Name: Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów za pomocą oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX / SDH) Podwójne znakowanie Histochemia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Naucz się podwójnego znakowania COX/SDH do wizualizacji niedoborów enzymów oddechowych mitochondriów w tkankach mrożonych. Ta histochemiczna technika pozwala badać dysfunkcję mitochondrialną w chorobach i procesach starzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health-Karolinska Institutet Graduate Partnerships Program, Karolinska Institutet, Swedish Research Council, Swedish Brain Power oraz Swedish Brain Foundation. Szczerze dziękujemy Mattiasowi Karlenowi i dr. Giuseppe Coppotelli za kreatywne wsparcie odpowiednio przy Rysunku 1 i 2; Karin Pernold za pomoc techniczną; oraz dr. Barry’emu J. Hofferowi, dr. Larsowi Olsonowi i dr. Nils-Göranowi Larssonowi za cenne rady i dyskusje.

1. Przygotowanie tkanki do kriotomii
<ol>
	<li>Uśmierć zwierzę poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych lub dekapitację, zgodnie z posiadanym zezwoleniem etycznym.</li>
	<li>Szybko pobierz interesujące tkanki (np. mózg) i gwałtownie zamroź je na suchym lodzie (tkanki mogą wymagać zamrożenia w izopentanie lub propanie schłodzonym ciekłym azotem w celu uzyskania optymalnej morfologii). Przechowuj tkanki w folii aluminiowej w temperaturze -80 °C do momentu przystąpienia do krojenia.</li>
	<li>Zatop zamrożoną tkankę w preparacie do kriosekcji.</li>
	<li>Pobierz przekroje kriosztatem o grubości 14-μm w temperaturze -21 °C (może być konieczna korekta temperatury o ± 1-2 °C). Rozmroź przekroje na szkiełkach za pomocą bloku grzewczego i przechowuj szkiełka bez szkiełek nakrywkowych w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Histochemia COX
<ol>
	<li>Pozostawić preparaty do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umieścić preparaty w komorze do barwienia z wilgotnym papierem filtracyjnym pociętym w paski. Aby uzyskać spójne wyniki w każdym doświadczeniu, zaleca się opracowanie maksymalnie dziesięciu preparatów podczas jednego badania, aby zminimalizować opóźnienia czasowe.</li>
	<li>Przygotować pod wyciągiem chemicznym 1X DAB oraz 100 μM cytochromu c w 0.1 M PBS pH=7.0. Szybko wymieszać na wortexie.</li>
	<li>Dodać 2 μg katalazy wołowej (2 μg ml-1 lub około 4 IU ml-1). Wymieszać dokładnie za pomocą wortexa, aby rozbić wszystkie grudki katalazy.</li>
	<li>Nanieść 150- 200 μL medium inkubacyjnego na każdy preparat, używając końcówki pipety do równomiernego rozprowadzenia go na wszystkich przekrojach.</li>
	<li>Inkubować preparaty przez 40 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć nadmiar roztworu z preparatów. Przemyć preparaty 4 razy, po 10 minut za każdym razem, w 0.1 M PBS pH=7.0.</li>
	<li>Ponownie umieścić preparaty w komorze do barwienia z wilgotnymi paskami papieru.</li>
</ol>
3. Histochemia SDH
<ol>
	<li>Przygotuj pod wyciągiem chemicznym roztwór zawierający 1,5 mM NBT, 130 mM bursztyczanu sodu, 0,2 mM PMS oraz 1,0 mM azotku sodu w 0,1 M PBS pH=7,0. Należy chronić PMS przed działaniem światła. Szybko wymieszaj na wortexie.</li>
	<li>Nanieś 150-200 μL podłoża inkubacyjnego na każdy preparat, używając końcówki pipety do równomiernego rozprowadzenia go na wszystkich sekcjach.</li>
	<li>Inkubuj preparaty przez 40 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usuń nadmiar roztworu z preparatów. Przemyj preparaty 4 razy, po 10 minut za każdym razem, w 0,1 M PBS pH=7,0.</li>
	<li>Odwodnij preparaty przez 2 minuty w następujących stężeniach etanolu: 70%, 70%, 95%, 95%, 99,5%. Następnie pozostaw je na 10 minut w dodatkowym kroku w 99,5% etanolu.</li>
	<li>Umieść preparaty w ksylenie na 10 minut. Zamontuj przy użyciu Entellanu i szkiełka cover-slip. Pozostaw preparaty do wyschnięcia przez noc lub co najmniej 1-2 godziny w wentylowanym pomieszczeniu.</li>
</ol>
4. Określanie dysfunkcji mitochondriów
<ol>
	<li>Stopień dysfunkcji mitochondriów jest wskazywany przez intensywność niebieskiego barwienia komórkowego. Aby półilościowo określić te wartości, preparaty należy zakodować i poddać wizualizacji przy użyciu mikroskopii w polu jasnym. Półilościowa ocena powinna być przeprowadzona w sposób ślepy, z wykorzystaniem skali, na przykład od 0 do 4 (0 – brak niebieskiego barwienia; 4 – wyłącznie niebieskie barwienie). Zaleca się przeprowadzenie tego rodzaju oceny na kilku skrawkach od danego obiektu/zwierzęcia, aby obliczyć wartość średnią dla każdego obiektu/zwierzęcia.</li>
	<li>Analizy statystyczne należy przeprowadzić przy użyciu testu nieparametrycznego, takiego jak test Manna-Whitneya lub Kruskala-Wallisa.</li>
</ol>
5. Odpowiednie kontrole specyficzności
<ol>
	<li>W celu przeprowadzenia kontroli specyficzności dla aktywności COX, powtórzyć etapy sekcji „COX histochemistry”, dodając 2,5 mM azotku sodu, który jest inhibitorem końcowego łańcucha oddechowego.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia kontroli specyficzności dla aktywności SDH, powtórzyć etapy sekcji „SDH histochemistry”, pomijając dodanie bursztynianu sodu i dodając 50 mM malonianu, który jest konkurencyjnym inhibitorem SDH.</li>
	<li>Przerapć i odwodnić skrawki w serii etanolu, a następnie zamontować preparaty i przykryć je szkiełkami zgodnie z opisem w krokach 3.4 - 3.6.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Ogólny schemat histochemicznego badania z podwójnym znakowaniem COX/SDH przedstawiono na rysunku 2. Reprezentatywne przykłady prawidłowego histochemicznego podwójnego znakowania COX/SDH w przekrojach mózgu myszy typu dzikiego oraz myszy mtDNA mutator z przedwczesnym starzeniem przedstawiono na rysunku 3. Ciemnobrązowe barwienie u myszy typu dzikiego (rysunek 3, panel lewy) wykazało prawidłową aktywność COX. Komórki z niedoborami łańcucha oddechowego, wskazane niebieskim barwieniem, ujawniono u 12-tygodniowych myszy mtDNA mutator, a niedobory te stały się bardziej rozpowszechnione w miarę starzenia się myszy mtDNA mutator do 46 tygodnia (rysunek 3, panele środkowy i prawy).
Przykłady nieprawidłowego podwójnego znakowania COX/SDH w przekrojach mózgu myszy typu dzikiego, wynikające z niewystarczającego znakowania COX, przedstawiono na rysunku 4. Niewystarczający czas inkubacji dla wykazania aktywności COX lub ograniczenie dostępności tlenu cząsteczkowego poprzez nakrycie preparatu szkiełkiem podczas inkubacji spowodowały zmniejszone osadzanie produktu reakcji DAB, co umożliwiło powstanie niebieskiego produktu końcowego – formazanu – podczas inkubacji SDH.
Aktywność COX i SDH można również badać osobno (Rycina 5, lewa i środkowa); jednak sekwencyjne barwienie jest pomocne w identyfikacji komórek z niedoborem COX, ze względu na powstawanie niebieskiego osadu podczas inkubacji z SDH (Rycina 3, środkowa i prawa). Można również przeprowadzić kontrole specyficzności dla aktywności COX i SDH (Rycina 5, prawa).
<img alt="Schemat łańcucha transportu elektronów; struktura błony mitochondrialnej; kompleksy I-V; synteza ATP." src="/files/ftp_upload/3266/3266fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Mitochondrialne kompleksy oddechowe I-V. Mitochondrialny łańcuch oddechowy znajduje się w błonie wewnętrznej i składa się z pięciu kompleksów. Celem łańcucha oddechowego jest transport elektronów z kompleksu I do IV, co prowadzi do powstania gradientu protonów przez błonę wewnętrzną, wykorzystywanego przez kompleks V (ATP-azę) do produkcji ATP. Czerwone sześciokąty reprezentują podjednostki kodowane przez mtDNA. Białe sześciokąty reprezentują podjednostki kodowane przez DNA jądrowe (należy zauważyć, że kompleks II jest w całości kodowany przez genom jądrowy). W związku z tym mutacje w genomie mitochondrialnym mogą powodować dysfunkcję łańcucha oddechowego z powodu mutacji w podjednostkach kompleksów łańcucha oddechowego.
<img alt="Proces sekcjonowania mózgu myszy; schemat analizy aktywności enzymatycznej; obejmuje przemywanie w PBS, barwienie DAB." src="/files/ftp_upload/3266/3266fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat blokowy histochemicznej analizy podwójnego znakowania COX/SDH. Wypreparować interesujące organy, szybko zamrozić tkanki na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze - 80 °C. Zebrać skrawki z kriostatu i przechowywać w temperaturze - 20 °C do momentu użycia. Pozostawić skrawki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przygotować medium inkubacyjne do histochemii COX, nanieść je na szkiełka i inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć skrawki w PBS 4 razy, po 10 minut każdego mycia. Przygotować medium inkubacyjne do histochemii SDH, nanieść je na szkiełka i ponownie inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 °C. Ponownie przemyć skrawki w PBS, odwodnić w serii etanolu, a następnie zamontować i przykryć szkiełka szkiełkami cover-slip. Podwójnie znakowane skrawki COX/SDH są gotowe do obserwacji pod mikroskopem w świetle przechodzącym w ciągu 1-2 godzin.
<img alt="Porównanie histologii mózgu, typy dzikie vs mutator w 12. i 46. tygodniu; obraz mikroskopowy do badania wieku." src="/files/ftp_upload/3266/3266fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne przykłady podwójnego znakowania COX/SDH. Przekroje mózgu myszy typu dzikiego oraz myszy mutator z przedwczesnym starzeniem mtDNA zostały sekwencyjnie oznakowane pod kątem aktywności COX i SDH. (Pasek skali: 200 μm.) Prawidłową aktywność COX (oznaczoną ciemnobrązowym kolorem) wykazano w hipokampie myszy typu dzikiego (po lewej). Niedobory COX (oznaczone kolorem niebieskim) ujawniono w hipokampie myszy mutator mtDNA (środek i prawa). W 46. tygodniu życia u myszy mutator mtDNA odnotowano dalszy spadek aktywności COX, co sugeruje rozległe zaostrzenie dysfunkcji łańcucha oddechowego. Zaobserwowana dysfunkcja mitochondrialna u myszy mutator mtDNA 12 jest spowodowana wysokim poziomem mutacji punktowych mtDNA, a także zwiększoną liczbą delecji liniowych 5.
<img alt="Analiza reakcji enzymu COX, obrazy mikroskopowe pokazują różne czasy reakcji, badanie histologiczne." src="/files/ftp_upload/3266/3266fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Przykłady nieprawidłowego podwójnego znakowania COX/SDH. Przekroje mózgu myszy typu dzikiego zostały sekwencyjnie znakowane w celu wykazania aktywności COX i SDH. (Skala: 200 μm.) Niewystarczające czasy inkubacji (10 i 25 minut) dla wykazania aktywności COX doprowadziły do zmniejszonego osadzania brązowego produktu reakcji DAB w porównaniu do 40-minutowego czasu inkubacji (lewo i środek). Skrócone czasy inkubacji pozwoliły na powstanie niebieskiego końcowego produktu formazanu podczas inkubacji SDH, co błędnie sugerowało obecność komórek z niedoborem COX. Nałożenie szkiełek podstawkowych podczas inkubacji COX również spowodowało nieprawidłowe tworzenie i osadzanie produktu reakcji DAB (prawo).
<img alt="Przetworzone sekcje tkanek barwione na COX, SDH oraz kontrolne; obraz mikroskopowy, porównanie aktywności enzymatycznej." src="/files/ftp_upload/3266/3266fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Indywidualne znakowanie COX i SDH oraz kontrola swoistości. Sekcje mózgu myszy typu dzikiego zostały osobno znakowane pod kątem aktywności COX oraz SDH, co zasygnalizowano odpowiednio kolorem ciemnobrązowym i niebieskim (lewo i środek). Choć aktywności COX i SDH można znakować indywidualnie, sekwencyjne znakowanie okazało się korzystniejsze w lokalizacji komórek z dysfunkcją mitochondriów. Przykład kontroli swoistości aktywności COX i SDH w mózgu myszy typu dzikiego wykazał brak znakowania (prawo). (Pasek skali: 200 μm.)

<ol><li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mitochondrial+DNA+mutations+in+mammalian+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).</li>
<li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+NY+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).</li>
<li>Harman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biologic+clock%3A+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Geriatr.+Soc%22%5BJournal%5D)">The biologic clock: the mitochondria.</a> J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).</li>
<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genetics+-+a+paradigm+for+aging+and+degenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genetics - a paradigm for aging and degenerative diseases.</a> Science. 256, 628-632 (1992).</li>
<li>Trifunovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+ageing+in+mice+expressing+defective+mitochondrial+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase.</a> Nature. 429, 417-423 (2004).</li>
<li>Ameur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+of+mouse+mitochondrial+DNA%3A+mutational+patterns+and+their+origins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins.</a> PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).</li>
<li>Safdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+rescues+progeroid+aging+and+induces+systemic+mitochondrial+rejuvenation+in+mtDNA+mutator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).</li>
<li>DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial myopathies.</a> Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).</li>
<li>Old, S. L., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+microphotometric+assay+of+succinate+dehydrogenase+and+cytochrome+c+oxidase+activities+for+use+on+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle.</a> Histochem. J. 21, 545-555 (1989).</li>
<li>Chaturvedi, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+PGC-1alpha+function+in+muscle+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington's disease.</a> Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).</li>
<li>Edgar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+point+mutations+with+major+effects+on+protein-coding+genes+are+the+driving+force+behind+premature+aging+in+mtDNA+mutator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Metab%22%5BJournal%5D)">Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice.</a> Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).</li>
<li>Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+brain+lactate+is+a+hallmark+of+aging+and+caused+by+a+shift+in+the+lactate+dehydrogenase+A%2FB+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).</li>
<li>Crugnola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+in+muscle+from+patients+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis.</a> Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).</li>
<li>Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+pathology+in+cytochrome+c+oxidase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency.</a> Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).</li>
<li>DiMauro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+encephalomyopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial encephalomyopathies.</a> Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).</li>
<li>Bonilla, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+morphological+approaches+to+the+study+of+mitochondrial+encephalomyopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Pathol%22%5BJournal%5D)">New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies.</a> Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).</li>
<li>Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+human+aging%3A+implications+for+the+central+nervous+system+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle.</a> Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).</li>
<li>Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+enzyme+activity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+implications+for+the+role+of+mitochondria+in+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death.</a> Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).</li>
<li>Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+rates+and+activities+of+respiratory+chain+complexes+correlate+linearly+with+heteroplasmy+of+deleted+mtDNA+without+threshold+and+independently+of+deletion+size%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).</li>
<li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+is+necessary+for+mtDNA+maintenance+and+embryogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice.</a> Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).</li>
<li>Ekstrand, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+parkinsonism+in+mice+with+respiratory-chain-deficient+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).</li>
<li>Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondroplet+ultrastructural+demonstration+of+cytochrome+oxidase+activity+with+a+polymerizing+osmiophilic+reagent%2C+diaminobenzidine+%28DAB%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB).</a> J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).</li>
<li>Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , Saunders. (1973).</li>
<li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+oxidase+deficient+cells+accumulate+in+the+hippocampus+and+choroid+plexus+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age.</a> Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).</li>
<li>Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+histochemical+determination+of+succinic+dehydrogenase+activity+in+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres.</a> Histochem. J. 20, 230-243 (1988).</li>
<li>Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+tRNA%28Leu%28UUR%29%29+mutation+in+mitochondrial+encephalomyopathy%2C+lactic+acidosis%2C+and+strokelike+episodes+%28MELAS%29%3A+genetic%2C+biochemical%2C+and+morphological+correlations+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle.</a> Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).</li>
<li>Petruzzella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+high+levels+of+mutant+mtDNAs+co-localize+with+cytochrome+c+oxidase-negative+ragged-red+fibers+in+patients+harboring+a+point+mutation+at+nt+3243%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243.</a> Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).</li>
<li>Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+encephalomyopathies+in+childhood.+I.+Biochemical+and+morphologic+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations.</a> J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).</li>
<li>Haas, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in-depth+evaluation+of+suspected+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Metab%22%5BJournal%5D)">The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease.</a> Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Połączona metoda histochemiczna COX/SDH umożliwia wizualizację komórek z dysfunkcją mitochondriów. Technika ta, której wczesne badania datują się na 1968 rok, pozostaje popularna, a wielu uznaje ją za „złoty standard” w identyfikacji chorób mitochondrialnych u pacjentów14,19,26,27. Obecnie jest ona często wykorzystywana do badania procesów starzenia napędzanych mutacjami mtDNA oraz zaburzeń związanych ze starzeniem 12,13,18,20,21,24. Metoda podwójnego znakowania COX/SDH jest często stosowana równole...

<table><tbody><tr><td>Suchy lód</td><td>AGA Gas AB</td><td>forma blokowa</td><td></td></tr><tr><td>Izopentan (2-metylobutane)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258 CAS: 78-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do zatapiania w kriotomacie</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tkanka Tek 4583&lt;strong&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Microm International</td><td>Microm model HM 500M</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty histologiczne</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Super Frost Plus Menzel Gl&amp;#228;ser J1800AMWZ</td><td></td></tr><tr><td>Lamelki Szkło borokrzemowe</td><td>VWR international</td><td>16004-098</td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>Papier filtracyjny</td><td>Munktell Filter AB</td><td>Jakość: 1350 Numer artykułu: 242 001</td><td>430 x 430 mm</td></tr><tr><td>3,3&amp;#8242;tetrahydrochlorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma Liquid Substrate System, D7304</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom &lt;em&gt;c&lt;/em&gt; (typ III, z serca konia)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506 CAS: 9007-43-6</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza wołowa (z wątroby)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322 CAS: 9001-05-2</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium (NBT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876 CAS: 298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Karboksylan sodu (sukcynian sodu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378 CAS: 6106-21-4</td><td></td></tr><tr><td>Metosulfian fenazyny (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625 CAS: 299-11-6</td><td>PMS jest światłoczuły. Należy chronić przed światłem.</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032 CAS: 26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>VWR international</td><td>EM-XX0060-4</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>VWR international</td><td>100503-870</td><td></td></tr><tr><td>Malonian (Kwas malonowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296 CAS: 141-82-2</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów przy użyciu histochemii z podwójnym znakowaniem oksydazy cytochromu c / dehydrogenazy bursztynianowej (cox/sdh)

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Defekty mitochondrialnego DNA (mtDNA) stanowią istotną przyczynę chorób i mogą leżeć u podstaw procesów starzenia oraz zmian z nimi związanych 1,2. Mitochondrialna teoria starzenia sugeruje, że mutacje mtDNA, które mogą zaburzać homeostazę bioenergetyczną i funkcje komórkowe, odgrywają rolę w procesie starzenia 3. Zebrano wiele dowodów wspierających tę teorię 1,4, czego przykładem jest mysz mutator mtDNA 5; jednak precyzyjna rola uszkodzeń mtDNA w starzeniu nie jest w pełni zrozumiała 6,7.
Obserwacja aktywności enzymów oddechowych jest prostym podejściem do badania dysfunkcji mitochondriów. Kompleks IV, czyli oksydaza cytochromu c (COX), jest niezbędny dla funkcji mitochondrialnych. Podjednostki katalityczne COX są kodowane przez mtDNA i są niezbędne do montażu kompleksu (Rysunek 1). Zatem prawidłowa synteza i funkcja opierają się w dużej mierze na integralności mtDNA 2. Chociaż można badać inne kompleksy oddechowe, kompleksy IV i II są najbardziej podatne na badanie histochemiczne 8,9. Kompleks II, czyli dehydrogenaza bursztyczanowa (SDH), jest w całości kodowany przez DNA jądrowe (Rysunek 1), a jego aktywność zazwyczaj nie jest zaburzona przez uszkodzenia mtDNA, choć jej wzrost może wskazywać na biogenezę mitochondriów 10-12. Zaburzenia mtDNA obserwowane w chorobach mitochondrialnych, starzeniu się oraz chorobach związanych z wiekiem często prowadzą do obecności komórek o niskiej lub całkowicie zniesionej aktywności COX 2,12-14. Chociaż aktywność COX i SDH można badać indywidualnie, sekwencyjna metoda podwójnego znakowania 15,16 okazała się korzystna w lokalizowaniu komórek z dysfunkcją mitochondrialną 12,17-21.
Wyznaczono wiele optymalnych parametrów analizy, takich jak stężenie substratu, akceptory/donory elektronów, pośrednie przenośniki elektronów, wpływ pH oraz czas reakcji 9,22,23. 3,3'-diaminobenzydyna (DAB) jest skutecznym i niezawodnym donorem elektronów 22. W komórkach z funkcjonującą COX brązowy polimerowy produkt indaminy zlokalizuje się w grzebieniach mitochondriów i nasyci komórki 22. Komórki z dysfunkcyjną COX nie zostaną zatem nasycone produktem DAB, co umożliwi wizualizację aktywności SDH poprzez redukcję nitrobłękitu tetrazolium (NBT), akceptora elektronów, do niebieskiego produktu końcowego – formazanu 9,24. Cytochrom c oraz substraty w postaci bursztynianu sodu są dodawane w celu normalizacji poziomów endogennych pomiędzy tkankami kontrolnymi a tkanek chorych/zmutowanych 9. Katalaza jest dodawana profilaktycznie, aby uniknąć możliwych reakcji kontaminacyjnych wynikających z aktywności peroksydazy 9,22. Metanosiarczan fenazyny (PMS), pośredni przenośnik elektronów, jest stosowany wraz z azotkiem sodu, inhibitorem łańcucha oddechowego, aby zwiększyć tworzenie końcowych produktów reakcji 9,25. Mimo tych informacji, niektóre krytyczne szczegóły wpływające na wynik tej pozornie prostej analizy, a także kontrole specyficzności i ulepszenia techniki, nie zostały jeszcze przedstawione.

Metoda podwójnego znakowania oksydazy cytochromu c/dehydrogenazy sodowej (COX/SDH) umożliwia bezpośrednią wizualizację niedoborów enzymów oddechowych mitochondriów w świeżo zamrożonych przekrojach tkanek. Jest to prosta technika histochemiczna, która okazuje się przydatna w badaniu chorób mitochondrialnych, starzenia się oraz zaburzeń związanych z wiekiem.

Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów przy użyciu histochemii z podwójnym znakowaniem oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX/SDH)

Defekty mitochondrialnego DNA (mtDNA) stanowią istotną przyczynę chorób i mogą leżeć u podstaw procesów starzenia oraz zmian z nimi związanych 1,2. Mitochondrialna teoria...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie bezpośredniej wizualizacji niedoborów enzymów oddechowych mitochondriów w świeżych mrożonych przekrojach tkankowych. Jest to realizowane poprzez pobranie w pierwszej kolejności skrawków z kriostatu z interesującego organu. Drugim krokiem procedury jest wykonanie oceny histochemicznej kompleksu COX, po której następuje ocena histochemiczna SDH.Na koniec przekroje tkanek zostają odwodnione, osadzone i zabezpieczone szkiełkiem cover-slip. Ostatecznie wyniki pozwalają określić stopień dysfunkcji mitochondriów na podstawie natężenia niebieskiego barwienia komórkowego. Cześć. Dzisiaj omówimy technikę histochemicznej podwójnego znakowania Cox i SCH.Choć metodę tę można zastosować do badania chorób mitochondrialnych, może ona również dostarczyć informacji na temat starzenia się oraz schorzeń związanych z wiekiem. Po wyjęciu mózgu zwierzęcia uśpionego zgodnie z pozwoleniem etycznym należy go szybko zamrozić na suchym lodzie. Zamrożoną tkankę można przechowywać w temperaturze -80 °C, zawiniętą w folię aluminiową, aż do momentu przygotowania przekrojów.Przygotuj tkankę do kriosekcjonowania, umieszczając mózg na stole kriostatu i otaczając go medium do zatapiania. Szybko umieść stół w kriostacie i pobierz przekroje o grubości 14 micron przy temperaturze minus 21 °C. Rozmroź przekroje na szkiełkach za pomocą bloku grzejnego, a następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Umieścić preparaty w komorze do barwienia z mokrymi paskami papieru. Ponieważ czasy reakcji są istotne w tym badaniu, zaleca się przetwarzanie maksymalnie 10 preparatów na eksperyment pod dygestorium chemicznym. Przygotować medium inkubacyjne zawierające dab i cytochrom C w PBS, a następnie wymieszać na wortexie.Szybko dodaj 2 µg wołowych CDE do medium i dokładnie wymieszaj za pomocą wirówki vortex. Aby rozbić wszystkie ziarna CDE, pracując nadal w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nanieś od 150 do 200 µL medium inkubacyjnego na każdy preparat, używając końcówki pipety do równomiernego rozprowadzenia cieczy na wszystkich sekcjach. Inkubuj preparaty przez 40 minut w temperaturze 37 °C.Po 40 minutach usunąć medium inkubacyjne z szkiełek. Płukać szkiełka cztery razy w PBS, za każdym razem przez 10 minut. Po płukaniu, pracując pod wyciągiem chemicznym, umieścić szkiełka z powrotem w komorze do barwienia wraz z mokrymi paskami papieru.Przygotuj roztwór NBT w PBS, pamiętając o zabezpieczeniu PMS przed światłem. Szybko wymieszaj roztwór w wstrząsarce wirowej, a następnie nanieś od 150 do 200 µL roztworu NBT na każdy preparat, używając końcówki pipety do równomiernego rozprowadzenia płynu na wszystkich przekrojach. Inkubuj preparaty przez 40 minut w temperaturze 37 °C, po czym usuń nadmiar roztworu z płytek. Przemyj preparaty cztery razy w PBS, po 10 minut za każdym razem.Odwodnij preparaty na szkiełkach przez dwie minuty każdy w kolejnych stężeniach etanolu: 70%, 70%, 95%, 95% oraz 99,5%. Na koniec pozostaw preparaty na kolejne 10 minut w dodatkowym kroku z 99,5% etanolu. Umieść szkiełka w ksylenie na 10 minut, zamontuj przy użyciu LAN i nałóż szkiełka zakrywające.Pozostawić preparaty do wyschnięcia przez noc lub co najmniej od jednej do dwóch godzin w wentylowanym pomieszczeniu. Przekroje mózgu myszy typu dzikiego oraz myszy z przedwczesnym starzeniem MT.DNA Mutator zostały sekwencyjnie znakowane pod kątem aktywności COX i SDH.W hipokampie myszy typu dzikiego widoczna jest prawidłowa aktywność Cox, wskazana przez ciemnobrązowe barwienie. Niedobory Cox, objawiające się niebieskim barwieniem, wykazano w hipokampie myszy MT DNA mutator w 12. i 46. tygodniu. W 46. tygodniu życia u myszy M-T-D-N-A mutator odnotowano dalszy spadek aktywności Cox, co sugeruje rozległe nasilenie dysfunkcji łańcucha oddechowego.Niewystarczające czasy inkubacji wynoszące 10 i 25 minut doprowadziły do zmniejszenia osadzania brązowego produktu reakcji DAB. Skrócone czasy inkubacji pozwoliły na powstanie niebieskiego produktu końcowego Forana podczas inkubacji SDH, co błędnie sugerowało obecność komórek z niedoborami COX. Przesunięcie szkiełek podczas inkubacji COX również spowodowało nieprawidłowe tworzenie i osadzanie produktu reakcji DAB.Chociaż aktywności COX i SDH mogą być znakowane indywidualnie, jak pokazano tutaj, znakowanie sekwencyjne okazało się korzystne w lokalizacji komórek z dysfunkcją mitochondriów. Przykład kontroli specyficzności dla aktywności COX i SDH w mózgu myszy typu dzikiego wykazuje brak znakowania. Należy pamiętać, że praca z odczynnikami w protokole podwójnego znakowania COX i SDH jest niezwykle niebezpieczna, dlatego przy każdym wykonaniu tego testu należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odpowiedniej odzieży laboratoryjnej i maski, praca pod dygestorium chemicznym oraz właściwa utylizacja medium inkubacyjnego.

visualization-mitochondrial-respiratory-function-using-cytochrome-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów za pomocą oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX / SDH) Podwójne znakowanie Histochemia

Konfokalna mikroskopia skaningowa jest stosowana do obrazowania pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych w perfundowanych mięśniach serca lub szkieletowych u żywych zwierząt. Monitorowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych procesów mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego, umożliwia ocenę funkcji mitochondriów w fizjologicznie istotnym kontekście i podczas patologicznych perturbacji.

Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Opracowaliśmy praktyczny protokół i analityczne podejście do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej i zdolności przenoszenia elektronów w świeżych homogenatach guza. Protokół ten można łatwo dostosować do badania różnych funkcji mitochondriów, które przyczyniają się do inicjacji, progresji i odpowiedzi na leczenie.

Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje test porównawczy, wykorzystujący aktywność kompleksu mitochondrialnego CI+CIII i CII+CIII w obecności lub braku Na+, w celu zbadania istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ.

Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Naucz się podwójnego znakowania COX/SDH do wizualizacji niedoborów enzymów oddechowych mitochondriów w tkankach mrożonych. Ta histochemiczna technika pozwala badać dysfunkcję mitochondrialną w chorobach i procesach starzenia.

Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów za pomocą oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX / SDH) Podwójne znakowanie Histochemia (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów przy użyciu histochemii z podwójnym znakowaniem oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX/SDH)

Przeglądaj więcej filmów