Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie respirometrii o wysokiej rozdzielczości do określenia zużycia tlenu w mitochondriach. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zespołów i chorób związanych z dysfunkcją mitochondriów, takich jak; sepsa, różne choroby neurologiczne i zaburzenia związane z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma wyższą czułość i możliwość przeprowadzania eksperymentów z substratem na sprzężonych miareczkowaniach inhibitorów z niewielką liczbą próbek biologicznych, takich jak nienaruszone lub przepuszczalne komórki.

Procedurę zademonstruje Sandra Nansoz, technik z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem zabiegu należy skalibrować polarograficzne czujniki tlenu powietrzem, a następnie ponownie zawiesić komórki w buforze oddechowym do stężenia jeden razy dziesięć do szóstego na mililitr i zastąpić pożywkę oddechową w jednej komorze oksygramu 2,1 mililitra zawiesiny komórek. Zamknij komorę korkiem i ustaw mieszadło magnetyczne w komorze na 700 obrotów na minutę.

Następnie rejestruj oddech komórkowy przez 5 do 10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. Następnie za pomocą strzykawki wstrzyknij dwa mikrolitry rotenonu przez tytanowy port iniekcyjny do komory oksygraficznej i rejestruj oddychanie komórkowe przez kolejne 5 do 10 minut. Po osiągnięciu stabilnego sygnału strumienia tlenu wstrzyknąć 20 mikrolitrów jednego molowego bursztynianu, a następnie 10 mikrolitrów 0,5 molowego ADP.

Następnie wstrzyknąć dwie objętości po dwa mikrolitry dwumilimolowej digitoniny i rejestrować oddech komórkowy przez dwie do pięciu minut po każdym wstrzyknięciu, a następnie stopniowo wstrzykiwać od dwóch do czterech mikrolitrów dwumilimolowej digitoniny, aż sygnał strumienia tlenu osiągnie maksymalny poziom, a dalsze wstrzyknięcia digitoniny nie zwiększają częstości oddechów. W celu oceny integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej należy przygotować komorę oksygraficzną, jak właśnie pokazano, i wstrzyknąć dwa mikrolitry ośmiomilimolowej digitoniny w celu przepuszczalności komórek. Po pięciu minutach wstrzyknij 20 mikrolitrów jednego molowego bursztynianu i rejestruj oddychanie komórkowe przez 5 do 10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.

Następnie wstrzyknij 10 mikrolitrów 0,5 molowego ADP, aby stymulować kompleks drugi i wywołać wzrost zużycia tlenu. Po uzyskaniu stabilnego sygnału strumienia wstrzyknąć pięć mikrolitrów czteromilimolowego cytochromu c, a następnie jeden mikrolitr czterech miligramów na mililitr ligamycyny. Aby zmierzyć stymulowane ADP oddychanie komórek raka wątrobowokomórkowego wątroby, przygotuj komorę oygrafu, jak właśnie pokazano, i wstrzyknij dwa mikrolitry ośmiomilimolowej digitoniny do komory tlenowej, aby przepuszczalność komórek przez pięć minut, a następnie wstrzyknąć 12,5 mikrolitra 0,8 molowej malamenu i 10 mikrolitrów dwóch molowych glutaminianu.

Po osiągnięciu stabilnego strumienia tlenu wstrzyknij 10 mikrolitrów 0,5 molowego ADP, aby zwiększyć zużycie tlenu, a następnie dwa mikrolitry 0,2 milimolowego rotenonu i 20 mikrolitrów jednego molowego bursztynianu. Następnie wstrzyknij dwa mikrolitry pięciomilimolowej antymycyny i zarejestruj oddychanie komórkowe. Gdy sygnał zmniejszy się i ustabilizuje, wstrzyknij 2,5 mikrolitra 0,8 milimolowego eskorbinianu, a następnie natychmiast wstrzyknij 2,5 mikrolitra 0,2 milimolowego TMPD, rejestrując oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.

Następnie wstrzyknąć 10 mikrolitrów jednego molowego azytianu sodu do komory oksygraficznej i rejestrować aspirację komórkową, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje. Aby zmierzyć zużycie tlenu w nienaruszonej komórce, przygotuj komorę oksygraficzną, jak właśnie pokazano, i wstrzyknij 1 mikrolitr czterech miligramów na mililitr aligimicyny, a następnie jeden i trzy mikrolitry wstrzyknięć 0,2 milimolowego FCCP. Następnie miareczkować FCCP w krokach od 0,1 do 0,3 mikromola, wstrzykując od jednego do trzech mikrolitrów 0,2 do jednego milimolowego FCCP, aż sygnał strumienia tlenu osiągnie maksymalny poziom bez dalszych wzrostów, a następnie zacznie spadać.

Następnie wstrzyknąć dwa mikrolitry 0,2 milimolowego rotenonu i dwa mikrolitry pięciomilimolowej antymycyny A i rejestrować oddech, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje. Przy braku digitoniny oddychanie komórkowe jest bardzo niskie, a oddychanie nienaruszonych, nieprzepuszczalnych komórek nie jest stymulowane w obecności substratu mitochondrialnego i ADP. Jednak po stopniowym dodawaniu digitoniny błona komórkowa plazmatyki ulega przepuszczalności, a oddychanie mitochondrialne zwiększa się aż do pełnej przepuszczalności, w którym to czasie bursztynian i ADP dostają się do komórek.

Integralność błony zewnętrznej mitochondriów może być jednak zagrożona, jeśli stosuje się nadmierne ilości digitoniny, indukując zmniejszenie oddychania złożonego do stanu zależnego trzeciego. Cytochrom c nie wzmacnia oddychania złożonego do stanu zależnego trzeciego w komórkach traktowanych digitoniną, co wskazuje, że nie ma utraty cytochromu c z zewnętrznej błony mitochondriów i że integralność mitochondriów jest zachowana, mimo że cytochrom c może poprawić oddychanie komórek traktowanych bardzo wysokimi dawkami digitoniny. Dodanie egzogennych substratów aktywności kompleksu mitochondrialnego po permeablizacji digitoniny indukuje wzrost mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego jeden, dwa i cztery maksymalne częstości oddechów.

Generowanie obniżonych poziomów oddechowych może być spowodowane zanieczyszczeniem komór oksygraficznych inhibitorami mitochondrialnymi z poprzedniego eksperymentu. W obecności alygimycyny i sekwencyjnego dodawania FCCP obserwuje się maksymalną niesprzężoną częstość oddechów komórek. Po opanowaniu każdą z tych technik można wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, bardzo ważne jest, aby po każdym eksperymencie dokładnie pamiętać o komorach oksygraficznych i korkach do mycia. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak pomiary zawartości ATP w komórkach, z których każda przedstawia aktywność cymatyczną, poziomy substratów mitochondrialnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy zmiany w częstości oddechów są spowodowane brakiem substratów mitochondrialnych, czy zmniejszoną aktywnością ATP cyntate. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się bionegetyką do badania funkcji mitochondriów w takich dziedzinach, jak nabyte i genetyczne choroby mitochondrialne, stres oksydacyjny, uszkodzenia perfuzji skóry i starzenie się w nienaruszonych lub przepuszczalnych komórkach lub włóknach oraz izolowanych mitochondriach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wspomagać funkcjonowanie mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Nie zapominaj, że praca z antymycyną a, rotenonem, jozydem sodu, FCCP i arykomycyną może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.