Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na podstawowe pytania dotyczące dynamiki neuronalnych komórek progenitorowych i ich potomstwa, które leżą u podstaw rozwoju mózgu kręgowców. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniej wizualizacji wielu skupisk klonalnie spokrewnionych komórek w żywym mózgu przez wiele godzin rozwoju. Protokół może być również stosowany do badania dynamiki klonów i progenitorów w innych rozwijających się systemach zarodka danio pręgowanego.

Wizualizacja z wykorzystaniem tej metody jest szczególnie przydatna do bezpośredniej obserwacji podstawowych procesów, które zachodzą podczas rozwoju neuronalnego. Po południu przed wykonaniem mikrozastrzyków należy umieścić dorosłe rybki danio pręgowane typu dzikiego w zbiornikach godowych z separacją płci. Następnego ranka przygotuj roztwór DNA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i wstrzyknij około 4,2 nanolitra tego roztworu do jednej komórki zarodków danio pręgowanego w ciągu 45 minut od zapłodnienia.

Utrzymuj wstrzyknięte zarodki w inkubatorze E three i 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny, a następnie wezwij martwe i zdeformowane zarodki z grupy. Przenieś do 20 zdrowych zarodków do 50-mililitrowej probówki, napełnij ją 10 mililitrami E 3 i umieść nakrętkę na każdej probówce. Umieść stojak z 50-mililitrowymi rurkami pionowo w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 80 do 90 minut, upewniając się, że poziom wody w wannie jest wyższy niż E trzy w rurce.

Wyjmij stojak na probówki z łaźni wodnej i umieść go w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Odczekać do jednej godziny, aż trójka E ostygnie, a zarodki ponownie zaaklimatyzują się do temperatury. Następnie przenieś je na szalki Petriego z 0,2 milimolowym PTU i E trzema utrzymywanymi w cieple w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Po dwóch do czterech godzinach od szoku cieplnego zbadaj zarodki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem ekspresji CFP lub YFP, co wskazuje na udaną rekombinację Brainbow. Wybierz zarodki o silnej ekspresji FP i przenieś je do osobnego naczynia z PTU. Wyobraź je sobie jeden, dwa lub trzy dni po zapłodnieniu.

Ekspresja, która wydaje się przyćmiona pod mikroskopem fluorescencyjnym, może być w rzeczywistości dobrze zobrazowana w konfokalnym obrazowaniu poklatkowym. Przed dniem eksperymentu należy przygotować komorę obrazowania i narzędzie do manipulacji zarodkami. Aby przygotować komorę obrazowania, ostrożnie przyklej plastikowy pierścień do środka 60-milimetrowej szalki Petriego.

Zbuduj manipulator, przyklejając niewielką długość nylonowej żyłki do końca czterocalowego drewnianego patyczka do wacika. Jeśli to konieczne, przed montażem należy dokonać dekorionacji zarodków pod mikroskopem preparacyjnym. Aby zamontować zarodki, przenieś rybę do środka plastikowego pierścienia w komorze obrazowania i usuń jak najwięcej E 3 za pomocą pipety transferowej z cienką końcówką.

Użyj czystej pipety transferowej, aby pokryć rybę jednym procentem niskotopliwej agarozy i E trzema, wypełniając cały plastikowy pierścień warstwą agarozy. Następnie delikatnie wciągnij zarodek do końcówki pipety i z powrotem do agarozy, nie wprowadzając żadnych pęcherzyków powietrza. Użyj manipulatora zarodków, aby szybko zorientować rybę i agarozę, zanim stwardnieją.

W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu pionowego należy umieścić zarodek jak najbliżej górnej powierzchni agarozy, upewniając się, że są one równoległe do dna komory obrazowania z prostym ogonem. Poczekaj, aż agaroza stwardnieje, a następnie napełnij komorę obrazowania E trzy, dodając jak najwięcej, aby uwzględnić parowanie w trakcie obrazowania. Umieść komorę obrazowania z rybą i E trzy na mikroskopie konfokalnym.

Następnie wybierz obiektyw z dużą aperturą numeryczną i dużą odległością roboczą. Znajdź obszar z odpowiednio gęstym i jasnym oznaczeniem komórek i ustaw parametry akwizycji. Jest to przykład użycia oprogramowania Zen, ale ustawienia będą się różnić w zależności od dostępnego mikroskopu i linii laserowych.

Przygotuj trzy ścieżki, aby sekwencyjnie obrazować każdy kanał FP. Użyj lasera argonowego do wzbudzenia CFP przy 458 nanometrach i YFP przy 514 nanometrach oraz użyj lasera DPSS 561 nanometrowego do wzbudzenia dTomato. Zbierz misje dla trzech na odpowiednich długościach fal.

Wybierz zakres stosu Z do zobrazowania i interwał czasu od 10 do 30 minut, aby śledzić zdarzenia mitotyczne i apoptotyczne. Na koniec wybierz długość sesji obrazowania i uruchom eksperyment. Po zakończeniu obrazowania zapisz surowe dane w formacie CZI w przypadku korzystania z Zen lub innego formatu zgodnego z Fidżi, a następnie zaimportuj obrazy na Fidżi za pomocą importera formatów bio.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe in vivo wykorzystano do pokazania klonów komórek oznaczonych kolorem Brainbow w strefie proliferacyjnej komorowej rozwijającego się tyłomózgowia danio pręgowanego. Komórki oznaczone Brainbow ułożone wzdłuż określonego promienistego włókna miały ten sam kolor. Które można określić ilościowo jako względne wagi kanałów RGB.

Sugeruje to, że te grupy radiowe były klonami dzielących się komórek i że ich podobny kolor może być użyty do zidentyfikowania ich jako spokrewnionych klonalnie. Ilościowa analiza koloru wykazała, że komórki potomne wyrażają ten sam kolor, co komórka ich matki. Jednak tamte sąsiadujące ze sobą radiowe klastry komórek dają się od siebie odróżnić.

Liczne klony spokrewnionych komórek mogą być obserwowane jednocześnie przez wiele godzin in vivo, co pozwala na multipleksową analizę i porównanie linii. Kwantyfikacja ekspresji koloru u klonów po dwóch, a następnie ponownie po trzech dniach od zapłodnienia wykazała, że ekspresja Brainbow pozostawała względnie stała od dwóch do trzech dni. Obrazowanie poklatkowe ujawniło liczne komórki przechodzące interkinetyczną migrację jądrową i podział komórek od jednego do dwóch dni po zapłodnieniu, co umożliwiło badanie cyklu komórkowego.

Obliczono średni cykl komórkowy wynoszący 8,4 godziny, co jest porównywalne z poprzednimi pomiarami u danio pręgowanego. Co więcej, ta technika obrazowania została wykorzystana do obserwacji pojedynczych komórek przechodzących stereotypowe zmiany morfologiczne związane z apoptozą, takie jak pęcherzenie błony i fragmentacja komórek. Ponieważ metoda ta jest wykonywana in vivo, danio pręgowany może zostać uratowany z komory obrazowania i zachowany do obrazowania lub innych eksperymentów w późniejszych punktach czasowych.

Zastosowanie tej techniki pozwala nam badać nowe pytania dotyczące roli komórek spokrewnionych klonalnie podczas rozwoju neuronalnego.