Name: Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych płuc myszy oniskim poziomie CD45 Hoechst (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: Poznaj izolację mezenchymalnych komórek macierzystych płuc myszy metodą cytometrii przepływowej. Protokół obejmuje trawienie tkanki, sortowanie CD45- i hodowlę kolonii do badań regeneracji płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantów przyznanych SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Dodatkowe wsparcie zapewnili: DW: NIH RO1DK075013, DDK oraz Fundacja Kleberg; UCCC Flow Cytometry Core (NIH 5 P30 CA 46934-15), UCCC Microarray core (NCI P30 CA 46934-14).

1. Izolacja płuc
<ol>
<li>Uśmierć dorosłe myszy (wiek 8-10 tygodni; masa 18-20 g; szczep C57Bl6J) poprzez podanie przedawkowanej dawki izofluranu, a następnie przeprowadź upuszczenie krwi, stosując technikę sterylną. Profile mogą się nieznacznie różnić w zależności od szczepu.</li>
<li>Chirurgicznie usuń przeponę, otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając klatkę żebrową bocznie po każdej stronie ciała myszy. Wypłucz krew z płuc, delikatnie perfundując prawą komorę serca przy użyciu 3-5 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).</li>
<li>Wypreparuj płaty płuc, usuwając tchawicę i główne oskrzela, a następnie umieść je w szalce Petriego wypełnionej zbuforowanym roztworem soli Hanksa (HBSS). Po zebraniu wszystkich płatów płuc, za pomocą pęsety przenieś tkankę na pokrywkę szalki. Następnie posiekaj tkankę na małe kawałki za pomocą jednorazowych skalpeli, dodając tyle cieczy, aby utrzymać je w wilgoci, ale nie na tyle dużo, aby kawałki unosiły się i przemieszczały.</li>
<li>Wypreparuj kończynę tylną jednej z myszy i wyizoluj szpik kostny, aby użyć go jako kontroli barwienia do ustawienia bramkowania w cytometrii przepływowej. Zabarw szpik kostny (BM) zgodnie z wcześniej opisaną procedurą 1.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki płucnej
<ol>
<li>Każde płuco poddaje się trawieniu, stosując zoptymalizowany stosunek masy tkanki do objętości wynoszący 0,2g: 5mls podgrzanego do 37°C 0,2% kolagenazy typu 2 Worthington (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ; cat # LS004202) rozpuszczonej w sterylnym HBSS. Mieszaninę zanurza się w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 30 min 2,3. </li>
<li>Próbkę należy dokładnie triturować, aż trawiona tkanka płucna będzie swobodnie przepływać przez pipetę 10ml (około 10 powtórzeń). Inkubować przez dodatkowe 15 min w temperaturze 37°C, aby dokończyć trawienie tkanki i zapewnić bardziej jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
<li>Zawiesinę komórek płuc rozcieńczyć HBSS i triturować pipetą 5ml, aby rozproszyć pozostałe fragmenty tkanki. </li>
<li>Zawiesinę przefiltrować przez sitko komórkowe 70μM, aby usunąć nietrawione fragmenty tkanki. Na tym etapie próbkę można rozdzielić do kilku probówek stożkowych, aby zapobiec przeciążeniu jednego sitka komórkowego i skrócić czas procesu. </li>
<li>Zawiesinę komórkową wirować przez 10 min przy 1500 rpm, a następnie odlać nadsącz.</li>
<li>Osad komórkowy delikatnie resuspendować w buforze do lizy RBC w temperaturze pokojowej (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dodać równą objętość HBSS, aby dezaktywować bufor do lizy, a następnie przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 40μM w celu usunięcia zanieczyszczeń i agregatów komórkowych.</li>
<li>Odpipetować 10μl każdej próbki przeznaczonej do barwienia i policzyć liczbę komórek dla próbek płuc i szpiku kostnego (BM) za pomocą hemocytometru. Uwaga: należy zapisać całkowitą objętość zawiesiny komórek.</li>
<li>Zawiesinę pojedynczych komórek płuc sfałdować przez wirowanie przy 1500 rpm przez 10 min.</li>
<li>Resuspendować komórki płuc i szpiku kostnego do stężenia 1x106 komórek/ml w podgrzanym (37°C) DMEM+ (Dulbecco's modified Eagle's medium, high glucose (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092) zawierającym 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10mM HEPES.</li>
<li>Przygotować roztwór zapasowy barwnika Hoechst 33342 o stężeniu 1mg/ml (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO; cat # B2261) w wodzie i poddać sterylizacji filtracyjnej 1,4. Barwnik Hoechst można przechowywać w formie alikwotów w temperaturze -80°C. </li>
<li>Do zawiesiny pojedynczych komórek dodać barwnik Hoechst 33342 do stężenia końcowego 5μg/ml (rozcieńczenie 200x roztworu zapasowego 1mg/ml).</li>
<li>Komórki wymieszać poprzez delikatne odwracanie probówki i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez dokładnie 90 minut. </li>
</ol>
3. Barwienie i przygotowanie zawiesiny komórek płuc do analizy cytometrii przepływowej
<ol>
<li>Po 90 min wszystkie etapy z komórkami płuc barwionymi Hoechstem muszą być przeprowadzane w temperaturze 4°C lub na lodzie, aby zapobiec wypływowi barwnika. Osadź komórki poprzez wirowanie przy 1500 rpm przez 10 min w 4°C i resuspenduj je w lodowatym buforze do barwienia (PBS+2%FBS). </li>
<li>Resuspenduj komórki do stężenia nieprzekraczającego 1x107 komórek/probówkę, używając 300-600μl PBS zawierającego 2% FBS i 10mM HEPES. </li>
<li>Do próbek płuc i szpiku kostnego (BM) dodaj odpowiednio miareczkowane przeciwciało CD45 (zazwyczaj rozcieńczenie 1:200 CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; kat. nr 559864). Inkubuj na lodzie przez 10-15 min. Uwzględnienie niebarwionej kontroli podczas procedury eksperymentalnej jest przydatne do ustawienia bram analizy.</li>
<li>Osadź komórki w 4°C przez 5 min przy 1500 rpm. Odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 500 μl schłodzonego buforu do barwienia (PBS+2%FBS). Przenieś je do schłodzonych polipropylenowych probówek z zakrętką typu snap cap (Fisherbrand, Schaumburg, IL; kat. nr 14-956-1D).</li>
<li>Do próbek dodaj jodek propidyny (PI, stężenie zapasu 200μg/ml w PBS) do uzyskania stężenia końcowego 2μg/ml, aby wykluczyć martwe komórki. PI należy stosować w połączeniu z barwnikiem Hoechst 33342, aby uzyskać prawidłowy profil fluorescencji podczas analizy cytometrycznej.</li>
<li>Przechowuj probówki na lodzie, chroniąc je przed światłem do czasu analizy cytometrycznej.</li>
</ol>
4. Analiza cytometryczna w celu zdefiniowania i wyizolowania populacji mezenchymalnych komórek macierzystych płuc (lung MSC) z wykorzystaniem wypływu barwnika Hoechst do detekcji populacji bocznej (SP)
<ol>
<li>Analiza ta wymaga następujących instrumentów:
 <ul>
 <li>lasery 488 nm i UV (350–355 nm)</li>
 <li>2 detektory na drodze wiązki lasera UV z filtrami niebieskim (450/65) i czerwonym (675/50).</li>
 <li>Detektor UV-czerwony musi charakteryzować się wysoką czułością na sygnał czerwony. Może to stanowić problem w przypadku starszych sorterów komórek.</li>
 <li>Chłodziarka do utrzymania próbki w temperaturze 5-10°C.</li>
 </ul>
</li>
<li>Zjustować lasery i przygotować urządzenie do sortowania komórek zgodnie z protokołem producenta. </li>
<li>Należy zebrać sygnały Hoechst w kanale czerwonym (oś x) i niebieskim (oś y), korzystając ze skali liniowej. </li>
<li>Należy dostosować napięcia lamp fotopowielaczy tak, aby peak G0/G1 znajdował się w górnej prawej części środka wykresu, co umożliwi odpowiednie wyświetlenie populacji krawędzi opadającej. Część fazy S oraz cała faza G2 cyklu komórkowego mogą znajdować się poza skalą w górnym prawym rogu wykresu. Sygnał niebieski jest stosunkowo jasny, natomiast sygnał czerwony jest słaby. Typowe napięcia dla urządzenia MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) wynoszą 425 dla kanału niebieskiego i 650 dla kanału czerwonego. </li>
<li>Martwe komórki są odrzucane (wykluczane z analizy) poprzez bramkowanie za pomocą PI. Można zastosować standardową ścieżkę detekcji PI (wzbudzenie 488 nm, emisja 630 nm). Alternatywnie PI jest wzbudzane przez laser UV, a populacja martwych komórek znajduje się poza skalą, po prawej stronie wykresu populacji bocznej (SP). Eliminuje to konieczność kompensacji sygnału PI względem innych fluorochromów, takich jak FITC i PE. Pierwotna metoda Goodella opierała się na tej drugiej procedurze. 5-7.</li>
<li>Podczas analizy i sortowania należy utrzymywać stosunkowo niską różnicę ciśnień, aby zapewnić wysoką rozdzielczość populacji bocznej (side population). </li>
<li>SP przejawia się jako boczna odgałęzienie oddzielone od głównej populacji komórek płuc. Populację tę określa się mianem Hoechstniski.</li>
<li>Barwnik HoechstniskiPróbkę /SP analizuje się w celu oddzielenia populacji CD45-dodatnich i CD45-ujemnych przy użyciu histogramu 2,3 (Rycina 1).</li>
<li>Po selekcji i bramkowaniu sygnału HoechstniskiCD45negatywny populacja MSC płuc: komórki można zebrać poprzez sortowanie w postaci populacji mieszanej do probówki lub pojedynczych komórek w celu izolacji klonów do płytki 96-dołkowej 3. </li>
<li>W przypadku sortowania do płytek odchylenie strumienia sortowania ustawia się na 25%, aby uzyskać bardziej pionowy strumień sortowania niż ten zazwyczaj stosowany przy sortowaniu do probówek. </li>
<li>Skalibruj kierunek strumienia sortującego, wysyłając impuls testowy do studni w lewym górnym, a następnie w prawym dolnym rogu płytki 96-dołkowej.</li>
<li>Skonfiguruj mapę płytek w oprogramowaniu sortera w taki sposób, aby do każdej dołki naniesiono pożądaną liczbę komórek.</li>
<li>Aby wyizolować klony pojedynczych komórek, pojedynczą MSC z płuc sortuje się do dołka płytki 96-dołkowej zawierającej 150μl pożywek hodowlanych (α-MEM uzupełniony o 20% FBS). Po sortowaniu dodatkowe 100μl dodaje się pożywki.</li>
</ol>
5. Izolacja, hodowla i charakterystyka MSC płuc oraz ich klonów
<ol>
<li>Kultywowanie i ekspansja mieszanej populacji MSC płuc oraz klonów pojedynczych komórek po sortowaniu odbywają się w identyczny sposób przy zastosowaniu standardowych warunków hodowli (37°C, 5% CO2 i &gt;95% wilgotności). Po izolacji komórki pozostawia się na 16 godzin w celu umożliwienia adhezji. Pożywkę wymienia się co 48 godzin (α-MEM uzupełniony o 20% FBS). Gdy komórki zaczynają szybciej proliferować i osiągają od 75-80% konfluencji, wykonuje się pasaż (Rysunek 2).</li>
<li>Komórki płucze się uprzednio ogrzanym HBSS i inkubuje z 0,5% trypsyną/EDTA (Cellgro, Manassas, VA; kat. nr 25-053-Cl) w temperaturze 37°C przez mniej niż 2 min. Komórki monitoruje się za pomocą mikroskopu odwróconego, aby potwierdzić powstanie zawiesiny komórkowej.</li>
<li>MSC płuc są następnie dzielone w stosunku 1:2 lub 1:3, w zależności od aktualnego tempa proliferacji hodowli.</li>
<li>Dla każdej preparacji komórkowej ocenia się zdolność MSC płuc do różnicowania się w tradycyjne linie mezenchymalne osteoblastów, adipocytów i chondrocytów oraz ich powierzchniową ekspresję uznanych markerów mezenchymalnych. Wykonuje się również analizę prążkowania cytogenetycznego w celu potwierdzenia braku poważnych aberracji chromosomalnych 2,3,8-11.</li>
</ol>
6. Liczenie MSC płuc z wykorzystaniem testu tworzenia kolonii (CFU-F)
<ol>
<li>Rozcieńczyć komórki w pożywce Complete MesenCult (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) do końcowego stężenia 1x106 komórek/ml. </li>
<li>Wyonać rozcieńczenia szeregowe, aby uzyskać w szalce 100mm końcowe liczby komórek wynoszące 6x104 komórek, 3x104 komórek, 1,5 x104 komórek oraz 0,75 x104 komórek w 10ml pożywki. Analizy przeprowadza się w duplikacie lub triplikacie dla każdego stężenia komórek; można je przeskalować dla mniejszych powierzchni. </li>
<li>Kulturować komórki przez 10 dni w standardowych warunkach. W 10. dniu komórki przepłukać PBS i utrwalić za pomocą 100% metanolu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. </li>
<li>Wykryć kolonie CFU-F poprzez barwienie 0,4% w/v roztworem barwiącym Giemsy (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) rozcieńczonym 1:20 wodą dejonizowaną. Pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu i określić liczbę kolonii zawierających więcej niż 25 komórek na kolonię (Rycina 3). </li>
</ol>
7. Analiza właściwości immunomodulacyjnych MSC z płuc w odniesieniu do proliferacji i apoptozy limfocytów T
<ol>
<li>6,25x104 komórek MSC z płuc wysiewa się do płytek 96-dołkowych i pozostawia na noc 2.</li>
<li>Komórki CD4+ ze śledzion śledziony myszy transgenicznych z receptorem limfocytów T (TCR), linii OT-II z limfocytami T rozpoznającymi peptyd owalbuminy 323-339, są oczyszczane poprzez usuwanie komórek CD8+, CD19+, MHC-II+ oraz CD25+ przy użyciu sortera komórek Miltenyi AutoMACS (Miltenyi, Auburn, CA). Komórki prezentujące antygen (APC) są izolowane poprzez pozytywną selekcję komórek MHC-II+ 12.</li>
<li>Komórki APC utrwala się w 4% paraformaldehydzie, przemywa 3 razy w PBS/5% BSA/2mM EDTA i obciąża 0,5μg/ml lub 5μg/ml peptydu OVA323.</li>
<li>Symulowane, zablokowane w fazie wzrostu APC dodaje się do komórek MSC z płuc w płytkach 96-dołkowych.</li>
<li>Oczyszczone w ponad 95% komórki CD4+ w ilości 1x105 znakuje się 5μM karboksyfluoresceiny z estrem sukcynimidylowym (CFSE; Sigma, St.Louis MO) w PBS, inkubuje przez 5 min w ciemności, przemywa PBS-5% BSA, a następnie dodaje do komórek APC i MSC z płuc w pożywce DMEM 5% FBS. Komórki inkubuje się następnie przez 96 godzin.</li>
<li>Limfocyty T barwi się następnie przeciwciałami anty-CD40 (Cy5), CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue), Vbeta 5 (PE) i analizuje przy użyciu 7-kanałowego cytometru przepływowego Miltenyi MacsQuant (Miltenyi, Aurburn, CA) oraz oprogramowania analitycznego FloJo (Treestar, Ashland, OR). Proliferację mierzy się jako spadek średniej intensywności fluorescencji CFSE w porównaniu do tła, czyli limfocytów T znakowanych CFSE i nieeksponowanych na APC (Rycina 4). W tym czasie zlicza się limfocyty T i ocenia ich żywotność metodą wykluczenia błękitu trypanu.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig1.jpg" alt="Wykresy analizy cytometrii przepływowej ilustrujące różnicowanie populacji komórek i poziomy ekspresji CD45." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Analiza cytometryczna i definicja MSC płuc. Pojedyncze zawiesiny komórek z digestu tkanki płucnej są barwione Hoechst 33342 i analizowane metodą cytometrii przepływowej w celu wykrycia różnic w A. rozproszeniu przednim (FSC) i bocznym (SSC) oraz B. fluorescencji niebieskiej i czerwonej Hoechst. Obecność populacji bocznej (SP) jest widoczna w bramce. Następnie analizowana jest populacja SP Hoechstlow w celu wyodrębnienia C. populacji CD45negatywnej MSC płuc. Stosunki populacji CD45 dodatniej do negatywnej w SP płuc wynoszą zazwyczaj 70:30 / 60:40.
<img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Porównanie hodowli komórkowych na obrazie mikroskopowym; A: odizolowane komórki, B: tworzenie sieci fibroblastów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Izolacja i hodowla MSC z płuc. Po zebraniu MSC z płuc metodą sortowania komórek, komórki wysiewa się do szalek 30 mm w pożywce α-MEM uzupełnionej o 20% FBS. A. Świeżo posortowane komórki są małe, okrągłe i jasne. B. Po około 2-3 tygodniach pojawiają się kolonie o fenotypie mezenchymalnym, a proliferacja staje się bardziej wyraźna. 
<img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Analiza hodowli komórkowych; obrazy mikroskopowe; szalka Petriego, wzrost kolonii komórek, paski skali do pomiaru." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Wyznaczanie liczby MSC za pomocą testu CFU-F (zdolności do tworzenia kolonii fibroblastycznych). Namnożone MSC z płuc zostają wysiane zgodnie z opisanym protokołem testu CFU-F. A. Po 10 dniach i barwieniu metodą Giemsy widoczne są kolonie. B. Kolonie są duże i składają się z kilkuset komórek. C. Komórki wykazują fenotyp mezenchymalny. A i B, Pasek skali = 0.5 cm; C Pasek skali = 0.14 cm.
<img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej, wykres kropkowy, limfocyty T, APC, wpływ MSC z płuc, schemat ekspresji CFSE vs CD40." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Test proliferacji limfocytów T oparty na CFSE. Wobec braku MSC z płuc i w obecności komórek prezentujących antygen (APC) +/- owalbuminy (OVA), CD40dodatnie efektorowe limfocyty T wykazują spadek intensywności CFSE, co wskazuje na proliferację (czerwone koło). Intensywność fluorescencji CFSE w błonie limfocytów T maleje stechiometrycznie przy każdym podziale komórki, tj. z każdym podziałem. W obecności MSC z płuc, APC +/- OVA, CD40dodatnie efektorowe limfocyty T nie wykazują istotnych zmian w intensywności CFSE, co wskazuje na brak proliferacji (czerwone koło).

<ol><li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
<li>Jun, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathology+of+Bleomycin+Induced+Fibrosis+is+Associated+with+Loss+of+Resident+Lung+Mesenchymal+Stem+Cells+Which+Regulate+Effector+T-Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation.</a> STEM CELLS. , (2011).</li>
<li>Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).</li>
<li>Majka, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+populations+in+skeletal+muscle+are+bone+marrow+derived+and+exhibit+different+cell+fates+during+vascular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).</li>
<li>Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodell%2C+MA+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22">Basic Cell Culture Protocols</a>. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).</li>
<li>Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Isolation+of+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Expression+of+an%5BTitle%5D)+AND+%22Abcg2%2FGFP+Allele.+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an.</a> Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).</li>
<li>Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).</li>
<li>Chateauvieux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profile+of+mouse+stromal+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells.</a> Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).</li>
<li>Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-hematopoietic+bone+marrow+stem+cells%3A+Molecular+control+of+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation.</a> Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).</li>
<li>Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).</li>
<li>Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Adult+Mouse+Lung+Mesenchymal+Progenitor+Cell+Population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).</li>
<li>Waid, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+T+cell+subset+described+as+CD4loCD40%2B+T+cells+%28TCD40%29+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes.</a> Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zaadaptowaliśmy metodę początkowo stosowaną do identyfikacji komórek krwiotwórczych szpiku kostnego (BM), aby wyizolować specyficzną populację rezydentnych MSC płuc. Dzięki powtarzalności izolacji, komórki te zostały następnie dokładnie scharakteryzowane jako MSC. Ich pochodzenie zdefiniowano jako rezydentne w płucach dorosłej myszy (w przeciwieństwie do pochodzenia z BM), a ich profil fenotypowy i molekularny został udokumentowany 2. Zdolność do wielokrotnej izolacji tej scharakteryzowanej populacji umożliwia dalsze badanie biologicznego znaczenia i roli MSC płuc podczas homeostazy tkankowej oraz w przebiegu chorób. Niedawne zdefiniowanie tej populacji in vivo zarówno w tkance płucnej mysiej, jak i ludzkiej, ułatwia opracowanie strategii terapeutycznej ukierunkowanej na aktywację endogennych komórek w celu wspierania regeneracji płuc podczas urazów i chorób.

<table><tbody><tr><td>Bufor fosforanowo-solny (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>0,2% kolagenaza Worthington typu 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004202</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy erytrocytów</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;barwnik chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81845</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30265.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-069</td><td></td></tr><tr><td>0,5% trypsyny/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Pełna pożywka MesenCult</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>0,4% w/v roztwór barwiący Giemsy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GS1L</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>16% paraformaldehyd rozcieńczono do stężenia 4% przy użyciu buforu PBS</td></tr><tr><td>Karboksyfluoresceina z estrem sukcynimidylowym (CFSE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja &amp;#38; charakterystyka barwnika hoechstniski cd45ujemny mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Mezchymalne komórki macierzyste (MSC) rezydujące w tkankach są istotnymi regulatorami naprawy lub regeneracji tkanek, włóknienia, stanu zapalnego, angiogenezy oraz tworzenia się guzów. Wspólnie badania te sugerują, że rezydujące w płucach MSC odgrywają rolę w homeostazie tkanki płucnej, w procesach uszkodzenia i naprawy podczas przebiegu takich chorób jak włóknienie płuc (PF) i nadciśnienie tętnicze płucne (PAH). W niniejszej pracy opisujemy technologię służącą do zdefiniowania populacji rezydujących w płucach MSC. Definiowanie tej populacji in vivo w tkance płucnej przy użyciu określonego zestawu markerów ułatwia powtarzalną izolację dobrze scharakteryzowanej populacji komórek macierzystych za pomocą cytometrii przepływowej oraz badanie specyficznego typu i funkcji komórkowej.

W niniejszym artykule prezentujemy izolację mysich rezydentnych mezenchymalnych komórek macierzystych płuc (lung MSC), ich ekspansję, charakterystykę oraz analizę właściwości immunomodulacyjnych.

Izolacja &amp;#38; Charakterystyka barwnika Hoechstniski CD45ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy

Tkankowe mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są istotnymi regulatorami naprawy lub regeneracji tkanek, włóknienia, stanu zapalnego, angiogenezy oraz nowotworów...

Niniejszy film prezentuje protokół izolacji gospodarczych mezenchymalnych komórek macierzystych płuc o niskiej ekspresji CD 45 (CD 45-). Tkankowe mezenchymalne komórki macierzyste, lub MSC, są istotnymi regulatorami naprawy lub regeneracji tkanek, włóknienia, stanu zapalnego oraz angiogenezy. W pierwszej kolejności płuca zostają wypreparowane z uśpionej myszy.Tkanka płucna zostaje poddana trawieniu w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki są barwione barwnikiem żywotności oraz przeciwciałami anty-CD 45, a następnie poddane sortowaniu metodą cytometrii przepływowej w celu wyizolowania CD 45-ujemnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) płuc gospodarza. Następnie MSC płuc są namnażane w hodowli, a w celu oceny ich zdolności do różnicowania przeprowadzany jest test tworzenia kolonii.Następnie można przeprowadzić dalsze badania w celu sprawdzenia roli MSC w homeostazie tkanek oraz w przebiegu chorób. Przedstawiona tutaj metoda może być wykorzystana do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych płuc myszy lub człowieka i może zostać zastosowana w badaniach nad chorobami płuc, takimi jak włóknienie płuc, nadciśnienie płucne oraz POChP. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na różnorodność dostępnych metod przygotowania tkanek, a także kwestie konfiguracji cytometru przepływowego, doboru odpowiednich kontroli i analizy danych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ trudno jest opisać za pomocą samych słów właściwą technikę siekania i trawienia tkanki płucnej w celu uzyskania optymalnej żywotności komórek. Ponadto konfiguracja urządzenia do cytometrii przepływowej oraz analiza danych są najlepiej przekazywane poprzez demonstrację. Rozpocznij ten protokół od usunięcia płuc, które zostaną wykorzystane do pozyskania mezenchymalnych komórek macierzystych, z uśmierconej dorosłej myszy.Za pomocą małych, ostrych nożyczek należy przeciąć klatkę piersiową myszy bocznie po każdej stronie. Po otwarciu jamy klatki piersiowej należy usunąć przeponę. Do prawej komory serca wprowadzić strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 20,5 gauge i delikatnie nacisnąć tłok, aby przepłukać ją 3–5 ml PBS, usuwając krew z płuc.Następnie za pomocą nożyczek odetnij tchawicę i główny oskrzele i je usuń. Następnie używając pęsety, pobierz małe białe płaty płuc i umieść je w szalce Petriego wypełnionej zbuforowanym roztworem soli Hanksa lub HBSS.Następnie usuń serce i oddziel płaty płuc. Powtórz tę procedurę u wszystkich myszy biorących udział w badaniu. Przenieś płaty płuc na pokrywkę naczynia.Nawilż tkankę niewielką ilością HBSS, aby zapobiec jej wysychaniu. Następnie, używając jednorazowego skalpela, posiekaj płaty płuc, aby uzyskać szpik kostny do wykorzystania jako kontrola dodatnia w cytometrii przepływowej. Użyj ostrych nożyczek, aby przeciąć tkankę w okolicy kostki oraz górnej części kości udowej.Umieść kończynę w nowej szalce Petriego. Następnie odetnij kolano, pozostawiając liniowy fragment kości udowej oraz drugi fragment zawierający kość piszczelową i strzałkową. Za pomocą pęsety usuń mięśnie, aby odsłonić kość piszczelową, strzałkową i udową.Następnie należy wziąć strzykawkę o pojemności 5 ml z igłą o rozmiarze 26,5 G i wprowadzić igłę do otworu szpiku kostnego. Trzymając kość za jeden koniec piszczeli, należy skierować drugi koniec do probówki stożkowej o pojemności 50 ml wypełnionej 15 ml HBSS, a następnie nacisnąć tłok, aby podać HBSS i wypłukać szpik kostny do probówki. Proces ten należy powtórzyć dla kości strzałkowej oraz udowej.Zbarw szpik kostny barwnikiem host 3 3 3 4 2 w końcowym stężeniu 5 µg/mL w suplementowanym DMEM z wysoką zawartością glukozy. Następnie z wyizolowanej tkanki płuc zostanie przygotowana zawiesina pojedynczych komórek. Umieść każde płuco w probówce zawierającej podgrzany 0,2% Worthington.Kollagenazę typu dwa przygotowano w sterylnym roztworze HBSS, następnie probówkę zanurzono w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubowano przez 30 minut. Po inkubacji, za pomocą pipety 10 ml, homogenizowano próbkę przez triturację do momentu, aż materiał trawiony będzie swobodnie przepływał przez pipetę. Powtórzono tę czynność około 10 razy, a następnie inkubowano przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 37 °C, aby całkowicie strawić tkankę.Po zakończeniu trawienia rozcieńczyć zawiesinę komórkową za pomocą HBSS i ponownie użyć pipety pięciomililitrowej, aby rozbić wszelkie pozostałe fragmenty tkanki. Następnie, w celu usunięcia nietrawionych fragmentów tkanki, przelać zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Zawiesinę należy dodawać małymi porcjami, aby próbka mogła swobodnie przepłynąć przez sitko komórkowe.Jeśli nieprzetrawione fragmenty tkanek całkowicie zablokują przepływ zawiesiny komórkowej, należy przelać ją przez nowy sitko komórkowe do nowej probówki. Zawiesinę komórkową należy odwirować przez 10 minut przy 450 RCF.Po wirowaniu odlej nadsącz i delikatnie zawieś osad komórkowy w buforze do lizy erytrocytów w temperaturze pokojowej, inkubując przez pięć minut. Następnie dodaj taką samą objętość HBSS, aby dezaktywować bufor do lizy.Przelej zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 µm w celu usunięcia zanieczyszczeń i agregatów komórkowych, zbierając przefiltrowany materiał do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie, używając komory licznikowej (hemocytometru), wyznacz liczbę komórek dla próbek z płuc oraz szpiku kostnego. Zapisz stężenie i całkowitą objętość zawiesiny komórkowej.Następnie odwiruj zawiesinę pojedynczych komórek płuc przy 450 RCF przez 10 minut, aby uzyskać osad. W celu podtrzymania żywotności komórek, resuspenduj jednocześnie komórki płuc i szpiku kostnego w stężeniu 10⁶ komórek/ml w uprzednio ogrzanym, uzupełnionym wysokoglukozowym DMEM.Aby zabarwić DNA, należy dodać barwnik HOAXED 3 3 3 4 2 do stężenia końcowego 5 µg/L. Następnie komórki należy wymieszać przez delikatne odwracanie probówek i inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez dokładnie 90 minut. Po tym czasie należy odwirować próbki przez 10 minut przy 450 ×g w temperaturze 4 °C.Przejdź do barwienia tkanki płuc i szpiku kostnego przeciwciałem anty-CD 45 oraz jodkiem propidyny w ramach przygotowania do analizy metodą cytometrii przepływowej. Po zabarwieniu komórek przechowuj probówki w lodzie, chroniąc je przed światłem, aż do momentu przeprowadzenia analizy cytometrycznej. Przygotuj aparat do cytometrii przepływowej, upewniając się, że lasery instrumentu są skalibrowane, a urządzenie jest ustawione do sortowania komórek.Użyte urządzenie musi być wyposażone w lasery: niebieski 488 nanometr, czerwony 635 nanometr oraz UV 350 do 355 nanometr, z dwoma detektorami na drodze wiązki lasera UV z filtrami niebieskim 45 over 65 i czerwonym 6 75 over 50. Dodatkowo detektor UV czerwony musi charakteryzować się wysoką czułością na sygnał czerwony, a urządzenie musi być wyposażone w chłodziarkę w celu utrzymania próbki w temperaturze 10 stopni Celsjusza. W oprogramowaniu urządzenia należy skonfigurować wykresy histogramów w celu wyświetlenia liniowego rozproszenia przedniego (forward scatter) względem bocznego (side scatter) oraz wykres dyskryminacji dubletów odpowiedni dla danego instrumentu.Wykres histogramu dla PI z użyciem sygnału logarytmicznego, wykres czerwony przeciwko niebieskiemu z użyciem sygnałów liniowych oraz wykres histogramu dla CD 45 A PC z użyciem sygnału logarytmicznego. Gdy instrument będzie gotowy, umieść zbarwioną próbkę szpiku kostnego w porcie załadowczym urządzenia. Próbka ta służy jako kontrola barwienia oraz kalibracji instrumentu.Rozpocznij zbieranie zdarzeń i dostosuj liniowe sygnały rozproszenia przedniego (forward scatter) oraz rozproszenia bocznego (side scatter). Aby wyraźnie zwizualizować populację komórek, powinny one znajdować się mniej więcej w dolnej środkowej części wykresu, gdzie rozproszenie przednie stanowi oś x. Ponieważ barwnik jądrowy PI przenika przez błonę komórkową, będzie on wykluczony z komórek żywych.Wyznacz obszar bramkowania dla martwych komórek wykazujących pozytywny sygnał PI na histogramie PI. W oprogramowaniu urządzenia ustaw kolor czerwony dla komórek znajdujących się w tej bramce.Pomocne jest wykorzystanie zabarwionych na kolor martwych komórek jako punktu orientacyjnego do zidentyfikowania populacji G0/G1 gospodarza. Barwnik PI jest również wzbudzany przez laser UV i większość martwych komórek powinna znajdować się poza skalą. Po prawej stronie wykresu fluorescencji czerwonej względem niebieskiej gospodarza, populacja G0/G1 szpiku kostnego powinna być widoczna jako gęsty skupiony zbiór zdarzeń na wykresie fluorescencji czerwonej względem niebieskiej gospodarza.Dostosuj napięcia detektorów tak, aby klaster G0/G1 znajdował się w górnej prawej części środka wykresu. Część fazy S oraz cała faza G2 cyklu komórkowego mogą wykraczać poza skalę. W prawym górnym rogu wykresu red versus blue, populacja boczna (side population) będzie widoczna jako ślad ciągnący się od lewej strony klastra G0/G1 w dół, do lewego dolnego rogu wykresu.Następnie wyznacz bramkę wokół skupiska komórek na wykresie FSC względem SSC. Wyznacz populację singletów zidentyfikowaną na wykresie dubletów oraz żywe komórki na histogramie PI. Następnie przypisz wykres hoax tak, aby wyświetlał tylko te wyselekcjonowane populacje.Po wyznaczeniu bramkowania na wykresie głównym, obrysuj obszar wokół populacji bocznej (side population). Przypisz ten obszar jako bramkę do histogramu CD 45 A PC wraz z bramkami dla singletów rozpraszania światła oraz żywych komórek. Po skonfigurowaniu systemu wyjmij próbkę z portu załadowczego i umieść w nim próbkę płuca.Ustawienia instrumentu nie powinny wymagać ponownej korekty dla tej próbki. Rozpocznij zbieranie zdarzeń na wykresie hoax czerwony kontra niebieski. Grupa G zero G one dla próbki płuca zazwyczaj wydaje się bardziej wydłużona wzdłuż osi x i przypomina symbol tyldy na klawiaturze.Bramka dla populacji bocznej (side population) powinna znajdować się w pozycji zbliżonej do tej ustawionej dla próbki szpiku kostnego. Niezbędne mogą być niewielkie korekty w górę lub w dół, aby zapewnić wysoką rozdzielczość populacji bocznej. Podczas sortowania należy utrzymać niską różnicę ciśnień, upewniając się, że zawór przepływu próbki nie jest zbyt szeroko otwarty.Aby wyizolować MSC, należy umieścić płytkę kolekcjonacyjną z 96 dołkami w komorze sortowania, a następnie ustawić bramki sortowania na histogramie CD 45 A PC, aby oddzielić populację pozytywną od negatywnej. Na koniec należy zebrać komórki albo jako populację mieszaną do probówki, albo jako pojedyncze komórki do płytki 96-dołkowej w celu izolacji klonów. Po zebraniu MSC z płuc metodą sortowania komórek, komórki wysiewa się do naczyń 30 mm, stosując pożywkę A MEM uzupełnioną o 20% FBS. Początkowo posortowane komórki wydają się małe, okrągłe i jasne; proces ten trwa około dwóch do trzech tygodni.Kolonie o fenotypie mezenchymalnym stają się widoczne, a proliferacja jest bardziej wyraźna dla każdej preparacji komórkowej. Oceń zdolność MSC z płuc do różnicowania się w tradycyjne linie mezenchymalne osteoblastów, adipocytów i chondrocytów oraz ekspresję przyjętych markerów mezenchymalnych na ich powierzchni komórkowej. Przeprowadź analizę pasmowania cytogenetycznego, aby potwierdzić brak poważnych nieprawidłowości chromosomowych.Po izolacji metodą cytometrii przepływowej i wygenerowaniu klonów pojedynczych komórek, przeprowadza się test tworzenia kolonii w celu scharakteryzowania komórek MSC oraz ich zdolności do różnicowania. Należy rozpocząć od komórek rozcieńczonych do stężenia 3 × 10⁴ komórek na mililitr. W szalkach 100 mm z niepełną pożywką kul, wykonuje się rozcieńczenia seryjne: 2,6 × 10⁴, 3 × 10⁴, 1,5 × 10⁴ oraz 0,75 × 10⁴ komórek na szalkę w 10 ml pożywki, w trzech powtórzeniach.Następnie, po 10 dniach hodowli, umieść płytki w inkubatorze, odlej pożywkę i wypłucz komórki za pomocą PBS. Następnie utrwal je, dodając 100% methanol przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach odlej methanol.Następnie, aby wykryć tworzenie kolonii, należy dodać 0,4% w/v gza rozcieńczonego w wodzie zjonizowanej w stosunku 1:20 i inkubować przez 10 do 15 minut. Następnie zlać barwnik i wypłukać wodą zjonizowaną. Pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu, a następnie określić liczbę kolonii zawierających więcej niż 25 komórek na kolonię, używając mikroskopu odwróconego lub wizualizacji.Kolonie są duże i składają się z kilkuset komórek, jak pokazano tutaj, oraz wykazują fenotyp mezenchymalny. MSC zostały wyizolowane zgodnie z instrukcją w tym filmie i wysiane na płytkach 96-dołkowych w celu symulacji wzrostu. Następnie do MSC z płuc dodano zatrzymane w rozwoju komórki prezentujące antygen znakowane CFSE.Proliferację izolowanych MSCs zmierzono następnie jako spadek średniej intensywności fluorescencji CFSE w porównaniu do tła, którym były same komórki T znakowane CFSE, jak pokazano na tej figurze, w nieobecności komórek SC płuc i w obecności komórek prezentujących antygen, APC plus minus albuminy OVA CD 40 dodatnich efektorowych komórek T, które wykazują spadek intensywności CFSE, co wskazuje na proliferację zaznaczoną na czerwono. Intensywność fluorescencji CFSE błony komórkowej komórek T spada geometrycznie przy każdym podziale komórki, tj. o połowę przy każdym podziale. W obecności płucnych MSC APC plus minus OVA CD 40 dodatnich efektorowych komórek T nie wykazano istotnej zmiany intensywności CFSE, co wskazuje na brak proliferacji po ich rozwoju. Technika ta otworzyła badaczom z dziedziny biologii macierzystych komórek płuc drogę do zbadania roli mezenchymalnych komórek macierzystych w chorobach płuc, takich jak nadciśnienie tętnicze płuc i włóknienie płuc.Po opanowaniu tej techniki, postępowanie zgodnie z opisaną procedurą zajmuje około pięciu godzin. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania można przeprowadzić inne metody, takie jak testy różnicowania, aby sprawdzić, czy domniemandane mezenchymalne komórki macierzyste płuc wykazują odpowiednie różnicowanie wieloliniowe oraz potencjał do przekształcania się w kość, tłuszcz i chrząstkę.

isolation-characterization-hoechstlow-cd45negative-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja & Charakterystyka Hoechstlow CD45negative komórek mezenchymalnych płuc mysich

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) szczura wyizolowano z kości udowych i piszczeli, a następnie wzbogacono za pomocą magnetycznej separacji komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych w posortowanych komórkach potwierdzono metodą cytometrii przepływowej. Komórki te hodowano również w gęstości klonalnej w celu utworzenia pojedynczych kolonii, które następnie oddzielono za pomocą cylindrów do klonowania.

Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Opisujemy tutaj izolację wykazujących ekspresję CD133 komórek macierzystych wątroby oraz nowotworowych komórek macierzystych z całej wątroby mysiej, co jest procesem wymagającym trawienia tkanki, wzbogacania frakcji komórkowej oraz izolacji metodą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy metody zaawansowanej izolacji pojedynczych komórek oraz ekspansji klonalnej.

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Ten protokół opisuje technikę izolacji w celu uzyskania pierwotnych mezenchymalnych komórek zrębu rezydujących w płucach od szczurów, poprzez zastosowanie trawienia enzymatycznego, separacji gradientu gęstości, przylegania plastiku i selekcji kulek magnetycznych CD146+.

Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc rezydentnych CD146 + z płuc szczura

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Poznaj izolację mezenchymalnych komórek macierzystych płuc myszy metodą cytometrii przepływowej. Protokół obejmuje trawienie tkanki, sortowanie CD45- i hodowlę kolonii do badań regeneracji płuc.

Izolacja & Charakterystyka barwnika Hoechst^niski CD45^ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy

Przeglądaj więcej filmów

Izolacja & Charakterystyka barwnika Hoechstniski CD45ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy

Przeglądaj więcej filmów

Izolacja & Charakterystyka barwnika Hoechst^niski CD45^ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy