Name: Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj respirometrię o wysokiej rozdzielczości do badania funkcji mitochondriów w komórkach nienaruszonych i przepuszczalnych. Ta metoda pozwala ocenić zużycie tlenu z dużą czułością przy minimalnej ilości próbek biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (Grant nr 32003B_127619).

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich komórek hepG2 6 w 25cm 2 kolbach do hodowli komórkowych w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Modified Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w inkubatorze (5% CO2, 95% powietrza) (gęstość wysiewu: 1 x 106 komórek na 25cm 2 kolby do hodowli komórkowych, czas inkubacji w inkubatorze w temperaturze 37 °C: 48 godzin, gęstość komórek w momencie zbiegu: 4-5 x 106 komórek na 25 cm2 kolba do hodowli komórkowych).</li>
	<li>Wykonuj eksperymenty, gdy komórki są zlewające się w 90% do 95%.</li>
</ol>
2. Kalibracja respirometryczna o wysokiej rozdzielczości polarograficznych czujników tlenu
<ol>
	<li>Pobrać pipetę z 2,1 ml buforu oddechowego do komory oksygraficznej i ciągle mieszać bufor za pomocą mieszadła magnetycznego znajdującego się w komorze (700 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu z polarograficznego czujnika tlenu. 
	UWAGA: Polarograficzne elektrody tlenowe w każdej komorze oksygraficznej mierzą stężenie tlenu i obliczają zużycie tlenu (strumień) w każdej komorze. Stężenie tlenu i wskaźniki zużycia tlenu (strumień) są wyświetlane w czasie rzeczywistym online w komputerze za pomocą oprogramowania do gromadzenia i analizy danych.</li>
	<li>Wykonaj kalibrację powietrza polarograficznego czujnika tlenu zgodnie z protokołami producenta14. 
	UWAGA: Kalibracja polarograficznych czujników tlenu w mediach oddechowych i stężenia tlenu w pożywkach w eksperymentalnej temperaturze nasycenia powietrza jest wykonywana tylko raz dziennie rano. Następnie pożywka może zostać usunięta z komór, a komórki zawieszone w świeżych pożywkach oddechowych są dodawane do komory oksygraficznej i mierzone są częstości oddechów. Po pierwszym eksperymencie komora może zostać umyta i można wykonać dodatkowe serie eksperymentów w tej samej komorze bez dalszych kalibracji.</li>
</ol>
3. Trypsyna przylegających komórek, liczenie komórek
<ol>
	<li>W dniu eksperymentu należy odessać DMEM z kolby do hodowli komórkowycho średnicy 25 cm2.</li>
	<li>Przepłukać monowarstwę hodowli komórkowej w kolbie hodowlanej 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Pobrać pipetą 0,5 ml roztworu trypsyny o stężeniu 25 mg/ml (podgrzanego do temperatury 37 °C w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C) do monowarstwy komórek w kolbie hodowlanej i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze (5% CO2, 95 % powietrze).</li>
	<li>Pobrać pipetą 5 ml DMEM zawierającego 10% FBS do oderwanych komórek w kolbie do hodowli komórkowych i zawiesić komórki za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Przenieść zawieszone komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej i zdekantować supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do oddychania13 (Table 1).</li>
	<li>Policz komórki za pomocą licznika komórek i ponownie zawieś je w buforze oddechowym do końcowej gęstości 1 x 106 komórek/ml. Ponieważ tempo oddychania komórkowego zostanie znormalizowane do liczby komórek, policz komórki za pomocą dokładnego i precyzyjnego licznika komórek.</li>
</ol>
4. Respirometria o wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Po kalibracji powietrza (wykonywanej tylko raz dziennie, kroki 2.1-2.2), odessać medium oddechowe z komory oksygrafu i dodać do komory 2,1 ml zawiesiny komórek (1 x 106 komórek/ml) z kroku 3.7.</li>
	<li>Zamknąć komorę oksygraficzną poprzez włożenie korka.</li>
	<li>Mieszać komórki w sposób ciągły za pomocą mieszadła magnetycznego znajdującego się w komorze (700 obr./min) w temperaturze 37 °C i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. 
	UWAGA: Stężenie tlenu i sygnał strumienia tlenu są wyświetlane w czasie rzeczywistym online na komputerze za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy danych14.</li>
	<li>Następnie wstrzyknąć substraty i inhibitory do oddychania mitochondrialnego przez tytanowe porty iniekcyjne korków, stosując następujące protokoły.</li>
</ol>
5. Miareczkowanie digitoniny w nienaruszonych komórkach metodą respirometrii
<ol>
	<li>Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą zawiesinę komórek (1 x 106/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1–4.3 protokołu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl 0,2 mM rotenonu (0,2 μM) "UWAGA" do komory oksygraficznej zawierającej zawiesinę komórek przez tytanowy otwór iniekcyjny korka komory za pomocą strzykawki i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. 
	UWAGA: Wszystkie wstrzyknięcia w poniższych krokach są wykonywane przez tytanowe porty iniekcyjne korków za pomocą strzykawek. Dodanie rotenonu jest opcjonalne (zapobiega odwrotnemu przepływowi elektronów) i można je pominąć w doświadczeniach z miareczkowaniem digitoniny, patrz krok 6.3.</li>
	<li>Wstrzyknąć 20 μl 1 M bursztynianu (10 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μl 0,5 M ADP (2,5 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl digitoniny 2 mM (2 μM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 2-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału tlenowego.</li>
	<li>Ponownie wstrzyknąć 2 μl digitoniny 2 mM do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 2-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału tlenowego. 
	UWAGA: Stopniowe dodawanie digitoniny do komórek spowoduje wzrost komórkowego zużycia tlenu, a sygnał strumienia tlenu wzrośnie.</li>
	<li>Kontynuuj wstrzykiwanie 2-4 μl 2 mM digitoniny krok po kroku (2-4 μM każdy krok) do komory. Po każdym kroku rejestruj oddychanie komórkowe przez 2-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. 
	UWAGA: Przestań wstrzykiwać digitoninę, gdy sygnał strumienia tlenu osiągnie maksymalny poziom, a kolejne wstrzyknięcia digitoniny nie zwiększają częstości oddechów. Czytelnicy powinni określić optymalne stężenie digitoniny w swoich laboratoriach przy użyciu własnych odczynników i użyć uzyskanego optymalnego stężenia digitoniny w krokach 6.2 i 7.2 poniższych protokołów dla swoich eksperymentów.</li>
</ol>
6. Ocena integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej: Cytochrom C
<ol>
	<li>Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą zawiesinę komórek (1 x 106/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1–4.3 protokołu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl 8 mM digitoniny (8 μM) do komory oksygraficznej zawierającej zawiesinę komórek (1 x 106/ml) i przenikać komórki przez 5 minut.</li>
	<li>Wstrzyknąć 20 μl 1 M bursztynianu (10 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μl 0,5 M ADP (2,5 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. 
	UWAGA: Dodanie ADP do komórek pobudzi kompleks I i wywoła wzrost zużycia tlenu, a sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.</li>
	<li>Wstrzyknąć 5 μl cytochromu c o stężeniu 4 mM (10 μM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.</li>
	<li>Na koniec wstrzyknąć 1 μl oligomycyny 4 mg/ml (2 μg/ml) i rejestrować oddychanie komórkowe aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.</li>
</ol>
7. Maksymalne oddychanie stymulowane ADP (stan 3) permeabilizowanych komórek HepG2
<ol>
	<li>Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą zawiesinę komórek (1 x 106/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1–4.3 protokołu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl 8 mM digitoniny (8 μM) do komory oksygraficznej zawierającej zawiesinę komórek i przepuszczać komórki przez 5 minut.</li>
	<li>Wstrzyknąć 12,5 μl 0,8 M jabłczanu (5 mM) i 10 μl 2 M glutaminianu (10 mM) do komory oksygraficznej. Rejestruj oddychanie komórkowe do momentu uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μl 0,5 M ADP (2,5 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się. 
	UWAGA: Dodanie ADP do komórek spowoduje wzrost zużycia tlenu, a sygnał strumienia tlenu wzrośnie.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl 0,2 mM rotenonu (0,2 μM) "UWAGA" do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje.</li>
	<li>Następnie wstrzyknąć 20 μl 1 M bursztynianu (10 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.</li>
	<li>Następnie wstrzyknąć 2 μl 5 mM antymycyny A (5 μM) "UWAGA" do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje.</li>
	<li>Następnie wstrzyknąć 2,5 μl askorbinianu 0,8 mM (1 mM) i natychmiast po tym wstrzyknąć 2,5 μl 0,2 mM TMPD (0,25 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe do momentu wzrostu i ustabilizowania się sygnału strumienia tlenu.</li>
	<li>Na koniec wstrzyknąć 10 μl 1 M azydku sodu (5 mM) "UWAGA" do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje.</li>
</ol>
8. Zużycie tlenu przez nienaruszone komórki
<ol>
	<li>Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą zawiesinę komórek (1 x 106/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1–4.3 protokołu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 μl oligomycyny 4 mg/ml (2 μg/ml) do komory oksygraficznej zawierającej zawiesinę komórek i rejestrować oddychanie komórkowe aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.</li>
	<li>Następnie wstrzyknąć 1 μl 0,2 mM FCCP (0,1 μM) "UWAGA" do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.</li>
	<li>Wstrzyknąć 3 μl 0,2 mM FCCP (0,4 μM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie dalej i ustabilizuje się.</li>
	<li>Miareczkować FCCP w krokach co 0,1 do 0,3 μM, wstrzykując 1-3 μl 0,2 do 1 mM FCCP (0,1 do 2 μM stężenia końcowego w komorze) do komory oksygraficznej, aż sygnał strumienia tlenu osiągnie maksymalny poziom i nie będzie dalej wzrastał, a następnie zacznie spadać. 
	UWAGA: Przerwij wstrzykiwanie FCCP, gdy sygnał tlenu osiągnie maksymalny poziom i zacznie spadać.</li>
	<li>Następnie wstrzyknąć do komory 2 μl 0,2 mM rotenonu (0,2 μM) i 2 μl 5 mM antymycyny A (5 μM). Rejestruj oddech, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje.</li>
</ol>

<ol><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li>
<li>Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+mitochondrial+and+cellular+respiration+by+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+remifentanil+on+mitochondrial+oxygen+consumption+of+cultured+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes.</a> PLoS One. 7 (9), e45195(2012).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li>
<li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074(2015).</li>
<li>Nicholls, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+binding+to+enzymes+and+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c binding to enzymes and membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).</li>
<li>Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+conformations+of+physiological+membrane-bound+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c.</a> Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).</li>
<li>Gorbenko, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+cytochrome+c+complexes+with+phospholipids+as+revealed+by+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer.</a> Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Mitochondr+Physiol+Network+17.18%22">Mitochondr Physiol Network 17.18</a>. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem niniejszego protokołu było wykorzystanie respirometrii o wysokiej rozdzielczości do pomiaru częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów oraz integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.
W ramach niniejszego protokołu znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, wskaźniki zużycia tlenu przez komórki są zwykle znormalizowane do liczby komórek (pmol/[sec x liczba komórek]). Dl...

Mitochondria pełnią ważną rolę w metabolizmie energii komórkowej, zwłaszcza poprzez wykorzystanie tlenu do produkcji adenozynotrójfosforanu (ATP). Są one zaangażowane w śmierć komórek i kilka chorób u ludzi. Mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS) łączy transport elektronów wzdłuż łańcucha transportu elektronów ze zużyciem tlenu i syntezą ATP. Cykl mitochondrialnego kwasu trikarboksylowego (TCA) bierze udział w przekształcaniu białek, węglowodanów i tłuszczów w związki bogate w energię, takie jak dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FADH2). Elektrony NADH i FADH2 są następnie przenoszone do kompleksów białkowych łańcucha transportu elektronów oddechowych (I do IV) znajdujących się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Ponadto dwa inne szlaki redoks mogą przenosić elektrony do łańcucha transportu elektronów: i) mitochondrialna flawoproteina przenosząca elektrony (ETF), która znajduje się na powierzchni macierzy wewnętrznej błony mitochondrialnej i dostarcza elektrony z β-utleniania kwasów tłuszczowych; oraz ii) mitochondrialna dehydrogenaza glicerofosforanowa, która utlenia glicerofosforan do fosforanu dihydroksyacetonu i dostarcza elektrony do mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów. Kompleks IV (ostateczny akceptor elektronów) przenosi elektrony do jednej cząsteczki tlenu, przekształcając tlen w dwie cząsteczki wody. Przemieszczanie się elektronów z kompleksu łańcucha transportu elektronów oddechowych I do IV jest sprzężone z przepływem protonów z macierzy mitochondrialnej do przestrzeni międzybłonowej, która ustanawia gradient elektrochemiczny w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej. Następnie kompleks mitochondrialny V (syntaza ATP) transportuje jony wodorowe z powrotem do macierzy mitochondrialnej i syntetyzuje cząsteczki ATP. Funkcję OXPHOS można ocenić in vivo i in vitro przy użyciu różnych technik i uzyskać różne stany oddychania mitochondrialnego. W izolowanych mitochondriach można mierzyć następujące stany oddechowe: i) podstawowe oddychanie mitochondrialne (stan 1), ii) zużycie tlenu po dodaniu specyficznych substratów kompleksów mitochondrialnego łańcucha oddechowego (stan 2), iii) maksymalne zużycie tlenu w mitochondriach po dodaniu nasyconych stężeń difosforanu adenozyny (ADP) (stan 3) oraz iv) oddychanie spoczynkowe po spożyciu ADP (przekształcone w ATP) (stan 4). W nienaruszonych komórkach można zmierzyć następujące stany oddechowe: i) podstawowe zużycie tlenu komórkowego w obecności endogennych substratów i ADP, ii) podstawowe zużycie tlenu komórkowego w obecności oligomycyny (oddychanie niewrażliwe na oligomycynę) i oddychanie wrażliwe na oligomycynę (obrót ATP), iii) oddychanie niesprzężone FCCP oraz iv) oddychanie niemitochondrialne po dodaniu antymycyny A i rotenonu. W komórkach przepuszczalnych można dodawać specyficzne substraty kompleksów łańcucha transportu elektronów i ADP oraz mierzyć maksymalne częstości oddechów zależne od kompleksu, takie jak częstość oddechów zależna od kompleksu I, II i IV.
Pomiary oddychania komórkowego dostarczają ważnych informacji na temat wydolności oddechowej mitochondriów specyficznych dla kompleksów I-IV, integralności mitochondriów i metabolizmu energetycznego1,2,3. Jednym z urządzeń, które umożliwiają pomiary zużycia tlenu w mitochondriach z dużą dokładnością, rozdzielczością i czułością, jest wysokorozdzielczy oxygraph4. Urządzenie oksygraficzne o wysokiej rozdzielczości zawiera dwie komory z portami wtryskowymi, a każda komora jest wyposażona w polarograficzny czujnik tlenu. Zawiesiny komórkowe lub izolowane mitochondrialne są stale mieszane w respirometrze. Aby ocenić funkcję mitochondriów, substraty i inhibitory aktywności kompleksu mitochondrialnego można dodać zgodnie ze standardowymi protokołami. Substraty i inhibitory mogą być miareczkowane przez wstrzyknięcie do komór oksygraficznych, a wskaźniki zużycia tlenu są obliczane za pomocą oprogramowania i wyrażane w pikosolach na sekundę na liczbę komórek. Respirometria o wysokiej rozdzielczości ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi i konwencjonalnymi polarograficznymi elektrodami tlenowymi, w tym zwiększoną czułość i możliwość pracy z niewielką liczbą próbek biologicznych, takich jak nienaruszone lub przepuszczalne komórki. Ponadto każde urządzenie zawiera dwie komory, a częstość oddechów może być rejestrowana jednocześnie w celu porównania stężeń tlenu. Zaletą oksygrafu o wysokiej rozdzielczości jest również zmniejszony wyciek tlenu z komór urządzenia w porównaniu z tradycyjnymi polarograficznymi elektrodami tlenowymi. Innym niedawno opracowanym urządzeniem do pomiaru zużycia tlenu przez komórki jest 96-dołkowy analizator strumienia zewnątrzkomórkowego 5. Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest wyposażony w czujniki fluorescencyjne zamiast polarograficznych. Zalety analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego w porównaniu z oksygrafem o wysokiej rozdzielczości to: i) jest to urządzenie w dużej mierze zautomatyzowane, ii) możliwy jest pomiar zużycia tlenu na płytkach 24- i 96-dołkowych do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, co wymaga mniejszych ilości próbek biologicznych, oraz iii) możliwy jest dodatkowy pomiar komórkowego strumienia glikolitycznego. Wadą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego w porównaniu z oksygrafem o wysokiej rozdzielczości są i) wysokie koszty urządzenia i materiałów eksploatacyjnych, takich jak płytki fluorescencyjne, które nie nadają się do ponownego użycia, oraz ii) tylko cztery związki na test/studzienkę można wstrzykiwać, dlatego system nie jest wykonalny dla protokołów miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor.
W obecnym badaniu używamy respirometrii o wysokiej rozdzielczości do określenia oddychania mitochondrialnego. W eksperymentach z komórkowym zużyciem tlenu komórki są przepuszczalne, aby umożliwić wejście egzogennego ADP i utlenialnych substratów mitochondrialnych do dostarczania elektronów do kompleksów układu oddechowego. Takie podejście pozwala na rozbiór zdolności oddechowych poszczególnych kompleksów mitochondrialnych, co jest wyraźną zaletą w porównaniu z nienaruszonymi komórkami (wiele substratów jest nieprzepuszczalnych dla komórek). Jednak przepuszczalność błony komórkowej przerwie barierę między cytozolem a przestrzenią i pożywką zewnątrzkomórkową (wypłukanie z substancji rozpuszczonych cytozolowych), a skład przestrzeni wewnątrzkomórkowej zostanie zrównoważony z podłożem zewnątrzkomórkowym. Jedną z wad komórek przepuszczalnych w porównaniu z nienaruszonymi komórkami jest to, że zewnętrzna błona mitochondrialna może zostać uszkodzona, jeśli podczas przenikania komórek zastosuje się nadmierne ilości detergentu. W nienaruszonych komórkach można zmierzyć oddychanie podstawne, sprzężone i niesprzężone nienaruszonych komórek. Metoda ta ocenia zużycie tlenu przez nienaruszone komórki bez dodatku substratów egzogennych i ADP, odtwarzając funkcję oddechową w zintegrowanej komórce, a także dostarczając informacji na temat maksymalnej zdolności transportu elektronów w mitochondriach6,7. Jedną z zalet nienaruszonych komórek w porównaniu z komórkami przepuszczalnymi jest to, że środowisko komórkowe nie jest zakłócone, a mitochondria stykają się z całymi składnikami komórek. W celu przepuszczalności błony komórkowej zastosowano detergenty, takie jak digitonina8. Jednak integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej może być zagrożona, jeśli stosuje się nadmierne ilości digitoniny. Aby potwierdzić, że integralność błony zewnętrznej mitochondriów nie jest zagrożona w komórkach przepuszczalnych, przeprowadza się miareczkowanie digitoniny w celu określenia optymalnego stężenia przepuszczalności komórkowej. W tych eksperymentach komórki są ponownie zawieszane w pożywce oddechowej, a stężenie digitoniny jest miareczkowane za pomocą respirometrii w obecności substratów mitochondrialnych i ADP, a następnie mierzone są tempo oddychania. Oddychanie nienaruszonych, nieprzepuszczalnych komórek nie jest stymulowane w obecności substratów mitochondrialnych i ADP. Jednak późniejsze stopniowe miareczkowanie digitoniny zapewniłoby stopniową przepuszczalność błon plazmatycznych i uzyskano optymalne stężenie digitoniny. Świadczy o tym zwiększenie oddychania aż do pełnej przepuszczalności. Jakość mitochondriów i integralność błony zewnętrznej można zweryfikować, dodając egzogenny cytochrom c2,9. Cytochrom c jest białkiem przenoszącym elektron o masie 12 kDa w mitochondrialnym łańcuchu transportu elektronów 10,11,12. Jest zlokalizowany w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej i bierze udział w zużyciu tlenu, przenosząc elektrony z kompleksu III do kompleksu IV. Po uszkodzeniu zewnętrznej błony mitochondrialnej uwalniany jest cytochrom c, a zużycie tlenu w mitochondriach ulega zmniejszeniu. Po dodaniu egzogennego cytochromu c każde zwiększenie oddychania mitochondrialnego wskazuje na przerwaną błonę zewnętrzną mitochondriów.
W komórkach przepuszczalnych, substraty i inhibitory aktywności kompleksu mitochondrialnego są dodawane zgodnie z różnymi protokołami3,9. Na przykład w celu zbadania częstości oddechów sterowanych kompleksem mitochondrialnym można zastosować następujący protokół. Po przeniknięciu komórek, pierwszy kompleks I jest stymulowany przez substraty jabłczan i glutaminian, które generują NADH jako substrat do łańcucha oddechowego i prowokują aktywację kompleksu I. Następnie dodaje się ADP w celu konwersji do ATP (stan 3, oddychanie zależne od aktywnego kompleksu I). Po osiągnięciu stabilnego sygnału podaje się rotenon (inhibitor mitochondrialnego kompleksu I) w celu zahamowania kompleksu I. Po rotenonie podaje się bursztynian do FADH2 i aktywację kompleksu II (stan 3, oddychanie zależne od aktywnego kompleksu II). W celu pomiaru oddychania zależnego od kompleksu IV, pierwsze oddychanie zależne od kompleksu III jest hamowane przez dodanie antymycyny A (inhibitora kompleksu mitochondrialnego III). Następnie stymulowane jest kompleksowe oddychanie zależne od kroplówki poprzez podawanie askorbinianu i tetrametylofenylenodiaminy (TMPD). TMPD może ulegać samoutlenianiu w buforze oddechowym, dlatego maksymalną częstość oddychania zależną od kompleksu IV (stan 3) oblicza się przez odjęcie szybkości oddychania przed i po dodaniu azydku sodu, inhibitora mitochondrialnego kompleksu IV. Eksperymenty oddechowe mogą być przeprowadzane równolegle w dwóch komorach oksygraficznych - jedna służy jako kontrola (komórki niestymulowane), a druga zawiera komórki stymulowane. Oczywiście, komórki mogą być wstępnie poddane obróbce na różne sposoby, np. lekami wpływającymi na funkcje mitochondriów, zanim ich zużycie tlenu zostanie zmierzone w komorze oksygraficznej. Protokół ten pozwala na funkcjonalne badanie poszczególnych kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych. Ponadto można zmierzyć maksymalne oddychanie stymulowane ADP (stan 3) permeabilizowanych komórek, przy użyciu egzogennego kwasu tłuszczowego w postaci palmitynianu. W tym protokole skoncentrowane zapasy palmitynianu sodu są sprzężone z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) wolną od ultra kwasów tłuszczowych (BSA) (stosunek molowy palmitynianu 6:1:BSA). Następnie komórki są najpierw przepuszczane digitoniną, a oddychanie mitochondrialne ocenia się przez dodanie karnityny i palmitynianu, a następnie dodanie ADP (stan 3, maksymalne oddychanie). Następnie dodaje się oligomycynę do stanu naśladującego 4 (stan 4o) i oblicza się stosunek kontroli oddechowej (wartość RCR) jako stan 3 / stan 4o. β-utlenianie sprzyja wytwarzaniu acetylo-CoA (który wchodzi w cykl TCA) i wytwarzaniu FADH2 i NADH, których elektrony są przekazywane do łańcucha transportu elektronów przez flawoproteinę przenoszącą elektrony i dehydrogenazę β-hydroksyacylo-CoA. Mitochondria znajdują się w centrum metabolizmu kwasów tłuszczowych, a opisany protokół palmitynianu-BSA może być wykorzystywany przez naukowców badających utlenianie kwasów tłuszczowych. W nienaruszonych komórkach aktywatory i inhibitory aktywności kompleksu mitochondrialnego są dodawane zgodnie z innym protokołem6,9. W tych eksperymentach mierzy się pierwsze zużycie tlenu przez nieprzepuszczalne komórki przy braku substratów egzogennych (szybkość oddychania fosforylującego). Następnie mierzy się szybkość oddychania niefosforylującego po dodaniu oligomycyny, która jest inhibitorem mitochondrialnej syntazy ATP. Następnie podaje się p-trifluorometoksyfenylohydrazon protonoforu cyjanku karbonylu (FCCP) w różnych stężeniach i mierzy maksymalną częstość oddechów mitochondrialnych. Protonofory, takie jak FCCP, mogą indukować zwiększenie przepuszczalności protonów błony wewnętrznej, umożliwiając bierny ruch protonów w celu rozproszenia gradientu chemiosmotycznego. Wzrost przepuszczalności protonów rozprzęga oddychanie oksydacyjne (brak produkcji ATP) i indukuje wzrost zużycia tlenu. Następnie dodaje się rotenon i antymycynę A w celu zahamowania oddychania mitochondrialnego, a oddychanie niemitochondrialne jest odejmowane od wszystkich innych częstości oddechów.
Wskaźniki zużycia tlenu mogą być wyrażone jako IO2 [pmol x sec-1 x 10-6 komórek] (przepływ tlenu na milion komórek), który jest obliczany przez podzielenie objętościowego strumienia tlenu (w zamkniętej komorze tlenowej), JV,O2 [pmol x sec-1 x ml-1] przez stężenie komórek w komorze komórkowej (liczba komórek w objętości [106 komórek∙ml1])15. Strumień tlenu właściwy dla masy komórki, JO2 [pmol x sec-1 x mg-1], to przepływ na komórkę, IO2 [pmol x sec-1 x 10-6 komórek], podzielony przez masę na komórkę [mg∙106 komórek]; lub strumień objętościowy właściwy, JV, O2 [pmol x sec-1 x ml-1], podzielony przez masę na objętość [mg∙ml1]. JO2 to strumień tlenu na białko komórki, suchą masę lub objętość komórki.
W niniejszym badaniu wykorzystującym respirometrię o wysokiej rozdzielczości, opisujemy protokoły do określenia i) optymalnego stężenia digitoniny dla pełnej przepuszczalności błony komórkowej plazmatyki (test miareczkowania digitoniny), ii) integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej za pomocą egzogennego cytochromu C, iii) mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV maksymalnych częstości oddechów w komórkach HepG2 permeabilizowanych digitoniną w obecności egzogennego ADP i mitochondrialnego układu oddechowego substraty łańcuchowe, oraz iv) podstawowe, sprzężone i maksymalne oddychanie niesprzężone (maksymalna zdolność transportu elektronów) nienaruszonych komórek bez dodatku substratów egzogennych i ADP, odtwarzających funkcję oddechową w zintegrowanej komórce.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Chemiczny, rozpuszcza się w etanolu</td></tr><tr><td>Askorbinian</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C 2920</td><td>Chemiczny, rozpuszcza się w etanolu</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Automatyczny przyrząd do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma</td><td>C 7752</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma</td><td>D 5628</td><td>Chemiczny, rozpuszcza się w DMSO</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td>Medium</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td>Średni składnik</td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma</td><td>G 1626</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>Sigma H 7523</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>K-laktobionian</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>rdzeń O2k: Oxygraph-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Przyrząd do respirometrii o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma</td><td>O 4876</td><td>Substancja chemiczna, rozpuszczać się w etanolu</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Substancja chemiczna</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Chemiczny, rozpuszcza się w etanolu</td></tr><tr><td>Bursztynian</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T 4674</td><td>Chemiczny</td></tr></tbody></table>

respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Wysokorozdzielczy oksygram to urządzenie do pomiaru zużycia tlenu przez komórki w systemie zamkniętej komory z bardzo wysoką rozdzielczością i czułością w próbkach biologicznych (nienaruszone i przepuszczalne komórki, tkanki lub izolowane mitochondria). Urządzenie oksygraficzne o wysokiej rozdzielczości jest wyposażone w dwie komory i wykorzystuje polarograficzne czujniki tlenu do pomiaru stężenia tlenu i obliczania zużycia tlenu w każdej komorze. Wskaźniki zużycia tlenu są obliczane za pomocą oprogramowania i wyrażane w pikosolach na sekundę na liczbę komórek. Każda komora oksygraficzna o wysokiej rozdzielczości zawiera korek z portami iniekcyjnymi, co czyni ją idealną do miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor lub protokołów miareczkowania detergentem w celu określenia skutecznych i optymalnych stężeń przepuszczalności błony plazmatycznej. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w szerokim zakresie typów komórek, a także dostarcza informacji na temat jakości i integralności mitochondriów oraz maksymalnej zdolności mitochondrialnego systemu transportu elektronów oddechowych.

Wyznaczenie optymalnego stężenia digitoniny do permeabilizacji komórek: eksperyment z miareczkowaniem digitoniny
Miareczkowanie digitoniną przeprowadza się w celu ustalenia optymalnego stężenia niezbędnego do permeabilizacji komórek HepG2. W badaniach tych digitoninę miareczkowano w nienaruszonych komórkach w obecności rotenonu, bursztynianu (substratu kompleksu II mitochondriów) oraz nasycającej ilości ADP (w celu wywołania stanu ...

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie respirometrii o wysokiej rozdzielczości do określenia zużycia tlenu w mitochondriach. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zespołów i chorób związanych z dysfunkcją mitochondriów, takich jak; sepsa, różne choroby neurologiczne i zaburzenia związane z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma wyższą czułość i możliwość przeprowadzania eksperymentów z substratem na sprzężonych miareczkowaniach inhibitorów z niewielką liczbą próbek biologicznych, takich jak nienaruszone lub przepuszczalne komórki.Procedurę zademonstruje Sandra Nansoz, technik z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem zabiegu należy skalibrować polarograficzne czujniki tlenu powietrzem, a następnie ponownie zawiesić komórki w buforze oddechowym do stężenia jeden razy dziesięć do szóstego na mililitr i zastąpić pożywkę oddechową w jednej komorze oksygramu 2,1 mililitra zawiesiny komórek. Zamknij komorę korkiem i ustaw mieszadło magnetyczne w komorze na 700 obrotów na minutę.Następnie rejestruj oddech komórkowy przez 5 do 10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. Następnie za pomocą strzykawki wstrzyknij dwa mikrolitry rotenonu przez tytanowy port iniekcyjny do komory oksygraficznej i rejestruj oddychanie komórkowe przez kolejne 5 do 10 minut. Po osiągnięciu stabilnego sygnału strumienia tlenu wstrzyknąć 20 mikrolitrów jednego molowego bursztynianu, a następnie 10 mikrolitrów 0,5 molowego ADP.Następnie wstrzyknąć dwie objętości po dwa mikrolitry dwumilimolowej digitoniny i rejestrować oddech komórkowy przez dwie do pięciu minut po każdym wstrzyknięciu, a następnie stopniowo wstrzykiwać od dwóch do czterech mikrolitrów dwumilimolowej digitoniny, aż sygnał strumienia tlenu osiągnie maksymalny poziom, a dalsze wstrzyknięcia digitoniny nie zwiększają częstości oddechów. W celu oceny integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej należy przygotować komorę oksygraficzną, jak właśnie pokazano, i wstrzyknąć dwa mikrolitry ośmiomilimolowej digitoniny w celu przepuszczalności komórek. Po pięciu minutach wstrzyknij 20 mikrolitrów jednego molowego bursztynianu i rejestruj oddychanie komórkowe przez 5 do 10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.Następnie wstrzyknij 10 mikrolitrów 0,5 molowego ADP, aby stymulować kompleks drugi i wywołać wzrost zużycia tlenu. Po uzyskaniu stabilnego sygnału strumienia wstrzyknąć pięć mikrolitrów czteromilimolowego cytochromu c, a następnie jeden mikrolitr czterech miligramów na mililitr ligamycyny. Aby zmierzyć stymulowane ADP oddychanie komórek raka wątrobowokomórkowego wątroby, przygotuj komorę oygrafu, jak właśnie pokazano, i wstrzyknij dwa mikrolitry ośmiomilimolowej digitoniny do komory tlenowej, aby przepuszczalność komórek przez pięć minut, a następnie wstrzyknąć 12,5 mikrolitra 0,8 molowej malamenu i 10 mikrolitrów dwóch molowych glutaminianu.Po osiągnięciu stabilnego strumienia tlenu wstrzyknij 10 mikrolitrów 0,5 molowego ADP, aby zwiększyć zużycie tlenu, a następnie dwa mikrolitry 0,2 milimolowego rotenonu i 20 mikrolitrów jednego molowego bursztynianu. Następnie wstrzyknij dwa mikrolitry pięciomilimolowej antymycyny i zarejestruj oddychanie komórkowe. Gdy sygnał zmniejszy się i ustabilizuje, wstrzyknij 2,5 mikrolitra 0,8 milimolowego eskorbinianu, a następnie natychmiast wstrzyknij 2,5 mikrolitra 0,2 milimolowego TMPD, rejestrując oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.Następnie wstrzyknąć 10 mikrolitrów jednego molowego azytianu sodu do komory oksygraficznej i rejestrować aspirację komórkową, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje. Aby zmierzyć zużycie tlenu w nienaruszonej komórce, przygotuj komorę oksygraficzną, jak właśnie pokazano, i wstrzyknij 1 mikrolitr czterech miligramów na mililitr aligimicyny, a następnie jeden i trzy mikrolitry wstrzyknięć 0,2 milimolowego FCCP. Następnie miareczkować FCCP w krokach od 0,1 do 0,3 mikromola, wstrzykując od jednego do trzech mikrolitrów 0,2 do jednego milimolowego FCCP, aż sygnał strumienia tlenu osiągnie maksymalny poziom bez dalszych wzrostów, a następnie zacznie spadać.Następnie wstrzyknąć dwa mikrolitry 0,2 milimolowego rotenonu i dwa mikrolitry pięciomilimolowej antymycyny A i rejestrować oddech, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje. Przy braku digitoniny oddychanie komórkowe jest bardzo niskie, a oddychanie nienaruszonych, nieprzepuszczalnych komórek nie jest stymulowane w obecności substratu mitochondrialnego i ADP. Jednak po stopniowym dodawaniu digitoniny błona komórkowa plazmatyki ulega przepuszczalności, a oddychanie mitochondrialne zwiększa się aż do pełnej przepuszczalności, w którym to czasie bursztynian i ADP dostają się do komórek.Integralność błony zewnętrznej mitochondriów może być jednak zagrożona, jeśli stosuje się nadmierne ilości digitoniny, indukując zmniejszenie oddychania złożonego do stanu zależnego trzeciego. Cytochrom c nie wzmacnia oddychania złożonego do stanu zależnego trzeciego w komórkach traktowanych digitoniną, co wskazuje, że nie ma utraty cytochromu c z zewnętrznej błony mitochondriów i że integralność mitochondriów jest zachowana, mimo że cytochrom c może poprawić oddychanie komórek traktowanych bardzo wysokimi dawkami digitoniny. Dodanie egzogennych substratów aktywności kompleksu mitochondrialnego po permeablizacji digitoniny indukuje wzrost mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego jeden, dwa i cztery maksymalne częstości oddechów.Generowanie obniżonych poziomów oddechowych może być spowodowane zanieczyszczeniem komór oksygraficznych inhibitorami mitochondrialnymi z poprzedniego eksperymentu. W obecności alygimycyny i sekwencyjnego dodawania FCCP obserwuje się maksymalną niesprzężoną częstość oddechów komórek. Po opanowaniu każdą z tych technik można wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podejmując się tej procedury, bardzo ważne jest, aby po każdym eksperymencie dokładnie pamiętać o komorach oksygraficznych i korkach do mycia. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak pomiary zawartości ATP w komórkach, z których każda przedstawia aktywność cymatyczną, poziomy substratów mitochondrialnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy zmiany w częstości oddechów są spowodowane brakiem substratów mitochondrialnych, czy zmniejszoną aktywnością ATP cyntate. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się bionegetyką do badania funkcji mitochondriów w takich dziedzinach, jak nabyte i genetyczne choroby mitochondrialne, stres oksydacyjny, uszkodzenia perfuzji skóry i starzenie się w nienaruszonych lub przepuszczalnych komórkach lub włóknach oraz izolowanych mitochondriach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wspomagać funkcjonowanie mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Nie zapominaj, że praca z antymycyną a, rotenonem, jozydem sodu, FCCP i arykomycyną może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.

high-resolution-respirometry-to-assess-mitochondrial-function

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Celem tego protokołu jest zmierzenie wpływu zmian w oddychaniu mitochondrialnym za pośrednictwem glukozy w obecności naturalnych związków na nienaruszone komórki beta 832/13 za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

Tutaj pokazujemy, że komora 0,5 ml do respirometrii o wysokiej rozdzielczości pokazuje wyniki, które są zgodne z komorą 2,0 ml, jeśli zastosuje się odpowiednią instrumentalną korekcję tłaO2. Wymaga mniejszej próbki, co jest korzystne w przypadku badań o ograniczonej dostępności lub niskiej wydolności oddechowej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości w komorze o małej objętości

Poznaj respirometrię o wysokiej rozdzielczości do badania funkcji mitochondriów w komórkach nienaruszonych i przepuszczalnych. Ta metoda pozwala ocenić zużycie tlenu z dużą czułością przy minimalnej ilości próbek biologicznych.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Przeglądaj więcej filmów