Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów za pomocą oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX / SDH) Podwójne znakowanie Histochemia

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie bezpośredniej wizualizacji niedoborów mitochondrialnych enzymów oddechowych w świeżo zamrożonych skrawkach tkanek. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw skrawków kriostatu z interesującego nas narządu. Drugim krokiem procedury jest wykonanie chemii Cox Histo, po której następuje chemia SDH Histo.

Na koniec skrawki tkanki są odwadniane, montowane i nasunięte na okładkę. Ostatecznie wyniki mogą pokazać stopień dysfunkcji mitochondriów poprzez ilość niebieskiego zabarwienia komórek. Hi.Today będziemy rozmawiać o technice podwójnego znakowania COX SCH HISTOCHEMICZNEJ.

I chociaż metoda ta może być stosowana do badania chorób mitochondriów, może również dostarczyć informacji na temat starzenia się i zaburzeń związanych z wiekiem. Po usunięciu mózgu zwierzęcia, które zostało złożone w ofierze zgodnie z pozwoleniem etycznym, szybko zamroź go na suchym lodzie. Zamrożoną tkankę można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, zawinąć w folię aluminiową, aż będzie gotowa do cięcia.

Przygotuj tkankę do kriosekcji, umieszczając mózg na uchwycie kriostatycznym i otaczając go związkiem osadzającym. Szybko umieść uchwyt w kriosacie i zbierz 14 mikronów w temperaturze minus 21 stopni Celsjusza. Rozmrozić sekcje na szkiełkach za pomocą bloku grzewczego, a następnie pozostawić szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Umieść szkiełka w komorze do barwienia szkiełek z mokrymi paskami papieru. Ponieważ czas reakcji jest ważny w tym teście, zaleca się przetwarzanie maksymalnie 10 szkiełek na eksperyment pod maską chemiczną. Przygotować inkubację, pożywkę zawierającą dab i cytochrom C w PBS i wirze.

Szybko dodać dwa mikrogramy bydlęcych CDE do pożywki i dobrze wymieszać przez wirowanie. Aby rozbić wszystkie ziarna CDE, które nadal pracują pod maską, nałóż od 150 do 200 mikrolitrów pożywki inkubacyjnej na każde szkiełko za pomocą końcówki pipety, aby równomiernie rozprowadzić na wszystkich sekcjach. Inkubuj szkiełka przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 40 minutach usunąć pożywkę inkubacyjną ze szkiełek. Umyj szkiełka cztery razy w PBS przez 10 minut za każdym razem. Po umyciu szkiełek należy je umieścić z powrotem w komorze barwienia szkiełek z mokrymi paskami papieru pracującymi pod kapturem chemicznym.

Przygotuj roztwór NBT w PBS, uważając, aby osłonić PMS przed wirem świetlnym, szybko nałóż od 150 do 200 mikrolitrów roztworu NBT na każde szkiełko za pomocą końcówki pipety, aby równomiernie rozprowadzić na wszystkich sekcjach. Inkubować szkiełka przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza po 40 minutach usunąć nadmiar roztworu ze szkiełek. Umyj szkiełka cztery razy w PBS przez 10 minut za każdym razem.

Odwadniaj szkiełka przez dwie minuty w następujących sekwencyjnych stężeniach etanolu. 70%70%95%95%i 99,5%Na koniec odczekaj 10 minut w dodatkowym kroku 99,5%. Umieść szkiełka w ksylenie na 10 minut, zamontuj za pomocą sieci LAN i nałóż szkiełka nakrywkowe.

Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc lub co najmniej jedną do dwóch godzin w przewiewnym miejscu. Wycinki mózgu od typu dzikiego i przedwczesnego starzenia się. MT. Myszy z mutatorem DNA były sekwencyjnie znakowane pod kątem aktywności COX i SDH.

Normalna aktywność Coxa, na którą wskazuje ciemnobrązowe zabarwienie, jest widoczna w hipokampie myszy typu dzikiego. Niedobory Coxa wskazane przez niebieskie zabarwienie ujawniono w hipokampie myszy z mutacją DNA MT po 12 i 46 tygodniach. Nastąpił dalszy spadek aktywności Coxa w wieku 46 tygodni u myszy z mutacją M-T-D-N-A, co sugeruje powszechne zaostrzenie dysfunkcji łańcucha oddechowego.

Nieodpowiedni czas inkubacji wynoszący 10 i 25 minut skutkował zmniejszonym osadzaniem się produktu reakcji brązowego dab. Skrócony czas inkubacji pozwolił na wytworzenie niebieskiego produktu końcowego Foran podczas inkubacji SDH, mylnie sugerując obecność komórek z niedoborami COX, które pokrywają ślizganie się. Szkiełka podczas inkubacji COX powodowały również niedokładne tworzenie i osadzanie produktu reakcji DAB.

Chociaż aktywność Coxa i SDH może być indywidualnie oznaczana, jak pokazano tutaj, sekwencyjne znakowanie okazało się korzystne w lokalizowaniu komórek z dysfunkcją mitochondriów. Przykład kontroli swoistości dla aktywności COX i SDH w mózgu myszy typu dzikiego pokazuje negatywne oznakowanie. Nie zapominaj więc, że praca z chemikaliami w podwójnym etykietowaniu Cox SCH jest protokołem chemicznym jest niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego stroju laboratoryjnego i maski pracującej pod kapturem chemicznym, a także utylizacja pożywki inkubacyjnej, powinny być wykonywane za każdym razem, gdy wykonujesz ten test.