Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

Rozpocznij od mikroskopu z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencyjnym (TIRF) z zakrytą komorą obrazowania zawierającą szklane szkiełko nakrywkowe z przylegającymi ludzkimi komórkami nerwiaka zarodkowego w buforze.

Komórki te wyrażają fluorofory specyficzne dla błon pęcherzyków synaptycznych.

W trybie epifluorescencji wybierz komórkę do obrazowania.

W trybie TIRF przez obiektyw skieruj laser na próbkę, pojawiając się jako plamka na okładce.

Dostosuj kąt, aby przekroczyć kąt krytyczny na granicy faz między szkiełkiem nakrywkowym o wysokim współczynniku załamania światła a próbką o niższym współczynniku załamania światła, powodując całkowite wewnętrzne odbicie (TIR), widziane jako cienka linia.

TIR generuje ulotną falę, która wzbudza fluorofory na najbliższej błonie.

Emitowana fluorescencja jest zbierana przez obiektyw i rejestrowana przez kamerę.

, aby uzyskać obraz błony komórkowej o wysokim kontraście w pobliżu szkiełka nakrywkowego.

Zoptymalizuj ustawienia akwizycji, aby zminimalizować fotowybielanie i ustawić częstotliwość próbkowania.

Rozpocznij obrazowanie TIRF, aby uwidocznić połączone pęcherzyki synaptyczne.

W trybie epifluorescencji skup się na szkiełku nakrywkowym i wybierz transfekowane komórki umieszczone w środku komory. Pod kontrolą oprogramowania przełącz się na oświetlenie murawy w trybie na żywo. Aby ustawić konfigurację murawy, sprawdź położenie belki wychodzącej z obiektywu na pokrywie próbki. Gdy wiązka jest umieszczona w środku soczewki obiektywu, w środku pokrywy próbki darni widoczna jest plamka, a komórka jest obrazowana w trybie epifluorescencji.

Aby osiągnąć kąt krytyczny, przesuń skupione miejsce w kierunku Y za pomocą regulacji kąta na suwaku murawy. Gdy wiązka zbiega się na płaszczyźnie próbki pod kątem większym niż kąt krytyczny, plamka znika, a na środku okładki próbki widoczna jest prosta, cienka, skupiona linia. Aby dostroić kąt murawy, użyj próbki komórki.

Obejrzyj obraz fluorescencji na filmie. Na tym etapie nadal widoczny jest obraz podobny do epifluorescencji. Delikatnie przesuwaj, aż do uzyskania stanu murawy. W tym przypadku tylko jedna płaszczyzna optyczna komórki jest ostra, co daje płaski obraz o wysokim kontraście.

Aby wykonać obrazowanie próbki, ustaw eksperyment poklatkowy z jednym kanałem. Odpowiednie czasy naświetlania wynoszą od 40 do 80 milisekund. Rejestruj obrazy z częstotliwością próbkowania 1 lub 2 Hz.