Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych płuc myszy o^{niskim poziomie} CD45 Hoechst

Ten film przedstawia protokół izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych płuc o niskim poziomie CD 45 ujemnym. Mezenchymalne komórki macierzyste rezonansu tkankowego (MSC) są ważnymi regulatorami naprawy lub regeneracji tkanek, zwłóknienia, stanu zapalnego i angiogenezy. Najpierw płuca są wycinane z myszy złożonej w ofierze.

Tkanka płucna jest trawiona w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Komórki są barwione matrycą mistyfikacyjną i CD 45 i sortowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu uzyskania MSC płuc o niskim poziomie CD 45 ujemnym dla gospodarza. MSCs płuc są następnie namnażane w hodowli i przeprowadzany jest test tworzenia kolonii w celu oceny zdolności różnicowania MSC.

Następnie można przeprowadzić dalsze badania w celu zbadania roli MSCs podczas homeostazy tkanek i choroby. Metoda, którą tutaj pokazujemy, może być wykorzystana do wyizolowania mysich lub ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych płuc i może być zastosowana w tym badaniu chorób płuc, takich jak zwłóknienie płuc, nadciśnienie płucne i POChP. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności ze względu na różnorodność dostępnych metod przygotowania tkanek, a także ustawienia cytometru przepływowego, odpowiednich kontroli i analizy.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ trudno jest opisać właściwą technikę mielenia i trawienia tkanki płucnej w celu uzyskania optymalnej żywotności komórek za pomocą samych słów. Również konfiguracja przyrządu do cytometrii przepływowej i analizy są najlepiej przekazywane poprzez demonstrację. Rozpocznij ten protokół od usunięcia płuc, które zostaną użyte do uzyskania mezenchymalnych komórek macierzystych od ofiarowanej dorosłej myszy.

Użyj małej pary ostrych nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową z boku po każdej stronie myszy. Otwórz jamę klatki piersiowej, a następnie wyjmij membranę. Włóż 10-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 20 i pół do prawej komory serca i delikatnie naciśnij tłok, aby przelać go trzema do pięciu mililitrów PBS, wypłukując krew z płuc.

Następnie za pomocą nożyczek odetnij tchawicę i duże oskrzela i wyrzuć je. Następnie za pomocą kleszczy. Podnieś małe białe płatki płuc i umieść je na szalce Petriego wypełnionej buforowaną solą fizjologiczną hanka lub HBSS.

Następnie wyjmij serce i oddziel płaty płuc. Powtórz ten proces dla wszystkich myszy biorących udział w badaniu. Przenieś płaty płuc na pokrywkę naczynia.

Zwilż tkankę tylko taką ilością HBSS, aby nie wyschły. Następnie za pomocą jednorazowego skalpela zmiel płaty płuc, aby uzyskać szpik kostny, aby użyć kontroli podtrzymującej do cytometrii przepływowej. Użyj ostrych nożyczek, aby przeciąć kostkę i górną część kości udowej.

Umieść kończynę na nowej szalce Petriego. Następnie odetnij kolano, pozostawiając liniowy kawałek kości udowej i drugi kawałek zawierający kość piszczelową i strzałkową. Za pomocą kleszczy oderwij mięsień, aby odsłonić kość piszczelową, strzałkową i udową.

Teraz weź pięciomililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 26 i pół i włóż igłę do otworu szpiku kostnego. Na jednym końcu kości piszczelowej przytrzymaj kość z drugim końcem skierowanym do 50-mililitrowej stożkowej rurki wypełnionej 15 mililitrami HBSS i naciśnij tłok, aby dozować HBSS i przepłukać szpik kostny do probówki. Powtórz ten proces z kością strzałkową i udową.

Wybarwić szpik kostny żywicielem 3 3 3 4 2 umrzeć w końcowym stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr w uzupełnionym DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Następnie z wyizolowanej tkanki zostanie wygenerowana jednokomórkowa zawiesina tkanki płucnej. Umieść każde płuco w probówce zawierającej prewarm.0.2%Worthington.

Typ drugi kolagenaza Przygotowana w sterylnym HBSS, następnie zanurz probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez 30 minut. Po inkubacji użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby rozdrobnić próbkę, aż trawienie będzie łatwo przepływać przez pipetę. Około 10 powtórzeń inkubuje się przez dodatkowe 15 minut, w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zakończyć trawienie tkankowe.

Po zakończeniu trawienia rozcieńczyć zawiesinę komórkową HBSS i użyć pięciomililitrowej pipety do ponownego tri w celu rozproszenia wszelkich pozostałych fragmentów tkanki. Następnie, aby usunąć niestrawione fragmenty tkanki, przelej zawiesinę przez sitko do komórek o średnicy 70 mikromolów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodawaj zawiesinę po trochu, aby próbka mogła przepłynąć przez sitko do komórek.

Jeśli niestrawione fragmenty tkanek całkowicie blokują przepływ zawiesiny komórkowej. Przelej przez nowe sitko do komórek do nowej probówki. Osadzać zawiesinę komórek przez 10 minut przy 450 RCF.

Po odwirowaniu zdekantować supernatant i delikatnie zawiesić osad ogniwa w temperaturze pokojowej. Bufor do lizy czerwonych krwinek, inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj równą objętość HBSS, aby dezaktywować bufor do lizy.

Wlej zawiesinę komórek do 40-milimolowego sitka komórkowego, aby usunąć zanieczyszczenia i agregaty komórek, zbierając przepływ w nowej stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Następnie za pomocą hemocytometru określ liczbę komórek zarówno w próbkach płuc, jak i szpiku kostnego. Zanotować stężenie i całkowitą objętość zawiesiny komórek.

Następnie zawiesinę pojedynczej komórki płuc osadzać przez odwirowanie w temperaturze 450 RCF przez 10 minut. Aby podtrzymać komórki, należy zawiesić jednocześnie zarówno płuca, jak i komórki szpiku kostnego. 10 do sześciu komórek na mililitr w wstępnie uzupełnionym DMEM o wysokiej zawartości glukozy.

Aby zabarwić DNA, dodaj barwnik HOAXED 3 3 3 4 2 do końcowego stężenia pięciu mikrogramów na litr. Następnie wymieszaj komórki przez delikatne odwrócenie i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza dokładnie przez 90 minut. Następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 450 G w czterech stopniach Celsjusza po odwirowaniu.

Kontynuuj barwienie tkanki płuc i szpiku kostnego anty CD 45 i jodkiem propidyny w ramach przygotowań do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Po zabarwieniu komórek należy przechowywać probówki na lodzie chronionym przed światłem do czasu przeprowadzenia analizy cytometrii przepływowej. Przygotuj się do cytometrii przepływowej, upewniając się, że lasery instrumentów są wyrównane i że są one ustawione do sortowania komórek.

Używany instrument musi być wyposażony w niebieskie lasery 488 nanometrów, czerwone 635 nanometrów i UV od 350 do 355 nanometrów z dwoma detektorami na ścieżce lasera UV z filtrami niebieskimi 45 na 65 i czerwonymi 6 75 na 50. Ponadto detektor UV czerwony musi mieć wysoką czułość na sygnał czerwony, a przyrząd musi być wyposażony w agregat chłodniczy do utrzymywania próbki w temperaturze 10 stopni Celsjusza. W oprogramowaniu przyrządu skonfiguruj wykresy histogramu, aby wyświetlić liniowy rozrzut do przodu i boczny, wykres dyskryminacji dubletów odpowiedni dla instrumentu.

Wykres histogramu liczby liczby osób przy użyciu sygnału logarytmicznego, wykres czerwonego i niebieskiego wybrzeża przy użyciu sygnałów liniowych oraz wykres histogramu CD 45 A PC przy użyciu sygnału logarytmicznego. Gdy instrument jest gotowy, umieść wybarwioną próbkę szpiku kostnego w porcie ładowania instrumentu. Ta próbka jest używana jako kontrola barwienia i ustawiania instrumentu.

Rozpocznij zbieranie zdarzeń i dostosuj sygnały liniowe do przodu wewnątrz rozproszenia. Aby wyraźnie zobrazować populację komórek, komórki powinny znajdować się w przybliżeniu w dolnej środkowej części wykresu rozproszenia do przodu jako oś x. Ponieważ plama jądrowa PI jest przepuszczalna dla błony IMP, zostanie wykluczona z żywych komórek.

Narysuj obszar chodu na martwych komórkach PI dodatnich na histogramie PI. Poinstruuj oprogramowanie instrumentu, aby pokolorowało martwe komórki. W tej bramie czerwony.

Pomocne jest użycie wentylowanych kolorem martwych komórek jako nawigatora do identyfikacji populacji gospodarza G zero G. Barwienie PI jest również wzbudzane przez laser UV, a większość martwych komórek powinna znajdować się poza skalą. Po prawej stronie czerwonego i niebieskiego wykresu fałszywej fluorescencji, populacja G zero G jeden szpiku kostnego powinna być postrzegana jako ścisły zbiór zdarzeń na czerwonym i niebieskim wykresie fałszywym.

Dostosuj napięcie detektora, aby umieścić klaster G zero G one w prawym górnym rogu środka na powierzchni. Część fazy S i cała G2 cyklu komórkowego może być poza skalą. W prawym górnym rogu czerwonego i niebieskiego wykresu mistyfikowanego, boczne hosty populacji o niskiej populacji będą widoczne ciągnące się od lewej strony klastra G zero G one w dół do lewego dolnego rogu wykresu.

Teraz narysuj bramkę wokół klastra komórek w FSC w porównaniu z SSC. Wykreśl populację singletów zidentyfikowaną na wykresie dubletowym i żywe komórki na histogramie PI. Następnie przypisz wykres mistyfikacji tak, aby wyświetlał tylko te populacje bramkowane.

Po bramkowaniu wykresu hosta narysuj region wokół populacji bocznej. Przypisz ten obszar jako bramkę do histogramu CD 45 A PC wraz z singletem rozpraszania światła i bramkami komórek na żywo. Teraz, gdy system jest skonfigurowany, wyjmij próbkę z portu ładowania i umieść próbkę płuc w porcie ładowania.

Dla tego sample nie powinno być konieczne ponowne dostosowywanie ustawień przyrządu. Zacznij zbierać wydarzenia na wątku oszustwa czerwona kontra niebieska. Klaster G zero G one dla próbki płuc zwykle wydaje się bardziej wydłużony w kierunku osi x i przypomina symbol tyldy na klawiaturze.

Niska mistyfikacja chodu populacyjnego bocznego powinna znajdować się w podobnej pozycji, jak ustawiona dla próbki szpiku kostnego. Te niewielkie korekty w górę lub w dół mogą być konieczne, aby zapewnić ścisłą rozdzielczość populacji bocznej. Utrzymuj niską różnicę ciśnień podczas sortowania, upewniając się, że zawór przepływu próbki nie jest zbyt mocno otwarty.

Obok izolacji MSC umieść 96-dołkową płytkę zbiorczą w komorze sortowania i ustaw bramki sortowania na histogramie CD 45 A PC, aby oddzielić populację dodatnią i negatywną. Na koniec zbierz komórki jako populację mieszaną do probówki lub pojedynczych komórek, aby wyizolować klony na 96-dołkowej płytce po pobraniu MSC płuc przez sortowanie komórek, komórki są siane w 30-milimetrowych szalkach przy użyciu A MEM uzupełnionego 20% FBS. Po pierwsze, posortowane komórki wydają się małe, okrągłe i jasne po około dwóch do trzech tygodniach.

Kolonie z fenotypem mezenchymalnym stają się widoczne, a proliferacja jest bardziej oczywista dla każdego preparatu komórkowego. Oceń zdolność MSC płuc do różnicowania się w tradycyjne mezenchymalne linie osteoblastów, adipocytów i chondrocytów oraz ich powierzchniową ekspresję akceptowanych markerów mezenchymalnych. Wykonaj analizę cytogenetyczną, aby potwierdzić brak poważnych nieprawidłowości chromosomowych.

Po wyizolowaniu za pomocą cytometrii przepływowej i wygenerowaniu klonów pojedynczych komórek, przeprowadza się test tworzenia kolonii w celu scharakteryzowania komórek MSC i ich zdolności różnicowania. Zacznij od komórek rozcieńczonych trzy razy 10 z czterech komórek na mililitr. Niekompletną pożywkę kulową w 100-milimetrowych szalkach, wykonać rozcieńczenie zboża dwa, sześć razy 10 z czterech, trzy razy 10 z czterech, 1,5 razy 10 do czterech i 0,75 razy 10 do czterech komórek na szalkę w 10 mililitrach pożywki w trzech egzemplarzach.

Następnie po 10 dniach hodowli umieścić płytki w inkubatorze, odlać pożywkę i przepłukać komórki PBS. Następnie napraw je, dodając 100% metanol przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach odlej metanol.

Następnie, aby wykryć tworzenie się kolonii, dodaj 0,4% wagowo gza rozcieńczonego od 1 do 20 w inkubacji zjonizowanej wody przez 10 do 15 minut. Następnie odlej plamę i spłucz zjonizowaną wodą. Pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu i określić ilościowo liczbę kolonii zawierających więcej niż 25 komórek na kolonię za pomocą odwróconego mikroskopu lub wizualizacji.

Kolonie są duże i składają się z kilkuset komórek, jak pokazano tutaj, i wykazują fenotyp mezenchymalny. MSC wyizolowano, jak pokazano na tym filmie, i posiano w 96 dołkach symulujących wzrost. Zatrzymane komórki prezentujące antygen znakowane CFSE zostały następnie dodane do MSCs płuc.

Proliferację izolowanych MSCs mierzono następnie jako spadek średniej intensywności fluorescencji CFSE w porównaniu z tłem, które było samymi limfocytami T znakowanymi CFSE, jak pokazano na tym rysunku, przy braku SC płuc i obecności komórek prezentujących antygen, A PC plus minus O albumina CD 40 dodatnie skuteczne limfocyty T wykazują spadek intensywności CFSE, co oznacza proliferację zakreśloną na czerwono. Intensywność fluorescencji CFSE błony komórek T zmniejsza się ekonometrycznie przy każdym podziale komórki, IE o połowę przy każdym podziale w obecności płuc M-S-C-A-P-C plus minus OVA CD 40 dodatnich dotkniętych limfocytów T nie wykazuje znaczącej zmiany intensywności CFSE, co wskazuje na brak proliferacji Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych płuc do zbadania roli mezenchymalnych komórek macierzystych w chorobach płuc, takich jak tętnicze nadciśnienie płucne i zwłóknienie płuc.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około pięciu godzin po tej procedurze. Inne metody, takie jak testy różnicowania, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, w tym czy domniemane mezenchymalne komórki macierzyste płuc wykazują odpowiednie zróżnicowanie wieloliniowe, potencjał do tłuszczu kostnego i chrząstek.