Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w nowotworach przy użyciu immunofluorescencji ilościowej
25 października 2011
Tutaj opisujemy metodę ilościowego określania heterogeniczności molekularnej w histologicznych przekrojach materiału nowotworowego za pomocą ilościowej immunofluorescencji, analizy obrazu i statystycznej miary heterogeniczności. Metoda jest przeznaczona do stosowania w opracowywaniu i analizie biomarkerów klinicznych.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest dokładne ilościowe określenie ekspresji biomarkerów w całych odcinkach tkanek ludzkiego raka w celu przypisania wartości liczbowej do stopnia niejednorodności ekspresji białek. Osiąga się to poprzez uprzednie skanowanie znakowanych immunologicznie odcinków tkanki nowotworowej za pomocą skanera fluorescencyjnego na całym szkiełku. Kolejne obszary zainteresowania w obrębie guza są wybierane do oceny.
Następnie ekspresja białka będącego przedmiotem zainteresowania w inwazyjnych obszarach guza jest określana ilościowo za pomocą zautomatyzowanego systemu analizy obrazu aqua analysis. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do mapowania ekspresji biomarkerów w tkance nowotworowej, która często jest bardzo niejednorodna w całym wycinku tkanki. Główną zaletą stosowania tych technik w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak immunohistochemia z wykorzystaniem odczynników do wizualizacji kolorów i metryk, jest to, że immunofluorescencja jest bardziej ilościowa i bardziej czuła.
Łącząc te metody analityczne z całym przekrojem, skanowanie immunofluorescencyjne umożliwia precyzyjne mapowanie subtelnych zmian w ekspresji biomarkerów w tkankach. Po raz pierwszy Mark Gustafson, bezpośredni dyrektor operacyjny w laboratorium Histo RX, demonstruje te procedury. Po mikrotomie, podziale biopsji tkanki nowotworowej i barwieniu immunofluorescencyjnym próbki w celu wyrażenia interesujących biomarkerów, należy załadować do pięciu szkiełek z wybarwionymi skrawkami do kasety szkiełek skanera do szkiełek.
Następnie za pomocą interfejsu w konsoli obszaru skanowania. Dla każdego szkiełka wybierz obszar, który ma objąć całą tkankę na szkiełku, niezależnie od wzoru barwienia lub innych obserwowalnych aspektów próbki. Następnie, korzystając z konsoli lunety skanowania, najpierw wybierz region tkanki do oceny idealnie w obszarze guza tkanki, aby zapewnić najlepszą reprezentację.
Teraz, korzystając z funkcji automatycznej ekspozycji konsoli lunety skanującej, określ czas ekspozycji dla każdego kanału wraz z ostrością obrazu, użyj niebieskiego rombu na obrazie konsoli lunety skanowania, aby wybrać dodatkowy obszar z dala od tkanki, ale nadal w obszarze szkiełka pod szkiełkiem nakrywkowym, aby zdefiniować obszar tła, w którym zostaną uzyskane obrazy korekcji płaskiego pola. Dla każdego filtra dodaj punkty ostrości do obszaru tkanki reprezentowanego przez żółte kwadraty, aby zoptymalizować przechwytywanie obrazu. Jeśli obrazy wydają się mieć wysokie tło lub inne artefakty obrazu, obszar obrazu powinien zostać przesunięty i uzyskane nowe obrazy.
Tkanka jest następnie skanowana, a pozyskane obrazy preparatów cyfrowych są następnie automatycznie przesyłane do bazy danych widma Aperio. Kliknij dwukrotnie obraz miniatury programu widma, aby wybrać slajd do analizy z cyfrowej listy slajdów w bazie danych widma. Następnie, korzystając z dołączonego obrazu z adnotacjami h i D, opisz obszar zainteresowania na obrazie fluorescencyjnym.
W jednej próbce można wybrać wiele obszarów zainteresowania wyznaczonych za pomocą indywidualnych okręgów. Obrazy z adnotacjami są automatycznie zapisywane w bazie danych widma. Teraz wybierz Analizuj z paska menu u góry ekranu, gdy pojawi się okno analizy, wybierz jegodo analizy RX aqua z menu rozwijanego.
Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia, naciśnij przycisk analizy, na pasku zadań systemu Windows pojawi się zminimalizowane okno konsoli wyświetlające postęp przesyłania obrazów z bazy danych Spectrum na komputer lokalny. Po przesłaniu danych rozpocznie się analiza aqua w celu wygenerowania wyniku aqua przy użyciu nienadzorowanego algorytmu punktacji aqua opartego na grupowaniu danych pierwszego progu próbki, sygnału obrazu pan, cytokeratyny powyżej sygnału obrazu tła. Umożliwi to wykorzystanie pikseli do zdefiniowania maski nowotworowej, która następnie może być wykorzystana do kolejnych obliczeń.
Użyj pikseli cytokeratyny o wysokiej ekspresji, aby również zdefiniować cytoplazmatyczne lub niejądrowe regiony komórek nowotworowych. Jak widać tutaj, piksele o wysokim sygnale w kanale DPI, które znajdują się w masce nowotworowej, są identyfikowane jako jądrowe o charakterze jądrowym. Jeśli po przeglądzie zostaną zidentyfikowane pola, które nie nadawały się do oceny ze względu na artefakty próbki lub obrazowania, pola te zostaną usunięte z punktacji i również dadzą ostateczny wynik niepowodzenia.
Wyniki punktacji aqua są reprezentowane jako tabela wyników powiązanych z każdym kafelkiem o wymiarach 512 na 512 pikseli w obszarze zainteresowania w całej próbce przekroju tkanki, którą można zapisać i wykorzystać do późniejszej analizy statystycznej. Te mikrofotografie poplamione hemat toiną i eoiną pokazują, jak różne obszary tego samego raka jajnika mogą wykazywać zmienną morfologię. Widok o dużej mocy w prawym górnym rogu ryciny B podkreśla komórki z oczyszczaniem cytoplazmatycznym i solidnym wzorcem wzrostu w górnej części guza.
Dolna część tkanki powiększona w prawej dolnej części rysunku C ma jednak bardziej jednorodną cytoplazmę eozynofilową i brodawkowaty wzór wzrostu. W tym przypadku heterogeniczne mapy cieplne ekspresji ER w wycinku tkankowym raka jajnika przed i po leczeniu chemioterapią są pokazane odpowiednio w górnym i dolnym panelu. Zwróć uwagę na zmianę od zmiennego wyrażenia ER w całej sekcji z obszarami zarówno wysokiego, jak i niskiego wyrażenia na górnym rysunku do równomiernego rozkładu wysokiego wyrażenia ER zilustrowanego na czerwono na dolnym rysunku.
Liczbowa reprezentacja tej zmiany jest oznaczona po lewej stronie spadkiem indeksu Simpsonów. Na tym rysunku mapy cieplne niejednorodności HER dwóch w wycinku tkankowym raka jajnika są ponownie pokazane przed i po terapii, jak widać odpowiednio w górnym i dolnym panelu. Zwróćmy uwagę na zmianę ze zmiennej HER two wyrażenia w przekroju z obszarami zarówno wysokiego, jak i niskiego wyrażenia na górnym rysunku na równomierny rozkład wysokiego wyrażenia HER two na dolnym rysunku.
Po raz kolejny widać, że indeks Simpsonów spada. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że jakość danych generowanych przez analizę obliczeniową jest tylko tak dobra, jak jakość barwienia, a ta musi być na wysokim poziomie technicznym.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę ilościowego oznaczania heterogeniczności molekularnej w histologicznych przekrojach guzów z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji oraz analizy obrazu. Podejście to ma na celu usprawnienie opracowywania klinicznych biomarkerów poprzez dostarczenie statystycznej miary heterogeniczności ekspresji białek.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Onkologia
- Immunologia
Wstęp
- Ilościowe określenie ekspresji biomarkerów jest kluczowe w badaniach nad nowotworami.
- Tradycyjne metody, takie jak immunohistochemia, mają ograniczenia w zakresie czułości i kwantyfikacji.
- Immunofluorescencja oferuje bardziej ilościowe podejście do oceny ekspresji białek.
- Zrozumienie heterogenności guzów może pomóc w opracowaniu strategii leczenia.
Cel badania
- W celu dokładnego ilościowego określenia ekspresji biomarkerów w całych przekrojach tkanek.
- W celu przypisania wartości liczbowych do stopnia heterogeniczności ekspresji białek.
- W celu usprawnienia mapowania ekspresji biomarkerów w heterogenicznych tkankach nowotworowych.
Zastosowane metody
- Skanowanie skrawków tkanek znakowanych immunofluorescencyjnie przy użyciu skanera całych preparatów.
- Wybór obszarów zainteresowania w obrębie guza do oceny.
- Ilościowe oznaczanie ekspresji białek przy użyciu zautomatyzowanego systemu analizy obrazu aqua analysis.
- Generowanie map ciepła heterogeniczności w celu wizualizacji zmian w ekspresji biomarkerów.
Główne wyniki
- Wykazano zdolność do mapowania zmienności ekspresji biomarkerów w tkankach nowotworowych.
- Kazano zmiany w wzorcach ekspresji przed i po zastosowaniu chemioterapii.
- Przeprowadzono ilościową ocenę heterogeniczności z wykorzystaniem wskaźnika Simpsona.
- Podkreślono zalety immunofluorescencji w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Wnioski
- Metoda ta zwiększa zrozumienie heterogeniczności biomarkerów w guzach nowotworowych.
- Oferuje ona bardziej czułe i ilościowe podejście w zastosowaniach klinicznych.
- Technika ta może wspomóc opracowywanie terapii celowanych w oparciu o ekspresję biomarkerów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określanie heterogeniczności przestrzennej ekspresji białek w guzach wypełnia krytyczną lukę w opracowywaniu leków opartych na biomarkerach, gdzie tradycyjne metody masowe (bulk) lub półilościowe maskują zmienność na poziomie subpopulacji, która może wpływać na odpowiedź terapeutyczną i oporność. Dostarczając numeryczny, rozdzielony przestrzennie pomiar rozkładu biomarkerów, metoda ta umożliwia bardziej precyzyjną stratyfikację pacjentów i wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach walidacji celów oraz rozwoju testów analitycznych. Jej zastosowanie w odniesieniu do ER i HER2 w raku jajnika wykazuje bezpośrednią istotność dla przewidywania odpowiedzi na terapię hormonalną i celowaną, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w programach przedklinicznych i wczesnych fazach klinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie heterogeniczności ekspresji biomarkerów jako niezależnej zmiennej w badaniach nad walidacją celu.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu, ujawniając, czy obserwowane poziomy biomarkerów odzwierciedlają jednorodne zaangażowanie celu, czy też są zaburzone przez zmienność wewnątrzguza.
- Wartość prognostyczna: Usprawnia selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację celów o jednorodnych wzorcach ekspresji, które z większym prawdopodobieństwem wykażą spójne odpowiedzi na lek w różnych obszarach guza.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje zwalidowane, rozdzielcze przestrzennie mapy ekspresji białek, które służą jako ilościowe punkty odniesienia do opracowywania i standaryzacji testów opartych na immunofluorescencji.
- Powtarzalność: Wykorzystuje zautomatyzowane kafelkowanie i ocenę AQUA, aby zminimalizować błąd obserwatora i zapewnić spójną kwantyfikację w różnych sekcjach tkanek i seriach eksperymentalnych.
- Skalowalność przesiewania: Dostarcza dane na poziomie kafelków, kompatybilne z przepływami pracy analizy wysokotreściowej (high-content analysis), co umożliwia skalowalną ocenę wpływu związków na rozkład biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy pomiary heterogeniczności z fazy odkrywczej z walidacją przedkliniczną, zapewniając system istotny dla danej choroby do oceny stabilności biomarkerów przed i po interwencji terapeutycznej.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Ilościowo określa zmiany w heterogeniczności ekspresji ER oraz HER2 przed i po chemioterapii, oferując biomarker predykcyjny dla zmian fenotypowych indukowanych terapią.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez identyfikację, czy efekty terapeutyczne są jednolite czy selektywne, co redukuje liczbę niepowodzeń w późnych etapach wynikających z nieprzewidzianych, opornych subklonów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywczych, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, szczególnie w przypadku terapii opartych na biomarkerach, w których przestrzenne wzorce ekspresji wpływają na skuteczność leku oraz mechanizmy oporności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając kwantyfikację heterogeniczności ekspresji białek jako zmiennej w badaniach mechanistycznych biologii nowotworów i szlaków sygnalizacyjnych.
- Screening: Dostarcza gotowych do analizy wyników ilościowych (wyniki AQUA na pole), co ułatwia reprodukowalny screening związków w heterogenicznych modelach nowotworów.
- Analityka: Generuje mapy ciepła heterogeniczności oraz wyniki oparte na indeksie Simpsona, zapewniając wskaźniki statystyczne do porównywania warunków i śledzenia zmian ekspresji w czasie lub w trakcie leczenia.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez wykazanie, w jaki sposób zmienia się ekspresja biomarkerów po leczeniu, co dostarcza informacji dla strategii monitorowania farmakodynamicznego.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy, którą można zastosować w różnych typach nowotworów i dla różnych biomarkerów, co ogranicza redundantne opracowywanie metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną dotyczącą istotności biomarkerów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej wynikającej z niemierzalnej heterogeniczności wewnątrznowotworowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną, odtwarzalną kwantyfikację dzięki zautomatyzowanej analizie obrazu i zwalidowanym protokołom barwienia.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wcześniejszą identyfikację biomarkerów o jednorodnej ekspresji, co ogranicza inwestycje w cele, które mogą okazać się nieskuteczne z powodu heterogenicznej dostępności celu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez wskazanie biomarkerów, w których heterogeniczność koreluje ze złym rokowaniem lub zmienną odpowiedzią na leczenie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w barwieniu immunofluorescencyjnym, skanowaniu całych preparatów oraz analizie obrazów w oparciu o algorytm AQUA.
- Zależność od wysokiej jakości wielobarwnego barwienia immunofluorescencyjnego oraz skanera fluorescencyjnego do całych preparatów z funkcją rozdzielania widm (spectral unmixing).
- Konieczność stosowania zestandaryzowanych protokołów wyboru obszarów zainteresowania (ROI) oraz korekcji tła w celu zapewnienia porównywalności wyników między laboratoriami.
- Adaptacja do alternatywnych systemów modelowych (np. ksenoprzeszczepów, organoidów) wymaga walidacji maskowania nabłonka oraz parametrów segmentacji sygnału.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od swoistości przeciwciał oraz stosunku sygnału do szumu, co może wpływać na dokładność kwantyfikacji w przypadku celów o niskiej liczności.
