Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w nowotworach przy użyciu immunofluorescencji ilościowej

Tutaj opisujemy metodę ilościowego określania heterogeniczności molekularnej w histologicznych przekrojach materiału nowotworowego za pomocą ilościowej immunofluorescencji, analizy obrazu i statystycznej miary heterogeniczności. Metoda jest przeznaczona do stosowania w opracowywaniu i analizie biomarkerów klinicznych.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest dokładne ilościowe określenie ekspresji biomarkerów w całych odcinkach tkanek ludzkiego raka w celu przypisania wartości liczbowej do stopnia niejednorodności ekspresji białek. Osiąga się to poprzez uprzednie skanowanie znakowanych immunologicznie odcinków tkanki nowotworowej za pomocą skanera fluorescencyjnego na całym szkiełku. Kolejne obszary zainteresowania w obrębie guza są wybierane do oceny.

Następnie ekspresja białka będącego przedmiotem zainteresowania w inwazyjnych obszarach guza jest określana ilościowo za pomocą zautomatyzowanego systemu analizy obrazu aqua analysis. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do mapowania ekspresji biomarkerów w tkance nowotworowej, która często jest bardzo niejednorodna w całym wycinku tkanki. Główną zaletą stosowania tych technik w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak immunohistochemia z wykorzystaniem odczynników do wizualizacji kolorów i metryk, jest to, że immunofluorescencja jest bardziej ilościowa i bardziej czuła.

Łącząc te metody analityczne z całym przekrojem, skanowanie immunofluorescencyjne umożliwia precyzyjne mapowanie subtelnych zmian w ekspresji biomarkerów w tkankach. Po raz pierwszy Mark Gustafson, bezpośredni dyrektor operacyjny w laboratorium Histo RX, demonstruje te procedury. Po mikrotomie, podziale biopsji tkanki nowotworowej i barwieniu immunofluorescencyjnym próbki w celu wyrażenia interesujących biomarkerów, należy załadować do pięciu szkiełek z wybarwionymi skrawkami do kasety szkiełek skanera do szkiełek.

Następnie za pomocą interfejsu w konsoli obszaru skanowania. Dla każdego szkiełka wybierz obszar, który ma objąć całą tkankę na szkiełku, niezależnie od wzoru barwienia lub innych obserwowalnych aspektów próbki. Następnie, korzystając z konsoli lunety skanowania, najpierw wybierz region tkanki do oceny idealnie w obszarze guza tkanki, aby zapewnić najlepszą reprezentację.

Teraz, korzystając z funkcji automatycznej ekspozycji konsoli lunety skanującej, określ czas ekspozycji dla każdego kanału wraz z ostrością obrazu, użyj niebieskiego rombu na obrazie konsoli lunety skanowania, aby wybrać dodatkowy obszar z dala od tkanki, ale nadal w obszarze szkiełka pod szkiełkiem nakrywkowym, aby zdefiniować obszar tła, w którym zostaną uzyskane obrazy korekcji płaskiego pola. Dla każdego filtra dodaj punkty ostrości do obszaru tkanki reprezentowanego przez żółte kwadraty, aby zoptymalizować przechwytywanie obrazu. Jeśli obrazy wydają się mieć wysokie tło lub inne artefakty obrazu, obszar obrazu powinien zostać przesunięty i uzyskane nowe obrazy.

Tkanka jest następnie skanowana, a pozyskane obrazy preparatów cyfrowych są następnie automatycznie przesyłane do bazy danych widma Aperio. Kliknij dwukrotnie obraz miniatury programu widma, aby wybrać slajd do analizy z cyfrowej listy slajdów w bazie danych widma. Następnie, korzystając z dołączonego obrazu z adnotacjami h i D, opisz obszar zainteresowania na obrazie fluorescencyjnym.

W jednej próbce można wybrać wiele obszarów zainteresowania wyznaczonych za pomocą indywidualnych okręgów. Obrazy z adnotacjami są automatycznie zapisywane w bazie danych widma. Teraz wybierz Analizuj z paska menu u góry ekranu, gdy pojawi się okno analizy, wybierz jegodo analizy RX aqua z menu rozwijanego.

Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia, naciśnij przycisk analizy, na pasku zadań systemu Windows pojawi się zminimalizowane okno konsoli wyświetlające postęp przesyłania obrazów z bazy danych Spectrum na komputer lokalny. Po przesłaniu danych rozpocznie się analiza aqua w celu wygenerowania wyniku aqua przy użyciu nienadzorowanego algorytmu punktacji aqua opartego na grupowaniu danych pierwszego progu próbki, sygnału obrazu pan, cytokeratyny powyżej sygnału obrazu tła. Umożliwi to wykorzystanie pikseli do zdefiniowania maski nowotworowej, która następnie może być wykorzystana do kolejnych obliczeń.

Użyj pikseli cytokeratyny o wysokiej ekspresji, aby również zdefiniować cytoplazmatyczne lub niejądrowe regiony komórek nowotworowych. Jak widać tutaj, piksele o wysokim sygnale w kanale DPI, które znajdują się w masce nowotworowej, są identyfikowane jako jądrowe o charakterze jądrowym. Jeśli po przeglądzie zostaną zidentyfikowane pola, które nie nadawały się do oceny ze względu na artefakty próbki lub obrazowania, pola te zostaną usunięte z punktacji i również dadzą ostateczny wynik niepowodzenia.

Wyniki punktacji aqua są reprezentowane jako tabela wyników powiązanych z każdym kafelkiem o wymiarach 512 na 512 pikseli w obszarze zainteresowania w całej próbce przekroju tkanki, którą można zapisać i wykorzystać do późniejszej analizy statystycznej. Te mikrofotografie poplamione hemat toiną i eoiną pokazują, jak różne obszary tego samego raka jajnika mogą wykazywać zmienną morfologię. Widok o dużej mocy w prawym górnym rogu ryciny B podkreśla komórki z oczyszczaniem cytoplazmatycznym i solidnym wzorcem wzrostu w górnej części guza.

Dolna część tkanki powiększona w prawej dolnej części rysunku C ma jednak bardziej jednorodną cytoplazmę eozynofilową i brodawkowaty wzór wzrostu. W tym przypadku heterogeniczne mapy cieplne ekspresji ER w wycinku tkankowym raka jajnika przed i po leczeniu chemioterapią są pokazane odpowiednio w górnym i dolnym panelu. Zwróć uwagę na zmianę od zmiennego wyrażenia ER w całej sekcji z obszarami zarówno wysokiego, jak i niskiego wyrażenia na górnym rysunku do równomiernego rozkładu wysokiego wyrażenia ER zilustrowanego na czerwono na dolnym rysunku.

Liczbowa reprezentacja tej zmiany jest oznaczona po lewej stronie spadkiem indeksu Simpsonów. Na tym rysunku mapy cieplne niejednorodności HER dwóch w wycinku tkankowym raka jajnika są ponownie pokazane przed i po terapii, jak widać odpowiednio w górnym i dolnym panelu. Zwróćmy uwagę na zmianę ze zmiennej HER two wyrażenia w przekroju z obszarami zarówno wysokiego, jak i niskiego wyrażenia na górnym rysunku na równomierny rozkład wysokiego wyrażenia HER two na dolnym rysunku.

Po raz kolejny widać, że indeks Simpsonów spada. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że jakość danych generowanych przez analizę obliczeniową jest tylko tak dobra, jak jakość barwienia, a ta musi być na wysokim poziomie technicznym.