Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie przypadkowo zlokalizowanych mRNA w próbkach mózgu dorosłych osób. Osiąga się to poprzez obróbkę wstępną. Próbki poprzez gotowanie i trawienie proteazy w celu zdemaskowania cząsteczek mRNA w drugim etapie przeprowadzana jest hybrydyzacja, a następnie etapy amplifikacji i detekcji, które umożliwiają wizualizację interesującego mRNA.

Następnie aksony są barwione przeciwciałami lub barwnikami w celu sprawdzenia, czy interesujące mRNA jest zlokalizowane w aksonach. Wyniki wskazują na obecność mRNA TF four w próbkach mózgu przy użyciu różnych procedur demaskowania i liczników, metod barwienia opartych na analizach mikroskopowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania w neurobiologii, takie jak to, które mRNA są zlokalizowane i translowane bez eksonów.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w syntezę białek wewnątrzkonowych, może być również stosowana do innych systemów, takich jak dendryty oraz komórki i tkanki nieneuronalne, w których zachodzi lokalizacja mRNA. Po utrwaleniu wycinków mózgu, zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnym protokole, przygotuj słoik z kopią zawierający 60 mililitrów roztworu do pobierania antygenu i zanurz szkiełka w roztworze. Następnie napełnij jednolitrową zlewkę wodą destylowaną i umieść ją w kuchence mikrofalowej, aby zbuforować ciepło.

Podczas wykonywania demaskowania umieść słoik coplan zawierający szkiełka i roztwór do pobierania w kuchence mikrofalowej. Gotuj szkiełka na dużej mocy przez pięć minut. Natychmiast po tym, jak roztwór przestanie wrzeć, ponownie podgrzej szkiełka z dużą mocą przez dodatkowe pięć minut.

Pozwól szkiełkom ostygnąć w temperaturze pokojowej Po schłodzeniu zanurz szkiełka w naczyniu zawierającym PBS, aby je umyć, a następnie powtórz pranie jeszcze dwa razy Po umyciu umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i dodaj dwie do trzech kropli lub 100 mikrolitrów DAP B.Probe do dwóch lub trzech sekcji mózgu jako kontrola. Aby ocenić barwienie tła, dodaj dwie do trzech kropli sondy celowniczej do sekcji eksperymentalnych Aby wykryć interesujące RNA, stosuje się tutaj sondę celującą w reszty od 20 do 1381 myszy TF cztery RNA. Użyj kleszczyków, aby umieścić param na szkiełkach, aby uniknąć parowania sondy.

Następnie umieść szkiełka w nawilżonym pudełku na szkiełka w piecu do hybrydyzacji i inkubuj je w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po upływie czasu inkubacji umyć szkiełka w naczyniu z jednym buforem do płukania przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj dwie do trzech kropli odczynnika do amplifikacji MP po jednej fl do każdego wycinka mózgu.

Następnie przykryj świeżą folią para, umieść w pudełku na szkiełka i inkubuj w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 15 minut w piecu do hybrydyzacji. Po umyciu szkiełek jak poprzednio, dodaj dwie do trzech kropli odczynnika do amplifikacji A MP cztery fl do każdego wycinka mózgu i przykryj perfilem. Inkubować szkiełka w pudełku ze szkiełkami w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 15 minut w piecu do hybrydyzacji.

Umyj szkiełka dwukrotnie jednym buforem do płukania przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Tak jak poprzednio, po ostatnim praniu przykryj każdą plasterkę 100 do 200 mikrolitrami roztworu blokującego zawierającego trzy miligramy na mililitr BSA 100 milimolowej glicyny i 0,25% Triton X 100 w PBS, przykryj każde szkiełko paraformem i inkubuj przez 30 minut W temperaturze pokojowej po inkubacji dodać do szkiełek od 100 do 200 mikrolitrów przeciwciała rozcieńczonego w roztworze blokującym. Stosuje się tutaj przeciwciało anty choliny acetylotransferazy po pokryciu szkiełek inkubatem perfil przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Upewnij się, że plastry mózgu nie wyschną w razie potrzeby, ponownie nałóż roztwór przeciwciała anty CHATT na wycinki mózgu 24 godziny po inkubacji. Po umyciu szkiełek trzy razy w jednym XPBS przez pięć minut. W temperaturze pokojowej dodaj do szkiełek od 100 do 200 mikrolitrów odpowiedniego sprzężonego przeciwciała drugorzędowego Alexa.

Przykryj param i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem po upływie godziny. Umyj szkiełka trzy razy w jednym XPBS przez pięć minut każde, tak jak poprzednio, a następnie umyj raz wodą destylowaną. Zamontuj szkiełka z podłożem montażowym zawierającym DPI, a następnie zwizualizuj wycinki mózgu pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Po przygotowaniu formalnych i utrwalonych próbek ludzkiego mózgu zatopionych w parafinie, zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu, należy przeprowadzić demaskowanie antygenu wywołanego ciepłem, zanurzając szkiełka w gorącym roztworze wstępnym i gotując przez 15 minut. Po umyciu trzy do pięciu razy w wodzie destylowanej i trzy do pięciu razy w świeżym 100% etanolu, pozostaw szkiełka do wyschnięcia na pięć minut w temperaturze pokojowej, aby przeprowadzić demaskowanie antygenu wywołanego proteazą. Dodaj cztery krople wstępnej obróbki, przykryj perfilem i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji Po umyciu trzy do pięciu razy w wodzie destylowanej.

Tak jak poprzednio, dodaj cztery krople sondy DAP B ustawionej do kontrolowania wycinków mózgu w celu oceny barwienia tła i cztery krople sondy celowniczej ustawionej na sekcje eksperymentalne. Umieść parę szkiełek pokrytych folią w pudełku ze szkiełkami i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji. Po wykonaniu kroków zawartych w pisemnym protokole w celu opracowania sygnału DAB dla interesującego mRNA, sprawdź obecność sygnału pod mikroskopem jasnego pola.

Zdefiniuj obszary referencyjne w próbkach mózgu, w których należy monitorować obecność puncta przez cały czas trwania procedury barwienia przeciwbarwiącego. Aby przeciwdziałać plamom. Najpierw umieść szkiełka w luksusowym fast blue podgrzanym do 60 stopni Celsjusza i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza.

Po inkubacji kilkakrotnie przepłukać szkiełka w wodzie destylowanej, a następnie kilkakrotnie zanurzyć szkiełka w 0,05% roztworze węglanu litu, aby rozpocząć różnicowanie. Następnie zanurz szkiełka dwukrotnie w świeżym, 75% etanolu i spłucz w wodzie destylowanej. Sprawdź wycinki mózgu pod mikroskopem jasnego pola.

Należy pamiętać, że istota szara i biała powinny zacząć być rozróżnialne, a granulki RNA nadal widoczne jako ciemnoniebiesko-puncta. Sprawdź, czy aksony zaczynają pojawiać się jako jasnoniebieskie włókna, powtórz procedurę barwienia luksusowego niebieskiego, inkubując z luksemnym błękitem w 10-20-minutowych krokach i uważnie monitorując barwienie przeciwstawne i obecność granulek RNA, gdy osiągnięte zostanie optymalne barwienie. Umieścić szkiełka płuczące w roztworze fioletu wyrostka zębodołowego i inkubować przez 10 minut po inkubacji.

Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej. Zanurz szkiełka w 70% etanolu od pięciu do 10 razy, a następnie odwadnij przez trzy szybkie wymiany 100% etanolu w dygestorium. Oczyść plastry mózgu przez dwukrotną inkubację w ksylenie.

Alternatywny środek czyszczący przez dwie minuty i trzeci raz przez pięć minut. W temperaturze pokojowej zamontuj plastry mózgu w trwałym podłożu montażowym na bazie ksylenu i przeanalizuj pod mikroskopem jasnego pola. Na rybach przeprowadzono demaskowanie wywołane proteazą, a następnie wykryto przeciwciała acetylotransferazy choliny pokazane na czerwono.

Przeciwciało nie rozpoznało czatu, gdy przeprowadzono leczenie proteazą. Przedstawiono przykłady wyników uzyskanych za pomocą sondy innej niż tarczowa i sondy celowniczej TF four przy użyciu tych samych ustawień mikroskopu i regulacji obrazu. Zielony ATF: cztery dodatnie granulki z niejasną lokalizacją aksonalną są oznaczone znakami zapytania.

Niebieskie obszary to wilgotne zabarwione jądra, gdy ryba została wykonana przy użyciu antygenu wywołanego ciepłem. Zdemaskowanie barwienia immunofluorescencyjnego czatu ponownie pokazanego na czerwono zakończyło się sukcesem. Cztery dodatnie granulki TF zlokalizowane w aksonach wydają się pomarańczowe i są oznaczone jako w porządku, po których aksony były przeciwbarwione luxalem.

Szybki niebieski i neuronalny SOTA zostały wybarwione fioletem wyrostka zębodołowego suboptymalnym luxalem. Szybkie zabarwienie na niebiesko może nastąpić, jeśli temperatura zostanie obniżona. Tutaj próbki barwiono luksusowym, szybkim błękitem w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

TF cztery dodatnie granulki z niejasną przypadkową lokalizacją są oznaczone znakami zapytania. Nieoptymalne barwienie występuje również wtedy, gdy intensywność barwienia przeciw nie jest sprawdzana po krótkich okresach inkubacji, jak pokazano tutaj. Przykłady optymalnego barwienia LFB w połączeniu z ish przy użyciu sondy niedocelowej lub sondy celowniczej TF z czterema tarczami są pokazane tutaj.

Akwizycja obrazu została automatycznie dostosowana w celu uzyskania najlepszego stosunku sygnału do szumu. Axon zlokalizował TF cztery granulki są oznaczone jako w porządku. Raz opanowane.

Technikę tę można wykonać w ciągu jednego do trzech dni, w zależności od wybranej metody barwienia po jej rozwinięciu. Technika ta otwiera drogę neurobiologom do badania translacji i lokalizacji mRNA w niuansach.