Mapowanie losu pojedynczej komórki u danio pręgowanego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykonanie mapowania losów i śledzenia linii wybranych pojedynczych komórek w zarodkach danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez chemiczne sprzężenie fluoresceiny w klatce z dekstranem o dużej masie cząsteczkowej. Następnie przygotowany w klatce dekstran fluoresceinowy jest mikrowstrzykiwany do zarodków danio pręgowanego, który następnie jest fotoaktywowany w wybranych komórkach za pomocą absorpcji dwóch fotonów.

Po fotoaktywacji zarodków przeprowadza się analizę immunohistochemiczną w celu wykrycia dekstranu fluoresceinowego bez klatkowania w celu mapowania losów aktywowanych komórek. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do określenia wkładu linii i lokalizacji tkankowej pojedynczych komórek aktywowanych foto. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak standardowa mikroskopia fluorescencyjna, jest to, że można ją wykorzystać do różnicowego znakowania pojedynczych komórek w celu mapowania wiary.

Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak to, w jaki sposób niezróżnicowane komórki prekursorowe mogą przyczyniać się do różnych typów tkanek, Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy montowania zarodka i aktywacji zdjęć są trudne do nauczenia się na podstawie samego opisu tekstowego. Zanim zaczniesz, zsyntetyzuj dekstran fluoresceinowy w klatce i przechowuj go w tubkach pokrytych folią metalową. Następnie mikroiniekcję zarodków na etapie od jednej do dwóch komórek za pomocą zsyntetyzowanego dekstranu fluoresceiny w klatce.

Gdy zarodki osiągną odpowiedni etap rozwoju, należy je pokryć. Następnie zamontuj powlekane zarodki w aeros o niskiej temperaturze topnienia w celu aktywacji zdjęcia. Gdy powstanie, zastygnie, załaduj oprogramowanie LSM five 10.

Umieść przezroczysty żółty filtr na ścieżce wiązki światła białego, a następnie wybierz opcję Skanuj nowy obraz i kliknij przycisk Uruchom tryb eksperta. Wybierz zakładkę laser, włącz żelazko argonowe i źródła lasera mi tai. Ustaw długość fali mi tai na siedem 40 nanometrów.

Następnie wybierz zakładkę konfiguracji. Ustaw konfiguracje ścieżek optycznych dla jonu argonnowego i lasera mi tai. Następnie wybierz kartę skanowania.

Zmień cel na 20 razy 0,8. Ustaw maksymalną prędkość skanowania, klikając maksymalną metodę ustawiania trybu i liczbę odpowiednio na średnią liniową i jeden pod zakładką kanałów odznacz wszystkie źródła lasera z wyjątkiem mi tai. Następnie umieść miernik mocy w ścieżce wiązki optycznej, a następnie wybierz przycisk con, aby aktywować ciągłe skanowanie.

Dostosuj procent transmisji, aż miernik mocy wskaże średnią moc lasera 47 miliwatów. Następnie zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk zatrzymania na karcie kanałów. Odznacz źródło lasera mi tai i wybierz żelazko argonne.

Następnie ponownie wybierz szybki przycisk XY w zakładce kanały, wyreguluj otworek. Wykrywaj wzmocnienie, wzmacniaj przesunięcie i ponownie wzmacniaj, aby laser żelazny Argonne osiągnął najlepszą jakość obrazu. Za pomocą kontrolera etapu znajdź komórkę, którą chcesz aktywować, i skoncentruj się na niej, a następnie kliknij przycisk zatrzymania Za pomocą narzędzia do przycinania przytnij aktywowaną komórkę tak, aby współczynnik kadrowania na karcie trybu wyświetlał od 50 do 70.

Następnie zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk zatrzymania na karcie kanałów. Odznacz laser jonowy argonne i wybierz laser My Tai w zakładce trybu. Ustaw prędkość skanowania na 31,46 sekundy.

Następnie wybierz pojedynczy przycisk, aby rozpocząć skanowanie w poszukiwaniu aktywacji dwóch fotonów dekstranu fluoresceinowego w klatce wybranej komórki. Po aktywacji przejdź do zakładki kanały i teraz odznacz laser mi tai i ponownie wybierz laser jonowy argonu. Następnie w obszarze tryb ustaw współczynnik powiększenia na jeden. Następny.

Pod nagłówkiem prędkości kliknij przycisk maksimum, aby ustawić najszybszą prędkość skanowania. Aby przejrzeć region aktywowany zdjęciem, wybierz szybki xy. Następnie wybierz zakładkę kanałów i wyreguluj otwór otworkowy i wykryj ponownie, sprawdź, czy obszar aktywowany zdjęciem nie jest ablowany laserowo.

Po przygotowaniu zarodków aktywowanych zdjęciem do detekcji immunologicznej dekstranu fluoresceinowego bez klatek, postępując zgodnie z protokołem opisanym w dołączonym manuskrypcie. Umyj zarodki sześć razy w PBT i dwa razy w buforze AP. Następnie przenieś zarodki do dziewięciu płytek dołkowych w buforze AP.

Następnie odessać bufor AP i dodać N-B-T-B-C-I-P. Zatrzymaj powstawanie plam N-B-T-B-C-I-P, zasysając roztwór N-B-T-B-C-I-P. Następnie umyj zarodki w PBT.

Teraz odzyskaj zarodki i potrząśnij nimi na obrotowej platformie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz pranie PBT jeszcze dwa razy. Na koniec zamontuj zarodki w 0,6% niskotopliwym aros i uzyskaj obrazy komórek aktywowanych zdjęciem za pomocą pionowego mikroskopu złożonego.

Na tym rysunku obraz w jasnym polu pokazany po lewej stronie i obraz fluorescencyjny pokazany po prawej stronie zarodka danio pręgowanego w klatce z mikrowstrzykniętą nicią fluoresceiny przed aktywacją foto. Jak pokazano tutaj, zarodek został aktywowany fotograficznie w jednym z somitów oznaczonych strzałką na rysunku jasnego pola po lewej stronie o długości fali siedmiu 40 nanometrów, czasie skanowania 31 sekund i średniej mocy lasera 47 miliwatów. Na rysunku po prawej stronie po aktywacji zdjęcia można zaobserwować fluorescencję dekstranu fluoresceinowego bez klatkowni

Barwienie immunologiczne dekstranu fluoresceinowego bez klatki jest przedstawione w małym obszarze płytki bocznej, mezodermie 10. Tak więc zarodek w stadium roztocza był aktywowany fotograficznie przy użyciu tych samych parametrów lasera, co na poprzednim rysunku, przy użyciu procedury detekcji immunologicznej. Aktywowany region, jak wskazano tutaj strzałką, można zidentyfikować przy minimalnym zabarwieniu tła Postępując zgodnie z tą procedurą.

Można przeprowadzić dodatkowe analizy, takie jak barwienie immunologiczne dla różnych markerów specyficznych dla tkanki, w celu lepszego scharakteryzowania lokalizacji i losu znakowanych komórek. Wykorzystując tę technikę, toruje drogę naukowcom zajmującym się biologią naczyniową do zbadania pochodzenia tętniczych w żylnych komórkach progenitorowych w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego. Nie zapominaj, że podczas pracy z odczynnikami chemicznymi, takimi jak NBT i BCIP, mogą one być bardzo niebezpieczne i zawsze należy nosić rękawice.