Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy
December 5th, 2017
Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie podwójnej synchronizacji tymidyny i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości do zbadania mitotycznych ról wielofunkcyjnych białek, które mogą posiadać krytyczne funkcje interfazowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, dotyczące tego, jak określić normalne funkcje białek zaangażowanych w cykl komórkowy i mitozę. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że komórki mogą utrzymać swoje normalne zachowanie fizjologiczne i że ta metoda jest również bardzo łatwa do wykonania.
Tę procedurę zademonstruje dr Mohammed Amin, post-doc z mojego laboratorium, który jest ekspertem w stosowaniu tej metody. W przypadku utrwalonego obrazowania progresji komórek mitotycznych zacznij od wysiewu około dwóch razy 10 do piątych komórek HeLa do każdej studzienki sześciodołkowej płytki, zawierającej 70% etanol i sterylizowane UV szkiełko nakrywkowe oraz dwa mililitry pożywki DMEM. Po 24 godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych zablokuj komórki dwoma mililitrami świeżo rozcieńczonej tymidyny i świeżej pożywki na studzienkę i włóż płytkę z powrotem do inkubatora na kolejne 18 godzin.
Następnego dnia umyj komórki dwa razy dwoma mililitrami PBS i raz świeżą pożywką o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na dziewięć godzin, aby uwolnić komórki z bloku, a następnie dodaj kolejne dwa mililitry pożywki uzupełnionej tymidyną na dołek. Po drugiej inkubacji blokującej umyj komórki dwa razy dwoma mililitrami PBS i raz dwoma mililitrami świeżej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodaj 100 nanomolowych świeżo przygotowanych siRNA do odpowiednich studzienek.
Po dziewięciu do 10 godzinach odessać supernatant i przymocować komórki do szkiełek nakrywkowych z czteroprocentowym paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu PBS należy przepuszczać utrwalone komórki 0,5% detergentem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać dwa pięciominutowe prania w PBS. Zablokuj komórki jednym procentem BSA w PBS na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Następnie oznacz komórki 50 mikrolitrami pierwotnych przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie w PBS i oznacz je 50 mikrolitrami odpowiednich przeciwciał drugorzędowych, które Cię interesują. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej umyj komórki dwa razy w PBS przez pięć minut każdego mycia i oznacz komórki DAPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Postępuj zgodnie z barwieniem DAPI za pomocą dwóch pięciominutowych płukań w PBS i użyj odpowiedniego podłoża montażowego, aby zamontować szkiełka nakrywkowe na poszczególnych przezroczystych szkiełkach mikroskopowych. Następnie, używając planowych apochromatycznych obiektywów zanurzeniowych DIC o aperturze numerycznej 60 lub 1,4 zamontowanych na odwróconym mikroskopie konfokalnym o wysokiej rozdzielczości wyposażonym w odpowiednią kamerę, uzyskaj obrazy białek barwionych immunologicznie w stosach Z o grubości 0,2 mikrometra. Do obrazowania żywych komórek progresji komórek mitotycznych, wysiewaj około 0,5 do jednego razy 10 do piątych komórek HeLa stabilnie eksprymujących mCherry H2B i alfa-tubulinę GFP do 35-mililitrowych naczyń ze szklanym dnem zawierających 1,5 mililitra pożywki DMEM.
Hoduj komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny. Następnie tymidyna blokuje komórki dwa razy, jak właśnie pokazano, tym razem myjąc komórki dwa razy dwoma mililitrami PBS i jeden raz jednym mililitrem wstępnie podgrzanej pożywki DMEM na końcu każdego bloku tymidyny i traktując komórki siRNA po pierwszym bloku podczas pierwszego wymywania tymidyny. Hoduj komórki w świeżym, wstępnie podgrzanym podłożu Leibovitz, uzupełnionym 10% FBS i 20 milimolowymi HEPES, przez osiem godzin, aby uwolnić komórki z drugiego bloku.
Następnie umieść pierwszą płytkę w komorze o kontrolowanej temperaturze mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości i użyj obiektywu 60 X i obrazowania w jasnym polu, aby ustawić ostrość komórek. Gdy komórki są widoczne, ręcznie dostosuj położenie płytki do wybranego obszaru i użyj oprogramowania do akwizycji obrazu, aby ustawić moc lasera i ekspozycję, parametry akwizycji obrazu i czas trwania eksperymentu. Wybierz odpowiednie filtry GFP i mCherry i wykonuj pulsacyjne obrazy światła przechodzącego i fluorescencji co 10 minut przez okres do 16 godzin, aby uzyskać poklatkowe obrazy procesu mitozy.
Dziewięć godzin po uwolnieniu z podwójnego bloku tymidynowego uzyskaj obrazy w 12 odległych od siebie płaszczyznach z o długości jednego mikrometra. Następnie przeanalizuj obrazy, śledząc poszczególne komórki mitotyczne i użyj odpowiedniego oprogramowania źródłowego, aby zmontować odpowiedni film. Chociaż większość komórek siRNA kontrolnych i Cdt1 znajduje się w fazie metafazy po dziewięciu godzinach od uwolnienia z podwójnego bloku tymidyny, fiksacja po 10 godzinach ujawnia, że większość komórek traktowanych siRNA Cdt1 jest nadal zatrzymana w późnej prometafazie, podczas gdy komórki kontrolne wchodzą w anafazę i segregują swoje chromosomy zgodnie z oczekiwaniami.
Leczenie zimnem dziewięć godzin po uwolnieniu z podwójnego bloku tymidynowego ułatwia utrzymanie stabilnych mikrotubul kinetochorowych, które są stosunkowo mniej wytrzymałe w komórkach zubożonych w Cdt1 w porównaniu z tymi w komórkach zubożonych w kontrolę. Licencjonowanie pochodzenia replikacji DNA nie jest zaburzone w komórkach zubożonych w Cdt1 lub kontrolnych podczas fazy G2-M, ponieważ nie stwierdzono, aby komórki te indukowały akumulację fosforalizowanego gamma H2AX, markera uszkodzenia DNA, podczas kolejnej fazy G2. Transfekcja Cdt1 siRNA kultur asynchronicznych indukuje jednak akumulację ognisk fosfo gamma H2AX dodatnich, prawdopodobnie z powodu uszkodzenia DNA wywołanego niewłaściwym licencjonowaniem replikacji DNA.
Po rozpadzie otoczki jądrowej normalne komórki wchodzą w mitozę i przechodzą początek anafazy, aby wyjść z mitozy w ciągu około 30 do 60 minut. Knockdown Hec1 za pośrednictwem RNAi, kluczowego białka kinetochorowego niezbędnego do tworzenia silnego przyłączania mikrotubul kinetochoru, opóźnia jednak normalną progresję mitotyczną do początku anafazy lub wyjścia z mitozy nawet po kilku godzinach opóźnienia mitozy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas próby wykonania zabiegu należy pamiętać o całkowitym rozpuszczeniu tymidyny po rozmrożeniu jej z zamrażarki. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak western blotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są wzorce ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania podczas mitozy w porównaniu z interfazą? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do zbadania biogenezy nowotworów w modelach hodowli komórek ludzkich oraz do wykorzystania mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości do identyfikacji funkcji białek związanych z cyklem komórkowym.
Nie zapominaj, że praca z odczynnikami takimi jak paraformaldehyd i DAPI może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje stosowanie podwójnej synchronizacji tymidyną komórek HeLa, po której następuje analiza za pomocą mikroskopii konfokalnej wysokiej rozdzielczości. Takie podejście umożliwia badanie mitoticznych ról białek wielofunkcyjnych, które mają również funkcje interfazowe.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Regulacja cyklu komórkowego
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Zrozumienie cyklu komórkowego jest kluczowe dla wnikliwego rozumienia funkcji komórkowych.
- Białka wielofunkcyjne odgrywają znaczące role zarówno podczas interfazy, jak i mitozy.
- Techniki obrazowania wysokiej rozdzielczości są niezbędne do obserwacji procesów komórkowych.
- Podwójna synchronizacja tymidyną jest metodą uzyskania zsynchronizowanych populacji komórek.
Cel badania
- Badanie mitoticznych ról białek o funkcjach interfazowych.
- Zgłębienie rozumienia normalnych funkcji białek zaangażowanych w postęp cyklu komórkowego.
- Demonstracja skutecznej metody badania dynamiki cyklu komórkowego.
Stosowane metody
- Siew komórek HeLa w sześciu dołkach płytki.
- Blokowanie komórek za pomocą tymidyny w celu synchronizacji cyklu komórkowego.
- Zastosowanie mikroskopii konfokalnej wysokiej rozdzielczości do obrazowania.
- Zachowanie normalnego fizjologicznego zachowania komórek podczas procedury.
Główne wyniki
- Sukces w synchronizacji komórek HeLa od fazy S do mitozy.
- Jasna wizualizacja procesów mitoticznych za pomocą mikroskopii konfokalnej.
- Wgląd w role białek wielofunkcyjnych podczas podziału komórkowego.
- Demonstrowana łatwość wykonania metody synchronizacji.
Wnioski
- Metoda podwójnej synchronizacji tymidyną jest skuteczna w badaniu dynamiki cyklu komórkowego.
- To podejście umożliwia badanie funkcji białek w mitozie.
- Wysokiej rozdzielczości obrazy dostarczają cennych danych na temat procesów komórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to isolate mitotic functions of multifunctional proteins that also regulate interphase processes, reducing target validation ambiguity. By synchronizing cell populations and applying high-resolution confocal microscopy, researchers obtain quantitative, phase-specific data essential for mechanistic de-risking in early discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by distinguishing mitotic from interphase roles, informing go/no-go decisions in oncology and cell cycle-targeted therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by isolating mitotic roles of proteins with dual interphase/mitotic functions.
- Operational Value: Enables functional target validation through phase-specific perturbation and imaging.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying whether observed phenotypes stem from mitotic or interphase activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized mitotic cell populations for consistent, reproducible compound or siRNA screening.
- Quantitative Output: Enables measurement of mitotic progression, chromosome alignment, and segregation defects as assay endpoints.
- Scalability: Compatible with high-resolution imaging platforms for multi-well format adaptation and large sample acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Mitotic defects observed in synchronized cells model chromosomal instability relevant to cancer phenotypes.
- Translational Continuity: Links discovery-phase target validation to preclinical models via conserved mitotic mechanisms.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight to prioritize targets with reduced likelihood of on-target interphase toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing mitotic-specific functional data before compound screening or phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling conditional depletion and visualization of protein function in defined mitotic stages.
- Screening: Generates standardized, synchronized mitotic cells suitable for assay-dependent readouts like kinetochore-microtubule stability or anaphase timing.
- Analytics: Delivers quantitative imaging metrics (e.g., metaphase-to-anaphase transition, kinetochore fiber intensity) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects mitotic protein function to chromosomal stability phenotypes with relevance to preclinical cancer models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable synchronization and imaging workflow applicable across multiple targets in the cell cycle and mitosis space.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by separating mitotic from interphase protein functions.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible cell preparation and imaging compatible with confocal microscopy workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing phase-resolved functional data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by identifying proteins with selective mitotic roles and lower interphase liability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture synchronization, siRNA transfection, and immunofluorescence or live-cell imaging protocols.
- Depends on access to high-resolution confocal microscopy with Z-stack capability and appropriate laser/filter sets for GFP, mCherry, and DAPI.
- Necessitates standardization of thymidine block/release timing and fixation/permeabilization conditions across users and cell lines.
- Adaptation to non-HeLa systems may require optimization of synchronization efficiency and mitotic marker expression.
- Practical limitations include the need for careful toxin handling (paraformaldehyde, DAPI) and potential siRNA off-target effects requiring controls.
