitozy i stabilności mikrotubul w komórkach utrwalonych po zwolnieniu z podwójnej blokady tymidyną 
Białko Cdt1 bierze udział w licencjonowaniu miejsc inicjacji replikacji DNA w fazie G1. Jest ono degradowane podczas fazy S, a następnie ponownie akumuluje się w fazie G2/M. Aby zbadać jego rolę w mitozie, endogenne białko Cdt1 musi zostać usunięte specyficznie w fazie G/M przy użyciu najodpowiedniejszej techniki synchronizacji komórek – podwójnej bloka...

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie podwójnej synchronizacji tymidyny i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości do zbadania mitotycznych ról wielofunkcyjnych białek, które mogą posiadać krytyczne funkcje interfazowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, dotyczące tego, jak określić normalne funkcje białek zaangażowanych w cykl komórkowy i mitozę. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że komórki mogą utrzymać swoje normalne zachowanie fizjologiczne i że ta metoda jest również bardzo łatwa do wykonania.Tę procedurę zademonstruje dr Mohammed Amin, post-doc z mojego laboratorium, który jest ekspertem w stosowaniu tej metody. W przypadku utrwalonego obrazowania progresji komórek mitotycznych zacznij od wysiewu około dwóch razy 10 do piątych komórek HeLa do każdej studzienki sześciodołkowej płytki, zawierającej 70% etanol i sterylizowane UV szkiełko nakrywkowe oraz dwa mililitry pożywki DMEM. Po 24 godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych zablokuj komórki dwoma mililitrami świeżo rozcieńczonej tymidyny i świeżej pożywki na studzienkę i włóż płytkę z powrotem do inkubatora na kolejne 18 godzin.Następnego dnia umyj komórki dwa razy dwoma mililitrami PBS i raz świeżą pożywką o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na dziewięć godzin, aby uwolnić komórki z bloku, a następnie dodaj kolejne dwa mililitry pożywki uzupełnionej tymidyną na dołek. Po drugiej inkubacji blokującej umyj komórki dwa razy dwoma mililitrami PBS i raz dwoma mililitrami świeżej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodaj 100 nanomolowych świeżo przygotowanych siRNA do odpowiednich studzienek.Po dziewięciu do 10 godzinach odessać supernatant i przymocować komórki do szkiełek nakrywkowych z czteroprocentowym paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu PBS należy przepuszczać utrwalone komórki 0,5% detergentem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać dwa pięciominutowe prania w PBS. Zablokuj komórki jednym procentem BSA w PBS na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie oznacz komórki 50 mikrolitrami pierwotnych przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie w PBS i oznacz je 50 mikrolitrami odpowiednich przeciwciał drugorzędowych, które Cię interesują. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej umyj komórki dwa razy w PBS przez pięć minut każdego mycia i oznacz komórki DAPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Postępuj zgodnie z barwieniem DAPI za pomocą dwóch pięciominutowych płukań w PBS i użyj odpowiedniego podłoża montażowego, aby zamontować szkiełka nakrywkowe na poszczególnych przezroczystych szkiełkach mikroskopowych. Następnie, używając planowych apochromatycznych obiektywów zanurzeniowych DIC o aperturze numerycznej 60 lub 1,4 zamontowanych na odwróconym mikroskopie konfokalnym o wysokiej rozdzielczości wyposażonym w odpowiednią kamerę, uzyskaj obrazy białek barwionych immunologicznie w stosach Z o grubości 0,2 mikrometra. Do obrazowania żywych komórek progresji komórek mitotycznych, wysiewaj około 0,5 do jednego razy 10 do piątych komórek HeLa stabilnie eksprymujących mCherry H2B i alfa-tubulinę GFP do 35-mililitrowych naczyń ze szklanym dnem zawierających 1,5 mililitra pożywki DMEM.Hoduj komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny. Następnie tymidyna blokuje komórki dwa razy, jak właśnie pokazano, tym razem myjąc komórki dwa razy dwoma mililitrami PBS i jeden raz jednym mililitrem wstępnie podgrzanej pożywki DMEM na końcu każdego bloku tymidyny i traktując komórki siRNA po pierwszym bloku podczas pierwszego wymywania tymidyny. Hoduj komórki w świeżym, wstępnie podgrzanym podłożu Leibovitz, uzupełnionym 10% FBS i 20 milimolowymi HEPES, przez osiem godzin, aby uwolnić komórki z drugiego bloku.Następnie umieść pierwszą płytkę w komorze o kontrolowanej temperaturze mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości i użyj obiektywu 60 X i obrazowania w jasnym polu, aby ustawić ostrość komórek. Gdy komórki są widoczne, ręcznie dostosuj położenie płytki do wybranego obszaru i użyj oprogramowania do akwizycji obrazu, aby ustawić moc lasera i ekspozycję, parametry akwizycji obrazu i czas trwania eksperymentu. Wybierz odpowiednie filtry GFP i mCherry i wykonuj pulsacyjne obrazy światła przechodzącego i fluorescencji co 10 minut przez okres do 16 godzin, aby uzyskać poklatkowe obrazy procesu mitozy.Dziewięć godzin po uwolnieniu z podwójnego bloku tymidynowego uzyskaj obrazy w 12 odległych od siebie płaszczyznach z o długości jednego mikrometra. Następnie przeanalizuj obrazy, śledząc poszczególne komórki mitotyczne i użyj odpowiedniego oprogramowania źródłowego, aby zmontować odpowiedni film. Chociaż większość komórek siRNA kontrolnych i Cdt1 znajduje się w fazie metafazy po dziewięciu godzinach od uwolnienia z podwójnego bloku tymidyny, fiksacja po 10 godzinach ujawnia, że większość komórek traktowanych siRNA Cdt1 jest nadal zatrzymana w późnej prometafazie, podczas gdy komórki kontrolne wchodzą w anafazę i segregują swoje chromosomy zgodnie z oczekiwaniami.Leczenie zimnem dziewięć godzin po uwolnieniu z podwójnego bloku tymidynowego ułatwia utrzymanie stabilnych mikrotubul kinetochorowych, które są stosunkowo mniej wytrzymałe w komórkach zubożonych w Cdt1 w porównaniu z tymi w komórkach zubożonych w kontrolę. Licencjonowanie pochodzenia replikacji DNA nie jest zaburzone w komórkach zubożonych w Cdt1 lub kontrolnych podczas fazy G2-M, ponieważ nie stwierdzono, aby komórki te indukowały akumulację fosforalizowanego gamma H2AX, markera uszkodzenia DNA, podczas kolejnej fazy G2. Transfekcja Cdt1 siRNA kultur asynchronicznych indukuje jednak akumulację ognisk fosfo gamma H2AX dodatnich, prawdopodobnie z powodu uszkodzenia DNA wywołanego niewłaściwym licencjonowaniem replikacji DNA.Po rozpadzie otoczki jądrowej normalne komórki wchodzą w mitozę i przechodzą początek anafazy, aby wyjść z mitozy w ciągu około 30 do 60 minut. Knockdown Hec1 za pośrednictwem RNAi, kluczowego białka kinetochorowego niezbędnego do tworzenia silnego przyłączania mikrotubul kinetochoru, opóźnia jednak normalną progresję mitotyczną do początku anafazy lub wyjścia z mitozy nawet po kilku godzinach opóźnienia mitozy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podczas próby wykonania zabiegu należy pamiętać o całkowitym rozpuszczeniu tymidyny po rozmrożeniu jej z zamrażarki. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak western blotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są wzorce ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania podczas mitozy w porównaniu z interfazą? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do zbadania biogenezy nowotworów w modelach hodowli komórek ludzkich oraz do wykorzystania mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości do identyfikacji funkcji białek związanych z cyklem komórkowym.Nie zapominaj, że praca z odczynnikami takimi jak paraformaldehyd i DAPI może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.

combining-mitotic-cell-synchronization-high-resolution-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół obrazowania i kwantyfikacji czasu trwania mitozy w żywych komórkach ssaków hodowlanych po transfekcji siRNA.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Przejście z metafazy do anafazy jest inicjowane poprzez zależną od kompleksu anafazy-promującego (APC/C) ubikwitynację i następującą po niej degradację cykliny B. W niniejszej pracy opracowaliśmy system, który po zastosowaniu znakowania metodą pulse-chase umożliwia monitorowanie proteolizy cykliny B w całych populacjach komórek oraz ułatwia wykrywanie interferencji wywołanej przez punkt kontrolny mitozy.

Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Zgłaszamy dwa protokoły synchronizacji komórek, które dostarczają kontekstu do badania zdarzeń związanych z określonymi fazami cyklu komórkowego. Pokazujemy, że to podejście jest przydatne do analizy regulacji określonych genów w niezakłóconym cyklu komórkowym lub po ekspozycji na czynniki wpływające na cykl komórkowy.

Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

Ten protokół opisuje łatwą i wygodną metodę oznaczania i wizualizacji żywych chromosomów w komórkach mitotycznych za pomocą etykiety Histone2B-GFP BacMam 2.0 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę podwójnej synchronizacji tymidynowej komórek HeLa i mikroskopię konfokalną do badania ról mitotycznych wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Przeglądaj więcej filmów