Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego odbicia wewnętrznego do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych

Zacznij od naczynia ze szklanym dnem zawierającego embrionalne neurony korowe na etapie całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia lub mikroskopu TIRF.

Neurony te wyrażają wrażliwe na pH zielone białko fluorescencyjne lub marker pęcherzykowy znakowany GFP, który fluoryzuje w neutralnym pH zewnątrzkomórkowym, ale pozostaje niefluorescencyjny w kwaśnych pęcherzykach.

Po zespoleniu pęcherzyków z błoną plazmatyczną, wystawienie na zewnątrzkomórkowe pH indukuje fluorescencję, zaznaczając zdarzenie egzocytozy.

Wybierz obiektyw i ustaw współczynnik załamania światła tak, aby pasował do neuronu.

Skieruj wiązkę lasera pod kątem do szkła, co powoduje całkowite wewnętrzne odbicie i generuje falę ulotną. Fala ta selektywnie wzbudza markery GFP w pobliżu błony plazmatycznej.

Ustaw głębokość penetracji TIRF, aby wykluczyć znaczniki GFP powyżej pola ulotnego.

Po pierwsze, użyj szerokokątnego oświetlenia epifluorescencyjnego, aby zlokalizować neurony wyrażające GFP.

Następnie przełącz się na oświetlenie TIRF w celu wzbudzenia specyficznego dla błony.

Uzyskaj obrazy poklatkowe, aby zarejestrować zdarzenie fuzji pęcherzyków i uwidocznić egzocytozę.

Po skonfigurowaniu mikroskopu TIRF i próbki oraz znalezi