Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego odbicia wewnętrznego do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych

Zacznij od naczynia ze szklanym dnem zawierającego embrionalne neurony korowe na etapie całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia lub mikroskopu TIRF.

Neurony te wyrażają wrażliwe na pH zielone białko fluorescencyjne lub marker pęcherzykowy znakowany GFP, który fluoryzuje w neutralnym pH zewnątrzkomórkowym, ale pozostaje niefluorescencyjny w kwaśnych pęcherzykach.

Po zespoleniu pęcherzyków z błoną plazmatyczną, wystawienie na zewnątrzkomórkowe pH indukuje fluorescencję, zaznaczając zdarzenie egzocytozy.

Wybierz obiektyw i ustaw współczynnik załamania światła tak, aby pasował do neuronu.

Skieruj wiązkę lasera pod kątem do szkła, co powoduje całkowite wewnętrzne odbicie i generuje falę ulotną. Fala ta selektywnie wzbudza markery GFP w pobliżu błony plazmatycznej.

Ustaw głębokość penetracji TIRF, aby wykluczyć znaczniki GFP powyżej pola ulotnego.

Po pierwsze, użyj szerokokątnego oświetlenia epifluorescencyjnego, aby zlokalizować neurony wyrażające GFP.

Następnie przełącz się na oświetlenie TIRF w celu wzbudzenia specyficznego dla błony.

Uzyskaj obrazy poklatkowe, aby zarejestrować zdarzenie fuzji pęcherzyków i uwidocznić egzocytozę.

Po skonfigurowaniu mikroskopu TIRF i próbki oraz znalezieniu neuronalnej płaszczyzny ogniskowej zgodnie z protokołem tekstowym, uruchom oprogramowanie lasera i połącz się z oprogramowaniem sterującym laserem. Ustaw oświetlenie na szerokie pole i wybierz obiektyw. Następnie ustaw współczynnik załamania światła próbki i dostosuj intensywność lasera, odznaczając TTL dla lasera 491.

Optymalizacja parametrów obrazowania jest ważna podczas obrazowania nienaruszonych pęcherzyków egzocytarnych dna, aby uniknąć dryftu ostrości i fototoksyczności przy jednoczesnym wytwarzaniu obrazów o wysokim stosunku sygnału do szumu, wystarczającym do analizy.

Ustaw suwak w pozycji 100, a następnie zmniejsz go z powrotem do wartości z zakresu od 20 do 40. Następnie ponownie sprawdź czas wygaśnięcia. Następnie ponownie skoncentruj się na próbce w oświetleniu światłem przechodzącym.

Następnie w oprogramowaniu do obrazowania wybierz oświetlenie laserowe 491 i otwórz migawkę. Umieść kondensator do góry nogami na stole optycznym, aby nie porysować obiektywu. Precyzyjnie wyreguluj ogniskową lasera na suficie.

A po wyjęciu skraplacza wyśrodkuj punkt do środka membrany zamkniętego pola. Następnie wymień skraplacz. W oprogramowaniu TIRF ustaw głębokość penetracji na 110 nanometrów. Następnie przełącz się z oświetlenia szerokokątnego na tryb oświetlenia TIRF w celu obrazowania.

Teraz, używając epifluorescencji szerokokątnej, znajdź komórki wyrażające floriny VAMP2 przez okulary. Następnie, aby zmniejszyć fotowybielanie i fototoksyczność, dostosuj parametry obrazowania, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu i zakres dynamiczny przy minimalnym czasie ekspozycji i intensywności lasera. Ustaw ciągły autofokus na komórkę. Następnie utwórz zestaw zdjęć poklatkowych, w którym akwizycja odbywa się co 0,5 sekundy przez 5 minut.