Name: Mapowanie losu pojedynczej komórki u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę mapowania losu pojedynczych komórek w zarodkach Danio rerio przy użyciu fotoaktywacji dwufotonowej i immunohistochemii. Technika ta umożliwia precyzyjne śledzenie linii komórkowych w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy J. Chen za udostępnienie protokołu syntezy klatkowanej fluroscyny-dekstranu. Badania te były wspierane przez grant March of Dimes nr 5-FY09-78, grant American Heart Association nr 09BGIA2090075 oraz grant NIH / NHLBI nr R01 HL107369-01 przyznany S.S. Szczególne podziękowania kierujemy do C. Closson za pomoc w zakresie mikroskopii.

1. Synteza klatkowanej fluoresceiny-dekstranu (adaptacja z ref. 14)
<ol>
<li>Przygotować 0,1 M roztwór boranu sodu rozcieńczony w ddH2O.</li>
<li>Odważyć 4 mg aminodekstranu 10 kDa i dodać go do probówki z fluoresceiną klatkowaną CMNB.</li>
<li>Dodać 50 μL przygotowanego roztworu boranu sodu (krok 1.1) do probówki z fluoresceiną klatkowaną CMNB. Zamknąć probówkę i mieszać wortexie przez 30 sekund do rozpuszczenia mieszaniny.</li>
<li>Pozostawić mieszaninę do reakcji przez noc na nutatorze w temperaturze pokojowej. Przykryć probówkę folią aluminiową, aby zapobiec wystawieniu mieszaniny na działanie światła otoczenia.</li>
<li>Pobrać kolumienkę odsalającą Zeba desalt spin column i odkręcić dolną zatyczkę. Zaznaczyć kropkę na kolumience, która posłuży do jej orientacji podczas wirowania. Umieścić kolumienkę w stożkowej probówce Falcon 15 mL. Uwaga: Roztwór w kolumience to bufor kolumnowy.</li>
<li>Poluzować górną zatyczkę kolumienki odsalającej. Umieścić stożkową probówkę Falcon 15 mL z kolumienką w wirówce. Zorientować kolumienkę tak, aby zaznaczona kropka (krok 1.4) była skierowana w stronę środka rotora wirówki. Wirować probówkę przy 10 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po wirowaniu wyjąć kolumienkę odsalającą z probówki Falcon. Wyrzucić zarówno zebraną frakcję przepływową, jak i stożkową probówkę 15 mL. Pobrać nową stożkową probówkę Falcon 15 mL i umieścić w niej kolumienkę odsalającą. Uwaga: Po wirowaniu złoże żywicy w kolumience powinno być zbite. Użyć kolumienki niezwłocznie.</li>
<li>Pobrać mieszaninę poreakcyjną (klatkowany fluorescein-dekstran) z kroku 1.3. Zdjąć zatyczkę z kolumienki, odessać mieszaninę poreakcyjną i powoli nanieść ją na środek kolumienki odsalającej. Po naniesieniu mieszaniny poreakcyjnej założyć zatyczkę na kolumienkę.</li>
<li>Umieścić probówkę Falcon z kolumienką odsalającą w wirówce. Podobnie jak w kroku 1.5, zorientować kolumienkę tak, aby zaznaczona kropka była skierowana w stronę środka rotora wirówki. Wirować probówkę przy 10 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po wirowaniu w probówce Falcon 15 mL zostanie zebrana żółta mieszanina (klatkowany fluorescein-dekstran) w ilości około 400 μL. Przenieść mieszaninę klatkowanego fluoresceiny-dekstranu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.</li>
<li>Niezwłocznie przykryć probówkę folią aluminiową, aby zapobiec wystawieniu mieszaniny na działanie światła otoczenia. Liofilizować mieszaninę klatkowanego fluoresceiny-dekstranu w wirówce próżniowej (speedvac). Liofilizacja 350 μL powinna trwać około 4 godzin.</li>
<li>Po całkowitej liofilizacji resuspender proszek (około 3 mg) w ddH2O do stężenia końcowego około 1 % w/v. Wymieszać, krótko w vortexie, aby zawiesić proszek.</li>
<li>Rozdzielić klatkowany fluorescein-dekstran na alykwoy do osobnych probówek przykrytych folią aluminiową i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Pobieranie zarodków i mikroiniekcja fluoresceiny-dekstranu w klatce
* W tej procedurze jako model zwierzęcy wykorzystano danio pręgowanego. 
<ol>
<li>Dzień przed iniekcjami przygotuj krzyżówki danio pręgowanych w stosunku 1:1 (samiec do samicy) lub 2:1 w zbiornikach hodowlanych z przegrodami.</li>
<li>Następnego ranka wymień wodę w zbiorniku hodowlanym i usuń przegrody. Bezzwłocznie przygotuj 5 μL 1/10 rozcieńczonego roztworu roboczego klatkowanej fluoresceiny-dekstranu w 1 X pożywce Danieau (patrz Przygotowanie roztworów) lub ddH2O. Owiń probówkę z roztworem roboczym folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
<li>Naciągnij przygotowany roztwór klatkowanej fluoresceiny-dekstranu (krok 2.2) do igły. Przed przycięciem końcówki igły do odpowiedniej wielkości pod mikroskopem sekcyjnym, umieść przezroczysty żółty filtr przed białym źródłem światła. Żółty filtr zapobiegnie spontanicznemu odklatkowaniu fluoresceiny-dekstranu podczas iniekcji. Podczas patrzenia przez okular, źródło światła powinno wydawać się żółte.</li>
<li>Zbierz embriony i przenieś je pipetą do formy do mikroiniekcji. Ustaw czas mikroiniekcji tak, aby podać od 3 do 4 nL klatkowanej fluoresceiny-dekstranu. Pod mikroskopem sekcyjnym uorientuj embriony za pomocą pincety i wstrzyknij (3 do 4 nL) klatkowanej fluoresceiny-dekstranu do podstawy blastomerów (interfejs blastomer-żółtko). Stadium embrionu podczas iniekcji powinno odpowiadać stadium 1- lub 2-komórkowemu.</li>
<li>Po iniekcji usuń embriony z formy do mikroiniekcji i umieść je w czystej szalce Petri z czystą wodą dla ryb. Do wody dla ryb można dodać błękit metylenowy w stężeniu końcowym 0,02 % w/v, aby zapobiec rozwojowi grzybów. Przykryj szalkę Petri folią aluminiową, aby zapobiec odklatkowaniu wstrzykniętej klatkowanej fluoresceiny-dekstranu.</li>
<li>Hoduj wstrzyknięte embriony do stadium, w którym wymagana jest fotoaktywacja wybranych komórek. Do fotoaktywacji przygotuj 0,6 % roztwór agarozy niskotopliwej w ddH2O. W zależności od stadium embrionu, do agarozy niskotopliwej można dodać trikainę (MS2). W tym celu rozcieńcz 0,02% trikainy w agarozie niskotopliwej do stężenia końcowego 0,014 %.</li>
<li>Gdy tylko embriony osiągną odpowiednie stadium rozwojowe, usuń otoczki chorionowe za pomocą pincety w 1 X pożywce Danieau. Podczas usuwania chorionu upewnij się, że na drodze białego źródła światła znajduje się przezroczysty żółty filtr (patrz krok 2.3).</li>
<li>Podgrzej 0,6 % roztwór agarozy niskotopliwej do 37 °C. Pipetuj 1 mL agarozy niskotopliwej dołka szkiełka podstawowego z komorą LabTek. Ostrożnie zamontuj 3 do 4 embrionów w agarozie niskotopliwej i uorientuj je pincetą tak, aby komórki do fotoaktywacji były skierowane w dół, w stronę dolnego szkiełka nakrywkowego.</li>
<li>Pozostaw agarozę do stężenia. Po zestaleniu pipetuj 1 mL 1 X pożywki Danieau na agarozę.</li>
<li>Powtórz kroki 2.8 do 2.9 dla kolejnych embrionów.</li>
</ol>
3. Aktywacja dwufotonowa klatkowanej fluoresceiny-dekstranu
* Procedura ta zakłada, że zarodek wykazuje ekspresję reportera GFP. Obserwację zarodka przeprowadzono przy użyciu argonowego źródła laserowego (48 nm) podłączonego do mikroskopu LSM 510 META NLO. Wybrano pojedynczą komórkę wykazującą ekspresję GFP, a następnie poddano ją fotoaktywacji przy użyciu lasera Mai Tai (lasera femtosekundowego) sprzężonego z LSM 510. Procedura jest taka sama w przypadku zarodków niewykazujących fluorescencji. Alternatywnie, do zlokalizowania komórki do aktywacji można użyć światła białego, a następnie przeprowadzić aktywację za pomocą źródła laserowego Mai Tai.
<ol>
<li>Uruchom oprogramowanie LSM 510. Umieść przezroczysty żółty filtr w torze wiązki światła białego.</li>
<li>Wybierz Scan New Image i kliknij Start Expert Mode.</li>
<li>Wybierz zakładkę Laser. Włącz źródła laserowe: jon argonowy (488 nm) oraz Mai Tai (femtosekundowy).</li>
<li>Ustaw długość fali lasera Mai Tai na 740 nm.</li>
<li>Wybierz zakładkę config. Ustaw konfigurację toru optycznego dla lasera jonowego argonowego oraz lasera Mai Tai.</li>
<li>Wybierz zakładkę Scan. Zmień obiektyw na 20X/0.8.</li>
<li>Ustaw maksymalną prędkość skanowania, klikając Max.</li>
<li>Ustaw parametry Mode, Method oraz Number na Line, Mean i 1.</li>
<li>W zakładce Channels odznacz wszystkie źródła laserowe z wyjątkiem Mai Tai.</li>
<li>Umieść miernik mocy w torze wiązki optycznej.</li>
<li>Wybierz przycisk Cont, aby aktywować skanowanie ciągłe.</li>
<li>Reguluj wartość transmisji % aż miernik mocy wskaże średnią moc lasera 47 mW.</li>
<li>Zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk Stop.</li>
<li>W zakładce Channels odznacz źródło laserowe Mai Tai i wybierz laser jonowy argonowy (48 nm).</li>
<li>Wybierz przycisk Fast xy. W zakładce Channels dostosuj aperturę pinhole, wzmocnienie detektora, offset wzmacniacza oraz wzmocnienie wzmacniacza dla lasera jonowego argonowego, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu.</li>
<li>Za pomocą kontrolera stolika znajdź i ustaw ostrość na komórce, którą chcesz aktywować.</li>
<li>Kliknij przycisk Stop.</li>
<li>Używając narzędzia powiększania, powiększ aktywowaną komórkę, aż czynnik powiększenia w zakładce Mode będzie wynosić od 50 do 70.</li>
<li>Zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk Stop.</li>
<li>W zakładce Channels odznacz laser jonowy argonowy (48 nm) i wybierz laser Mai Tai.</li>
<li>W zakładce Mode ustaw prędkość skanowania na 31.46 sec.</li>
<li>Wybierz przycisk Single, aby rozpocząć skanowanie w celu dwufotonowej aktywacji klatkowanego flurosecyny-dekstranu w wybranej komórce.</li>
<li>Po aktywacji odznacz laser Mai Tai w zakładce Channels i ponownie wybierz laser jonowy argonowy (488 nm).</li>
<li>Ustaw czynnik powiększenia w zakładce Mode na 1 i kliknij przycisk Max w sekcji Speed, aby ustawić maksymalną prędkość skanowania.</li>
<li>Wybierz Fast xy, aby przejrzeć obszar fotoaktywacji. Sprawdź, czy obszar fotoaktywacji nie uległ ablacji laserowej. Więcej informacji na temat ablacji laserowej znajduje się w sekcji dyskusji.</li>
<li>Powtórz powyższe kroki dla pozostałych embrionów.</li>
</ol>
4. Immunodetekcja uwolnionej flurosecyny-dekstranu (na podstawie Ref. 16)
<ol>
<li>Po fotoaktywacji umieść przezroczysty żółty filtr przed białym źródłem światła i ręcznie usuń każdy embrion z niskotopiwego agarozu za pomocą ostrych pincet. Umieść wszystkie usunięte embriony w nowej płytce Petri zawierającej świeże podłoże Danieau 1 X. Przykryj płytkę Petri folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji embrionów na światło. </li>
<li>W razie potrzeby hoduj embriony do pożądanego stopnia rozwoju. W międzyczasie przygotuj 4 % roztwór paraformaldehydu (patrz Preparation of Solutions). Odmierz 1,5 mL przygotowanego paraformaldehydu do probówki do mikrocentryfugi.</li>
<li>Gdy embriony osiągną interesujący stopień rozwoju, przenieś je pipetą do probówki do mikrocentryfugi (z kroku 4.2). Przykryj probówkę folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
<li> Inkubuj probówkę przez noc w temperaturze 4°C na nutatorze. Na następny dzień przygotuj stopniużone roztwory etanolu (EtOH) w buforze fosforanowym z solą (PBS) i ddH2O; 30 % EtOH:PBS, 50 % EtOH:PBS, 70 % EtOH:ddH2O oraz 100 % EtOH.</li>
<li>Następnego dnia wyjmij embriony z temperatury 4°C. Usuń folię aluminiową pokrywającą probówkę i szybko odessij paraformaldehyd (pozostawiając niewielką objętość wystarczającą do zakrycia embrionów). Pipetą dodaj do probówki 1,5 mL 30 % EtOH:PBS. Ponownie przykryj probówkę folią aluminiową. Inkubuj probówkę na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
<li>Powtórz krok 4.5, używając stopniużonych roztworów EtOH o stężeniach 50, 70 i 10 %. Po przemyciu 10 % EtOH ponownie wypłucz embriony w 10 % EtOH przez 10 min.</li>
<li>Po przemyciu przechowuj embriony przez noc w temperaturze -20 °C. Na następny dzień przygotuj bufor tween fosforanowy (PBT; patrz Preparation of Solutions), 5 X bufor blokujący (patrz protokół producenta dotyczący przygotowania), kwas maleinowy (protokół przygotowania znajduje się w protokole buforu blokującego), 10 mg/ml proteinazy K oraz 10 X roztwór przeciwciał (Anti-fluorescein-AP; patrz Preparation of Solutions).</li>
<li>Przygotuj również 2 % surowicę owczą (LS; patrz Preparation of Solutions) rozcieńczoną w PBT. Przechowuj przeciwciała w temperaturze 4 °C przez noc, mieszając na nutatorze. 2 % LS można przechowywać w 4 °C.</li>
<li>Następnego dnia wyjmij embriony z temperatury -20 °C. Usuń folię aluminiową pokrywającą probówkę i szybko odessij 10 % EtOH. Dodaj do probówki 1,5 mL 70 % EtOH:ddH2O. Ponownie przykryj probówkę folią aluminiową. Inkubuj probówkę na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
<li>Powtórz krok 4.8, używając stopniużonych roztworów EtOH o stężeniach 50 i 30 % oraz 10 % PBT. Po przemyciu w 100 % PBT wypłucz embriony jeszcze 3 razy w 10 % PBT przez 10 min. </li>
<li>Jeśli embriony mają więcej niż 24 godziny, poddaj je działaniu proteinazy K. Jeśli nie, przejdź do kroku 4.13. Aby to zrobić, rozcieńcz przygotowaną proteinazę K (krok 4.7) w stosunku 1:10 w PBT. Inkubuj embriony w proteinazie K przez 10 min lub dłużej, jeśli embriony są starsze. Przechowuj embriony przykryte folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
<li>Po traktowaniu proteinazą K przemyj embriony 5 razy w PBT przez 10 min. Po przemyciu utrwal embriony w 4 % paraformaldehydzie przez 30 min w temperaturze pokojowej na nutatorze. Następnie niezwłocznie przemyj embriony 5 razy w PBT przez 10 min. Przechowuj embriony przykryte folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
<li>Przygotuj bufor blokujący, rozcieńczając 5 X bufor blokujący w buforze kwasu maleinowego do stężenia 1 X. Usuń embriony z PBT i umieść je w 1 X buforze blokującym. Przykryj embriony folią aluminiową i inkubuj na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 5 do 6 godzin.</li>
<li> Po 5 do 6 godzinach blokowania poddaj embriony szokowi termicznemu w temperaturze 65 °C przez 15 do 20 min.</li>
<li>Pobierz roztwór przeciwciał oraz 2 % LS przygotowane poprzedniego dnia. Odwiruj roztwór przeciwciał przy maksymalnej prędkości obrotowej (rpm). Przenieś fazę wodną do probówki z 2 % LS. Odwróć probówkę, aby wymieszać.</li>
<li>Przenieś embriony z buforu blokującego do mieszaniny LS-przeciwciała. Przechowuj embriony przykryte folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Inkubuj embriony na nutatorze w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
<li>Następnego dnia przemyj embriony w temperaturze pokojowej 6 razy przez 15 min w PBT. Przygotuj bufor AP (patrz Preparation of Solutions).</li>
<li> Przemyj embriony w temperaturze pokojowej 2 razy przez 10 min w buforze AP. Przygotuj roztwór wywoływujący NBT/BCIP (patrz Preparation of Solutions).</li>
<li>Przenieś embriony do NBT/BCIP. Pozostaw barwnik do wywołania w ciemności.</li>
<li>Zatrzymaj wywoływanie, przemywając embriony 3 razy w PBT po 5 min każdy.</li>
<li>W celu akwizycji obrazów zamontuj embriony w 0,6 % niskotopiwym agarozie lub 3 % metylocelulozie i wykonaj zdjęcia za pomocą odwróconego lub pionowego mikroskopu złożonego.</li>
<li>Próbki fotoaktywowane mogą być przechowywane do późniejszych analiz (barwienie pozostaje stabilne) poprzez ich odwodnienie w stopniużonych przemywaniach EtOH. W celu odwodnienia próbek postępuj zgodnie z krokami od 4.4 do 4.7.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig1.jpg" alt="Mikroskopia zarodków rybki zebrafish; fluorescencja wykazująca celowaną ekspresję genów, analiza transgeniczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rysunek 1. Fotoaktywacja klatkowanego (caged) dekstranu z fluoresceiną. (A,B) Obraz w jasnym polu i obraz fluorescencyjny zarodka rybki danio w widoku bocznym na etapie 13/14 somitu przed fotoaktywacją. (C,D) Zarodek na etapie 13/14 somitu został poddany fotoaktywacji w jednym z somitów (strzałka) przy użyciu długości fali 740 nm, czasie skanowania 31 s i średniej mocy lasera 47 mW. Po aktywacji (d) obserwuje się fluorescencję uwolnionej fluoresceiny-dekstranu. Orientacja: grzbietowa (prawo), brzuszna (lewo). Pasek skali 100 μm.
<img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig2.jpg" alt="Przekrój zarodka wykazujący ekspresję genu zaznaczoną strzałką; obraz mikroskopowy do badań rozwojowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rycina 2. Immunodetekcja klatkowanej fluoresceiny-dekstranu. Rysunek 2 przedstawia immunobarwienie odklatkowanej fluoresceiny-dekstranu w embrionie ryby danio gordona w 18/19 hpf. Na etapie 10 somitów niewielki obszar embrionu w mezodermie płytki bocznej został aktywowany przy użyciu tych samych parametrów lasera, które podano na Rysunku 1. W procedurze immunodetekcji strzałka wskazuje obszar aktywowany przy minimalnym barwieniu tła. Orientacja: Grzbietowa (góra), Brzuszna (dół). Pasek skali 100 μm.

<ol><li>Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mEosFP-based+green-to-red+photoconvertible+subcellular+probes+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants.</a> Plant physiology. 154, 1573-1587 Forthcoming.</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature. 6, 153-159 (2009).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature protocols. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Watanabe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-organelle+tracking+by+two-photon+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+express%22%5BJournal%5D)">Single-organelle tracking by two-photon conversion.</a> Optics express. 15, 2490-2498 (2007).</li>
<li>Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+embryonic+blood+in+zebrafish%3A+multi-+and+unipotential+lineages+are+segregated+at+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation.</a> Developmental cell. 16, 744-755 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindling+fluorescent+proteins+for+precise+in+vivo+photolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling.</a> Nature. 21, 191-194 (2003).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).</li>
<li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li>
<li>Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gridlock+signalling+pathway+fashions+the+first+embryonic+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery.</a> Nature. 414, 216-220 (2001).</li>
<li>Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+progenitor+for+haematopoietic+and+endothelial+lineages+in+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula.</a> Nature. 443, 337-339 (2006).</li>
<li>Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Labeling+of+Zebrafish+Cells+with+Laser+Uncagable+Fluorescein+Dextran%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran.</a> J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).</li>
<li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiemz%2C+MH+%22Laser-Tissue+Interactions%3A+Fundamentals+and+Applications%22">Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications</a>. , Springer. (2003).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein and gene expression.</a> Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Niniejsza praca opisuje wszechstronną metodę mapowania losów pojedynczych komórek opartą na fotoaktywacji klatkowanego fluoresceiny-dekstranu. Odklatkowanie fluoresceiny-dekstranu w pojedynczych komórkach odbywa się poprzez absorpcję dwufotonową z laserem femtosekundowym Mai Tai połączonym z konfokalnym mikroskopem Zeiss LSM 510 META. Odklatkowany fluoresceiny-dekstran w fotoaktywowanych komórkach jest szybko wizualizowany przy użyciu prostej procedury immunohistochemicznej.
W niniejszym protokole długość fali absorpcji dwufotonowej dla fotoaktywacji klatkowanego dekstranu z fluoresceiną wynosi 740 nm. Długość fali ta została wyznaczona eksperymentalnie poprzez fotoaktywację klatkowanego dekstranu z fluoresceiną wstrzykniętego do zarodków typu dzikiego. Zmieniano długość fali wzbudzenia laserowego w zakresie od 600 do 800 nm, a następnie jakościowo określano obecność lub brak fluorescencji fluoresceiny po aktywacji. Stwierdzono, że 740 nm generuje najsilniejszy sygnał fluoresceiny po aktywacji. W idealnych warunkach 740 nm powinno być odpowiednie dla wszystkich systemów modelowych; zalecamy jednak przetestowanie zakresu długości fal w celu wyznaczenia optymalnej długości fali wzbudzenia dwufotonowego dla danej próbki.
W embrionach typu dzikiego, do których wstrzyknięto fluoresceinę-dekstran w klatce, dla każdej testowanej długości fali wzbudzenia dwufotonowego zmieniano również średnią moc lasera. Dla długości fali wzbudzenia 740 nm średnia moc lasera 47 mW wygenerowała silniejszy sygnał fluoresceinowy w obszarze aktywowanym w porównaniu do niższych średnich mocy lasera. Wyższe średnie moce lasera nie powodowały silniejszych sygnałów fluoresceinowych, lecz indukowały ablację tkanki. Ponieważ femtosekundowe impulsy laserowe są skuteczne w ablacji tkanek biologicznych15, zalecamy określenie progowej średniej mocy lasera dla fotoaktywacji, która zapobiega ablacji tkanki.
Absorpcja dwufotonowa zachodzi w niewielkiej objętości oddziaływania. Aby zapewnić prawidłową aktywację klatkowanego fluoresceiny-dekstranu, komórka musi zostać odpowiednio ustawiona w ognisku. W powyższym protokole komórki GFP-dodatnie obrazowano jednocześnie w świetle białym, aby potwierdzić ostrość obrazu komórki. Dlatego zaleca się akwizycję w świetle białym oprócz pozostałych kanałów. Po potwierdzeniu ostrości obrazu komórki nasz protokół sugeruje powiększenie aktywowanej komórki. Sugerowany współczynnik powiększenia wynosi od 50 do 70, jednak wartość ta zależy od rozmiaru wybranej komórki. Zwiększenie powiększenia izoluje aktywowaną komórkę od komórek sąsiednich i ogranicza obszar skanowania dla aktywacji dwufotonowej. Idealnie obszar skanowania powinien obejmować znaczną część komórki.
Wykrywanie pojedynczych aktywowanych komórek wymaga zminimalizowania barwienia tła. W powyższym protokole immunodetekcji ważne jest, aby próbkę blokowano w buforze blokującym przez 5 do 6 godzin (krok 4.13). Podczas wywoływania z użyciem NBT/BCIP, nieuwięziony flurosecyna-dekstran powinien stać się widoczny w ciągu 10 do 20 min. Jeśli barwienie tła jest silne, sugerujemy wydłużenie czasu blokowania oraz wykonanie dodatkowych przemyć w celu usunięcia przeciwciał (krok 4.17).
Ryciny 1 i 2 przedstawiają reprezentatywne wyniki fotoaktywacji i immunodetekcji. Na Rycini 1 wczesne embriony typu dzikiego w stadium 1-2 komórek zostały wstrzyknięte klatkowanym fluoresceina-dekstranem. Embriony hodowano do etapu środkowej somitogenezy, a następnie osadzono w agarozie niskotopliwej w orientacji bocznej. Rycina 1(a,b) przedstawia obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjne embrionu przed fotoaktywacją. Dowodem na to, że fluoresceina pozostała w formie klatkowanej, jest brak fluorescencji fluoresceiny na Rycini 1(b). Mały obszar w obrębie somitu został aktywowany długością fali 740 nm przez 31 s przy średniej mocy lasera 47 mW, Rycina 1(c; strzałka). Po aktywacji nastąpiło dwufotonowe uwalnianie fluoresceina-dekstranu, co potwierdza fluorescencja z obszaru aktywowanego, Rycina 1(d; strzałka). Aktywacja nie wiązała się z ablacją laserową, ponieważ tkanka somityczna pozostała nienaruszona, Rycina 1(c). Rycina 2 obrazuje immunodetekcję uwolnionego fluoresceina-dekstranu. Mały obszar w mezodermie płytki bocznej embrionu w stadium 10 somitów został poddany fotoaktywacji przy użyciu tych samych parametrów lasera, które wspomniano przy Rycini 1. Embrion hodowano i przetwarzano zgodnie z krokami od 4.1 do 4.20. Strzałka na Rycini 2 wskazuje obszar aktywowany, co objawia się gromadzeniem niebieskiego osadu. Wyłącznie miejsce aktywowane jest wyraźnie wykrywane bez zakłócającego barwienia tła.
Przygotowanie roztworów:
1 X PBT (1 L) 
100 mL 10 X PBS 
2 g BSA 
10 mL 20 % Tween
10 X PBS (1 L) 
80 g NaCl 
2 g KCl 
6,1 g Na2HPO4 
1,9 g KH2PO4 
ddH2O do 1 L 
pH do 7,3
4 % Paraformaldehydu (160 mL) 
32 % Paraformaldehydu (dwie fiolki po 10 mL) 
8 mL 20 X PBS 
132 mL ddH2O
Bufor AP ( 50 mL) 
1 mL 5 M NaCl 
2,5 mL 1 M MgCl2 
5 mL 1 M Tris pH 9,5 
250 μL 20 % Tween 
41,25 mL ddH2O
Roztwór przeciwciał (na 1 próbkę) 
5,5 μL proszku acetonu 
40 μL PBT 
0,8 μL LS 
0,1 μL przeciwciał anty-fluoresceina-AP
2 % LS (360 μL na 1 próbkę) 
7,2 μL 100 % LS 
352,8 μL PBT
Pożywka Danieau 1X (1 L)‡ 
11,6 mL 5 M NaCl 
700 μL 1 M KCl 
400 μL 1 M MgSO4 
600 μL 1 M Ca(NO3)2 
5 mL 1 M HEPES 
ddH2O do 1 L 
dostosować pH do 7,6
‡ Roztwór Danieau jest idealnym roztworem soli do hodowli zdechorionowanych zarodków zebrafish. Można stosować inne media, pod warunkiem, że są to roztwory izotoniczne o odpowiedniej osmolarności (~ 300 mOsm dla zebrafish)
Roztwór zapasowy NBT (1 mL) 
50 mg Nitro Blue Tetrazolium 
0,7 mL bezwodnego dimetyloformamidu 
0,3 mL ddH2O
Roztwór zapasowy BCIP (1 mL) 
50 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate 
1 mL bezwodnego dimetylformamidu
Roztwór wywołujący NBT/BCIP 
1 mL buforu AP 
4,5 μL roztworu zapasowego NBT 
3,5 μL roztworu zapasowego BCIP
Proszek acetonowy
<ol>
	<li>Wybrać 20 dorosłych ryb i zamrozić je w ciekłym azocie.</li>
	<li>Rozetrzeć zamrożone ryby w moździerzu z tłuczkiem na proszek.</li>
	<li>Przenieść proszek z ryb do stożkowatej probówki o pojemności 50 mL.</li>
	<li>Wypełnić probówkę stożkowatą 100 % acetonem. Poddać próbkę działaniu wirówki typu vortex.</li>
	<li>Wirować próbkę z maksymalną prędkością obrotową przez 10 mins. Odrzucić nadsącz.</li>
	<li>Przemyć osad dodatkowo 3 razy w 100 % acetonie i wirować probówkę z maksymalną prędkością obrotową przez 10 mins. Po ostatnim przemyciu nadsącz powinien być klarowny.</li>
	<li>Ponownie dodać do osadu 100 % aceton i pozostawić probówkę w temperaturze pokojowej. Gęstsze cząstki opadną na dno, natomiast drobniejsze pozostaną w zawiesinie.</li>
	<li>Zdekantować drobne cząstki do nowej probówki. Rozdzielić roztwór proszku na aalikwoty w osobnych probówkach i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Fluoresceina SE klatkowana CMNB</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodekstran 10 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna do odsalania Zeba Desalt Spin Column</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Amresco</td><td>0815-100G</td><td></td></tr><tr><td>Boran sodu</td><td>Amresco</td><td>1131117-100G</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian tricainy/ MS222</td><td>Research Organics</td><td>1347A</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fluoresceina-AP</td><td>Roche Group</td><td>11376622</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td>Roche Group</td><td>11 096 176 001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MO375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8377-250mg</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-34040</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Klawiczki z komorą LabTek</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Surowica jagnięca</td><td>Invitrogen</td><td>16070096</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META NLO</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw apochromatyczny 20X 0,8 NA Air</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysty żółty filtr</td><td>Theatre House Inc.</td><td>Arkusz filtra Roscolux Kolor: 312</td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Zdolność do różnicowego znakowania pojedynczych komórek ma istotne znaczenie w biologii rozwoju. Na przykład określenie, w jaki sposób powstają linie krwiotwórcze, limfatyczne i naczyniowe w rozwijających się embrionach, wymaga mapowania losów i śledzenia linii niezróżnicowanych komórek prekursorowych. Ostatnio szerokie zainteresowanie jako sondy do śledzenia komórek wzbudziły białka fotoaktywowalne, do których należą: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8 oraz KikGR9, 10. Spektrum fluorescencji tych białek światłoczułych może być łatwo konwertowane za pomocą wzbudzenia UV, co pozwala odróżnić populację komórek od sąsiednich. Jednak wydajność fotoaktywacji białka może ograniczać długoterminowe śledzenie komórek11. Jako alternatywa dla białek fotoaktywowalnych, w systemach modelowych embrionów szeroko stosowano uwięziony (caged) fluoresceinowy dekstran7, 12-14. Tradycyjnie do uwalniania fluoresceinowego dekstranu z klatki stosowano wzbudzenie UV z lampy fluorescencyjnej lub jednofotonowego lasera UV; jednak źródła te ograniczają rozdzielczość przestrzenną fotoaktywacji. Przedstawiamy tutaj protokół mapowania losów, śledzenia linii oraz detekcji pojedynczo znakowanych komórek. Pojedyncze komórki w embrionach wstrzykniętych z uwięzionym fluoresceinowym dekstranem są fotoaktywowane impulsami lasera bliskiej podczerwieni generowanymi przez femtosekundowy laser tytanowo-szafirowy. Laser ten jest standardowy we wszystkich dwufotonowych mikroskopach konfokalnych, takich jak mikroskop LSM 510 META NLO wykorzystany w niniejszej pracy. Ponieważ tkanka biologiczna jest przezroczysta dla promieniowania bliskiej podczerwieni15, impulsy laserowe mogą być ogniskowane głęboko wewnątrz embrionu bez uwalniania dekstranu z komórek powyżej lub poniżej wybranej płaszczyzny ogniskowania. W związku z tym nieliniowa absorpcja dwufotonowa jest indukowana tylko w ognisku geometrycznym, aby uwolnić fluoresceinowy dekstran w pojedynczej komórce. W celu wykrycia komórki zawierającej uwolniony fluoresceinowy dekstran opisujemy prosty protokół immunohistochemiczny16 do szybkiej wizualizacji aktywowanej komórki. Przedstawiony w niniejszej pracy protokół aktywacji i detekcji jest wszechstronny i może być zastosowany w dowolnym systemie modelowym.
Uwaga: Odczynniki wykorzystane w tym protokole znajdują się w tabeli dołączonej na końcu artykułu.

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Zdolność do różnicowego znakowania pojedynczych komórek ma istotne znaczenie w biologii rozwoju. Na przykład określenie, w jaki sposób komórki krwiotwórcze...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykonanie mapowania losów oraz śledzenia linii wybranych pojedynczych komórek w embrionach ryb zebrafish. Osiąga się to poprzez chemiczne sprzęganie klatkowanej fluoresceiny z dekstranem o wysokiej masie cząsteczkowej. Następnie przygotowany dekstran z klatkowaną fluoresceiną jest wstrzykiwany metodą mikroiniekcji do embrionów zebrafish, a następnie fotoaktywowany w wybranych komórkach z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej.Po fotoaktywacji embrionów przeprowadza się analizę immunohistochemiczną w celu wykrycia uwolnionego z klatki dekstranu fluoresceiny, aby zmapować losy aktywowanych komórek. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do określenia wkładu linii komórkowej oraz lokalizacji tkankowej fotoaktywowanych pojedynczych komórek. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak standardowa mikroskopia fluorescencyjna, jest możliwość różnicowego znakowania pojedynczych komórek w celu mapowania ich losów.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak sposób, w jaki nieróżnicowane komórki prekursorowe mogą przyczyniać się do powstania różnych typów tkanek. Demonstracja wizualna jest niezbędna, ponieważ etapy montażu zarodków i fotoaktywacji są trudne do opanowania wyłącznie na podstawie opisu tekstowego. Przed rozpoczęciem pracy należy zsyntetyzować klatkowaną flurosceninę dekstran i przechowywać ją w probówkach owiniętych folią aluminiową. Następnie należy przeprowadzić mikroiniekcję zsyntetyzowanej klatkowanej flurosceniny dekstranu do zarodków w stadium jednej do dwóch komórek.Po osiągnięciu przez embriony odpowiedniego stopnia rozwoju, należy je powlec. Następnie powleczone embriony należy zamontować w niskotopliwym agarozie w celu fotoaktywacji. Po zestaleniu się agarozy należy uruchomić oprogramowanie LSM 510.Umieść przezroczysty żółty filtr na drodze wiązki białego światła, a następnie wybierz opcję skanowania nowego obrazu i kliknij start expert mode. Przejdź do karty laser, włącz źródła lasera argonowego oraz Mi.Tai. Ustaw długość fali lasera Mi.Tai na 740 nm.Następnie wybierz zakładkę config. Ustaw konfiguracje ścieżki optycznej dla jonu argonu i lasera mi tai. Następnie wybierz zakładkę scan.Zmień obiektyw na 20×/0,8. Ustaw maksymalną prędkość skanowania, klikając max set mode method oraz liczbę na line mean i one odpowiednio w zakładce channels; odznacz wszystkie źródła laserowe z wyjątkiem mi tai. Następnie umieść miernik mocy w drodze wiązki optycznej, a potem wybierz przycisk con, aby aktywować skanowanie ciągłe.Dostosuj procent transmisji, aż miernik mocy wskaże średnią moc laserową 47 milliwattów. Następnie zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk stop w zakładce kanałów. Odznacz źródło lasera mi tai i wybierz argonowy laser jonowy.Następnie ponownie wybierz przycisk fast XY w zakładce kanałów, a następnie dostrój otwór pinhole, wzmocnienie detekcji (gain), wzmocnienie i offset dla lasera argonowego, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu. Za pomocą kontrolera stolika odnajdź i ustaw ostrość na komórce przeznaczonej do aktywacji, a następnie kliknij przycisk stop. Używając narzędzia przycinania, obtnij aktywowaną komórkę tak, aby współczynnik przycinania (crop factor) w zakładce tryb (mode) wynosił od 50 do 70.Następnie zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk stop w zakładce kanałów. Odznacz laser argonowy i wybierz laser My Tai w zakładce trybu. Ustaw prędkość skanowania na 31,46 sekund.Następnie należy kliknąć pojedynczy przycisk, aby rozpocząć skanowanie w celu dwufotonowej aktywacji klatkowanego dekstranu fluoresceiny w wybranej komórce. Po aktywacji należy przejść do karty kanałów, odznaczyć laser mi tai i ponownie zaznaczyć laser jonowy argonowy. Następnie w sekcji trybu należy ustawić mnożnik powiększenia (zoom factor) na jeden. Następnie.W sekcji prędkość kliknij przycisk max, aby ustawić najszybszą prędkość skanowania. Aby przejrzeć obszar fotoaktywacji, wybierz fast xy. Następnie przejdź do karty kanały, dostosuj otwór pinhole i ponownie wykonaj detekcję, sprawdzając, czy obszar fotoaktywacji nie został abladowany laserem.Po przygotowaniu zarodków aktywowanych światłem do immunodetekcji fluoresceiny dekstranu uwalnianego z klatki (uncaged), zgodnie z protokołem opisanym w dołączonym manuskrypcie, należy przemyć zarodki sześciokrotnie w buforze PBT i dwukrotnie w buforze AP. Następnie przenieść zarodki do płytek dziewięciodołkowych z buforem AP.Następnie odessać bufor AP i dodać N-B-T-B-C-I-P. Przerwać rozwój barwienia N-B-T-B-C-I-P poprzez odessanie roztworu N-B-T-B-C-I-P. Następnie przemyć embriony w PBT.Następnie wyjmij zarodki i inkubuj je na rotacyjnej platformie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz płukanie w PBT jeszcze dwa razy. Na koniec zamocuj zarodki w 0,6% niskotopliwym agarozie i wykonaj obrazy fotoaktywowanych komórek, korzystając z pionowego mikroskopu złożonego.Na rysunku przedstawiono obraz w polu jasnym (po lewej) oraz obraz fluorescencyjny (po prawej) zarodka ryby danio (*zebrafish*), do którego mikroiniekcyjnie wprowadzono klatkowaną fluoresceinę dekstran przed fotoaktywacją. Jak pokazano tutaj, zarodek został poddany fotoaktywacji w jednym z somitów wskazanym strzałką na obrazie w polu jasnym po lewej stronie, przy użyciu długości fali 740 nm, czasie skanowania 31 s oraz średniej mocy lasera 47 mW. Na rysunku po prawej można zaobserwować fluorescencję pochodzącą z uwolnionej z klatki fluoresceiny dekstranu po fotoaktywacji.Barwienie immunologiczne nieskratowanego dekstranu fluoresceinowego przedstawiono na małym obszarze płyty bocznej mezodermy zarodka w stadium 10 somitów; aktywacja foto-chemiczna została przeprowadzona przy użyciu tych samych parametrów lasera, co na poprzedniej rycinie, z zastosowaniem procedury detekcji immunologicznej. Obszar aktywowany, wskazany tutaj strzałką, można zidentyfikować przy minimalnym barwieniu tła po zastosowaniu tej procedury.W celu lepszej charakterystyki lokalizacji i losu znakowanych komórek można przeprowadzić dodatkowe analizy, takie jak barwienie immunocytochemiczne dla różnych markerów specyficznych dla tkanek. Zastosowanie tej techniki otwiera przed badaczami z zakresu biologii naczyniowej możliwośćy badania pochodzenia komórek progenitorowych tętniczych i żylnych w rozwijających się embrionach rybek danio pręgowanego. Należy pamiętać, że podczas pracy z odczynnikami chemicznymi takimi jak NBT i BCIP, które mogą być niezwykle niebezpieczne, należy zawsze stosować rękawice.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mapowanie losów pojedynczych komórek u rybki Danio

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Niniejszy protokół opisuje metodę znakowania i śledzenia losów niewielkich grup komórek w embrionach ryb danio pręgowany poprzez UV-odblokowanie uwięzionej fluoresceiny, a następnie immunoznakowanie całego preparatu w celu wzmocnienia sygnału z odblokowanej fluoresceiny.

Znakowanie linii komórkowych ryb danio-pręgowanych za pomocą dekstranu fluoresceiny uwalnianego laserowo

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Transgeniczne lck:eGFP danio pręgowane silnie wyrażają GFP w limfocytach T i były używane do badania rozwoju limfocytów T i ostrej białaczki limfoblastycznej. Linia ta może być wykorzystana do badania limfocytów B, które wyrażają lck na niższych poziomach. Protokół ten opisuje oczyszczanie złośliwych i niezłośliwych komórek B z danio pręgowanego lck:eGFP.

Izolowanie złośliwych i niezłośliwych komórek B od lekko: eGFP danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Tutaj opisujemy metodę izolacji jelit od larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia, do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.

Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

Poznaj metodę mapowania losu pojedynczych komórek w zarodkach Danio rerio przy użyciu fotoaktywacji dwufotonowej i immunohistochemii. Technika ta umożliwia precyzyjne śledzenie linii komórkowych w biologii rozwoju.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Przeglądaj więcej filmów