Name: Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w nowotworach przy użyciu immunofluorescencji ilościowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj metodę ilościowej immunofluorescencji do mapowania heterogeniczności ekspresji białek w tkankach nowotworowych. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę biomarkerów i wspiera rozwój terapii celowanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została częściowo sfinansowana przez Scottish Funding Council (grant nr HR07005; <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a>), Medical Research Scotland (<a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a>), Cancer Research UK Experimental Cancer Medicine Centre (<a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a>) oraz Breakthrough Breast Cancer (<a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a>).

1. Przygotowanie tkanki
<ol class="lalpha">
 <li>Mikrotomia
 <ol class="lroman">
 <li>Wyciąć przekroje z utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie bloków nowotworowych o grubości 4 μm przy użyciu mikrotomu obrotowego.</li>
 <li>Umieścić przekroje na pozytywnie naładowanych szkiełkach mikroskopowych.</li>
 <li>Inkubować szkiełka w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przechowywanie
 <ol>
 <li>Przechowywać przekroje w zamrażarce w temperaturze od -18 °C do -25 °C, aby zapobiec utracie antygenowości.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Immunofluorescencja przekrojów tkankowych
<ol class="lalpha">
 <li>Odwoskowanie i rehydratacja
 <ol class="lroman">
 <li>Odwoskować preparaty w ksylenie dwukrotnie przez 5 min.</li>
 <li>Rehydratować preparaty kolejno w etanolu 9%, 9%, 80%, 50% oraz w bieżącej wodzie z kranu przez 2 min w każdym kroku.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Odmaskowanie antygenów
 <ol class="lroman">
 <li>Przeprowadzić termiczne odmaskowanie antygenów, używając buforu cytrynian sodu 0.15 mM o pH 6.0 w szybkowarze w kuchence mikrofalowej przez 5 min.</li>
 <li>Schłodzić preparaty przez 20 min.</li>
 <li>Przepłukać preparaty w 0.05% PBST przez 5 min na kołysce.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Procedura blokowania
 <ol class="lroman">
 <li>Traktować skrawki 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 min.</li>
 <li>Przepłukać preparaty w 0.05% PBST przez 5 min na kołysce.</li>
 <li>Umieścić skrawki w statywie do barwienia immunohistochemicznego Sequenza.</li>
 <li>Traktować skrawki bezserowym blokerem białkowym przez 10 min.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi
 <ol class="lroman">
 <li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi do optymalnego stężenia w rozcieńczalniku do przeciwciał Dako przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przepłukać w 0.05% PBST trzy razy po 5 min.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Inkubacja maski nabłonkowej (cytokeratyny)
 <ol class="lroman">
 <li>Inkubować z przeciwciałem mysim anty-pan cytokeratyna, rozcieńczonym 1:50 w rozcieńczalniku do przeciwciał Dako przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wizualizacja maski nabłonkowej
 <ol class="lroman">
 <li>Przygotować rozcieńczenie 1:25 przeciwciała wtórnego koziego anty-mysiego Alexa55 w uprzednio rozcieńczonym roztworze przeciwciała Envision koza-królik HRP. Inkubować preparaty w ciemności przez 1,5 h w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przepłukać w 0.05% PBST trzy razy po 5 min.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wizualizacja celu
 <ol class="lroman">
 <li>Przenieść preparaty z urządzenia Sequenza do komory wilgotnościowej.</li>
 <li>Połączyć rozcieńczalnik do amplifikacji sygnału celu (HistoRx probówka E) i tyramid Cy5 (HistoRx probówka F) w stężeniu 1:50. Wymieszać za pomocą vortexa. Inkubować preparaty w ciemności przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przepłukać w 0.05% PBST trzy razy po 5 min.</li>
 <li>Odwodnić preparaty w 80% etanolu przez 1 min.</li>
 <li>Wysuszyć preparaty na powietrzu w ciemności.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Kontrastowanie i nakładanie szkiełek cover-slip
 <ol class="lroman">
 <li>Nanieść medium montażowe DAPI na szkiełka cover-slip i nałożyć szkiełka na skrawki tkanki.</li>
 <li>Suszyć preparaty przez noc w ciemności.</li>
 <li>Po wyschnięciu preparatów zabezpieczyć je lakierem do paznokci, aby zapewnić długoterminową konserwację, i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. Przechwytywanie obrazów za pomocą skanowania całych skrawków
<ol class="lalpha">
 <li>Włóż do pięciu szkiełek do kasety skanera slajdów Aperio ScanScope FL.</li>
 <li>Dla każdego szkiełka wybierz ogólny obszar do obrazowania za pomocą interfejsu w konsoli ScanScope Console. Wybierz obszar obejmujący całą tkankę na szkiełku, niezależnie od wzoru barwienia lub innych obserwowalnych aspektów próbki.</li>
 <li>Używając konsoli ScanScope Console, określ optymalną ekspozycję dla każdego kanału (DAPI, Cy3 i Cy5) w następujący sposób:
 <ol class="lroman">
 <li>Wybierz obszar tkanki do analizy – obszar ten powinien w idealnym przypadku znajdować się w obrębie tkanki nowotworowej, aby zapewnić najlepszą reprezentację.</li>
 <li>Używając funkcji autoekspozycji w konsoli ScanScope Console, oceń sugerowany czas ekspozycji dla każdego kanału oraz ostrość obrazu.</li>
 <li>Powtórz czynność w 3–5 obszarach każdej próbki, aby potwierdzić stabilność wartości.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wybierz dodatkowy obszar (oznaczony niebieskim rombem na obrazie w konsoli ScanScope), oddalony od tkanki, ale wciąż w obrębie obszaru przykrytego szkiełkiem podstawowym, aby zdefiniować obszar tła, w którym zostaną pozyskane obrazy do korekcji pola płaskiego dla każdego filtra.</li>
 <li>Przejrzyj te obrazy przed właściwym pozyskaniem obrazów. Jeśli obrazy wykazują wysokie tło lub inne artefakty, należy przenieść obszar obrazowania i pozyskać nowe obrazy.</li>
 <li>Pozyskane cyfrowe obrazy szkiełek są automatycznie przesyłane do bazy danych Aperio Spectrum.</li>
</ol>
4. Zautomatyzowana analiza obrazów AQUA
<ol class="lalpha">
 <li>Przeglądaj cyfrowe obrazy całych preparatów w bazie danych Spectrum i zaznaczaj obszary guza budzące zainteresowanie w kontekście całej tkanki i wzorców barwienia.</li>
 <li>Wybierz preparat do analizy za pomocą AQUAnalysis z listy cyfrowych preparatów w bazie danych Spectrum, dwukrotnie klikając miniaturę obrazu (alternatywnie zaznacz pole wyboru obok obrazu, a następnie wybierz „View Images” z menu u góry listy). Spowoduje to automatyczne otwarcie oprogramowania ImageScope oraz obrazu z nałożonymi kolorami próbki tkanki.</li>
 <li>Użyj tego oprogramowania do nawigacji po obrazie, korzystając z dostępnych narzędzi.</li>
 <li>Korzystając z towarzyszącego barwienia H&amp;E (fizycznego preparatu lub opisanego obrazu), zaznacz obszar zainteresowania na obrazie fluorescencyjnym. Na jednej próbce można wybrać wiele obszarów zainteresowania w formie pojedynczych zakreślonych pól. Dostępne jest również narzędzie „negatywne”, służące do wykluczania obszarów w ramach wybranego regionu (np. uszkodzonej tkanki, obszarów o słabej histologii, obszarów pozaguzowych, zanieczyszczeń itp.).</li>
 <li>Zapisz warstwę (warstwy) adnotacji na obrazie.</li>
 <li>Powróć do menu głównego Spectrum i zaznacz pole wyboru obok obrazu, który został przed chwilą opisany. Wybierz „Analyze” z paska menu u góry listy.</li>
 <li>W wyświetlonym oknie analizy wybierz „HistoRx AQUA Analysis” z menu rozwijanego.</li>
 <li>Jeśli istnieje wiele warstw adnotacji, użyj pól wyboru, aby wybrać odpowiednią warstwę (warstwy) do analizy.</li>
 <li>Naciśnij przycisk „Analyze”, gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia.</li>
 <li>W tym momencie na pasku zadań systemu Windows pojawi się zminimalizowane okno konsoli. Będzie ono wyświetlać postęp przesyłania obrazów z bazy danych Spectrum na lokalny komputer PC (operacja „pull”).</li>
 <li>Po przesłaniu danych zostanie uruchomiony program AQUAnalysis. Użytkownik może wówczas korzystać z wszystkich wewnętrznych funkcji oprogramowania w celu przeglądania, nawigacji i analizy obrazów.</li>
 <li>Opisany obszar obrazu z bazy danych Spectrum jest dzielony na kafelki obrazu o rozmiarze 512x512 pikseli – z których każdy zostanie oceniony indywidualnie.</li>
 <li>W tej badaniu zastosowano nienadzorowany algorytm oceny AQUA, oparty na klastrowaniu danych8. W tym algorytmie wyniki AQUA są generowane w następujący sposób:
 <ol class="lroman">
 <li>Sygnał obrazu dla pan-cytokeratyny jest poddawany progowaniu powyżej tła, a piksele te są wykorzystywane do zdefiniowania „maski” guza, która służy do dalszych obliczeń. Piksele pan-cytokeratyny o wysokiej ekspresji definiują również regiony cytoplazmatyczne/pozajądrowe komórek nowotworowych.</li>
 <li>Piksele o wysokim sygnale w kanale DAPI, które znajdują się wewnątrz maski guza, są identyfikowane jako jądrowe.</li>
 <li>Algorytm klastrowania analizuje również piksele o niskiej intensywności barwienia DAPI lub ekspresji cytokeratyny i próbuje częściowo przypisać je do przedziałów jądrowych, cytoplazmatycznych lub do tła.</li>
 <li>Po przypisaniu wszystkich pikseli do jednego z przedziałów guza lub tła, obliczana jest intensywność sygnału z białka docelowego (ER lub HER2) w każdym z przedziałów i normalizowana do wielkości tych przedziałów, co pozwala na uzyskanie wyników AQUA.</li>
 <li>Obrazy, które nie posiadały wystarczającej reprezentacji guza (zdefiniowanej jako mniej niż 5% pikseli reprezentujących guz), nie były oceniane. Regiony te generują również wartość „Final Result” oznaczoną jako „Fail” i mogą zatem zostać usunięte w późniejszych analizach statystycznych.</li>
 <li>Dodatkowo, jeśli podczas przeglądu operator zidentyfikował pola, które nie nadawały się do oceny z powodu artefaktów próbki lub obrazowania (np. pofałdowana tkanka, zanieczyszczenia), pola te zostały wyłączone z oceny i otrzymały wynik „Final Result” określony jako „Fail”.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wynikami oceny AQUA są tabele wyników przypisanych do każdego kafelka o rozmiarze 512x512 pikseli w obszarze zainteresowania w ramach próbki całego przekroju tkanki. Pliki te, w formacie .CSV, mogą być następnie wykorzystane do dalszej analizy statystycznej.</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna: Wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane w programie SPSS (IBM)
<ol>
 <li>W miarę możliwości, w przypadku dużych operacji, należy generować pliki z kodem składni SPSS (.sps) w celu wykonania manipulacji danymi i etapów analizy. Przykładowy kod składni został udostępniony w plikach uzupełniających.</li>
 <li>Wczytaj pliki danych do programu SPSS. Usuń z surowych danych zmienne, które nie są wykorzystywane (np. parametry specyficzne dla urządzenia, wyniki AQUA z nieużytkowanych przedziałów).</li>
 <li>W obszarach, w których „Wynik końcowy” (Final Result) brzmi „Błąd” (Fail) (patrz wyżej), wartości te należy oznaczyć jako SYSMIS, co wykluczy je z analiz numerycznych.</li>
 <li>Zgromadzić wszystkie dane ze wszystkich slajdów dla każdego markera (ER lub HER2) w jednym głównym zbiorze danych w formacie SPSS. Tego pliku głównego należy używać do wszystkich późniejszych obliczeń.</li>
 <li>Przy użyciu pliku składni SPSS (osobnego dla każdego markera: ER lub HER2 (patrz: uzupełniające pliki składni)) dokonano dalszej walidacji danych i obliczono wskaźniki różnorodności Simpsona w następujący sposób:
 <ol class="lroman">
 <li>Należy wygenerować główny plik analityczny, aby zapobiec modyfikacji wcześniej utworzonego głównego zbioru danych.</li>
 <li>Zweryfikuj główny zestaw danych w odniesieniu do wygenerowanych danych surowych i obrazów.</li>
 <li>Oblicz statystyki podsumowujące dla wyników AQUA dla każdej próbki (liczbę pól, średnią, medianę, wartość minimalną, wartość maksymalną oraz odchylenie standardowe wyników dla próbki).</li>
 <li>Należy sprawdzić losową próbkę wyników pod kątem zgodności z oryginalnymi plikami danych wyjściowych oraz z surowymi danymi obrazowymi poddanymi ocenie.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Aby wygenerować obrazy map ciepła (przedstawione na Rysunkach 2 i 3):
 <ol class="lroman">
 <li>Podziel dane dotyczące wyniku AQUA na osiem poszczególnych poziomów (używając funkcji „Visual Binning” w programie SPSS). W przypadku ER wykorzystano wyniki jądrowe, a w przypadku HER2 wyniki cytoplazmatyczne.</li>
 <li>Wyznacz przedziały w taki sposób, aby każdy przedział reprezentował równy procent dostępnych przypadków z całego zbioru danych.</li>
 <li>Użyj funkcji „Split File” w programie SPSS, aby wszystkie kolejne wyniki były prezentowane na poziomie „każdego preparatu/próbki”.</li>
 <li>Nanieś każdy obszar (odpowiadający kafelkowi o wymiarach 512x512) na wykres zgodnie z jego współrzędnymi x,y i pokoloruj go wartością odpowiadającą koszykowi, do którego został przydzielony (patrz ryc. 2 i 3).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>W celu wygenerowania wyników heterogeniczności napisano kod służący do obliczenia wskaźnika różnorodności Simpsona z wykorzystaniem wyników AQUA.
 <ol class="lroman">
 <li>Wskaźnik różnorodności Simpsona, zastosowany w niniejszym opracowaniu, jest definiowany jako: 
 <img alt="wzór na wskaźnik różnorodności Simpsona, równanie równowagi statycznej, koncepcja matematyki edukacyjnej" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"> 
 Gdzie N to całkowita liczba wyników/pól wykorzystanych dla danej próbki, a n to liczba wyników/pól w danej grupie wyników zestandaryzowanych (wyznaczonych zgodnie z poniższym opisem).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>W celu uzyskania źródła danych należy użyć opisanego powyżej głównego pliku analitycznego. W przedstawionych przykładach wszystkie obliczenia ER oparto na jądrowym wyniku AQUA, a obliczenia HER2 na cytoplazmatycznym wyniku AQUA. Przeprowadź poniższe obliczenia dla każdej próbki/preparatu.</li>
 <li>Ponieważ dane fluorescencyjne są podatne na niestabilność wariancji, w wyniku czego wielkość błędu propaguje wraz z intensywnością, należy zastosować normalizację logarytmiczną (podstawą 2) dla wszystkich wyników AQUA.</li>
 <li>Następnie przekształć znormalizowane (poddane transformacji logarytmicznej) dane w wyniki z (wyniki standaryzowane).
 <ol class="lroman">
 <li>Przekształcenie Z-score oblicza się następująco: Z = (wynik AQUA - średnia wszystkich wyników dla próbki)/odchylenie standardowe wyników dla próbki. Pozwala to przełożyć rozkład wyników na rozkład odchyleń względem centralnej wartości zerowego odchylenia.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Podziel te wartości Z-score na sześć grup (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2, &gt;2).</li>
 <li>Oblicz liczbę wartości przypisanych do każdego koszyka i zsumuj je dla każdego koszyka. Wykorzystaj tę wartość, wraz z całkowitą liczbą pól, aby obliczyć wartość dla każdego z sześciu koszyków wykorzystanych do indeksu.</li>
 <li>Zsumuj te wartości i odejmij wynik od jedynki, aby otrzymać wskaźnik różnorodności.</li>
 <li>Wskaźnik różnorodności stanowi miernik rozrzutu wyników wokół średniej dla danej próbki. Zatem wyższe wartości wskaźnika wskazują na szerszy rozrzut wyników lub zwiększoną heterogeniczność ekspresji. I odwrotnie, niższe wartości wskazują na mniejszą zmienność pomiaru ekspresji oraz homogeniczną ekspresję w próbce. Zostało to zilustrowane na rysunkach 2 i 3.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Terapie celowane z wykorzystaniem czynników o stosunkowo niskiej toksyczności, takich jak tamoksyfen i trastuzumab, nie stanowią standardu leczenia pacjentek z rakiem jajnika. Istnieją przekonujące dowody na to, że chemioterapia pierwszej linii oparta na platynach i taksanach jest skuteczniejsza niż inne schematy chemioterapii w leczeniu raka jajnika9-13, a choć 70-80% pacjentek początkowo reaguje na leczenie, większość z nich doświadcza nawrotu i umiera z powodu choroby. Pomiar biomarkerów, które mogłyby przewidzieć odpowiedź na alternatywne terapie, byłby przydatny w doborze zindywidualizowanego leczenia dla każdej pacjentki. Ponieważ chemioterapia wywiera presję selekcyjną na guz, przeżywające komórki nowotworowe mogą posiadać inne charakterystyki i reprezentować subpopulację guza sprzed terapii; ilościowe określenie tej zmiany mogłoby zatem być pomocne. Zastosowaliśmy naszą metodę mapowania heterogeniczności do analizy ekspresji ER i HER2 w próbkach raka jajnika przed i po chemioterapii, aby zmierzyć ilościowe zmiany w ekspresji oraz ocenić związek między ekspresją biomarkerów przed i po terapii. Zarówno ER, jak i HER2 wykazują wyraźną heterogeniczność w obrębie pojedynczych guzów, a w niektórych nowotworach indeks Simpsona zmienia się po terapii z relatywnie wysokiej na niską heterogeniczność, co objawia się spadkiem wartości indeksu Simpsona (patrz Ryc. 2 i 3). Wspiera to teorię, że w odpowiedzi na cytotoksyczną chemioterapię dochodzi do selekcji klonalnej; co ważniejsze, zjawisko to można wykorzystać w terapii celowanej przeciwko pozostałej populacjom komórek, aby lepiej spersonalizować leczenie pacjentek onkologicznych.
<img alt="Histologia tkanki piersi pod mikroskopem; morfologia komórkowa w badaniu patologicznym." src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Mikrofotografie z barwieniem hematoksyliną i eozyną przedstawiające różne obszary tego samego raka jajnika o zmiennej morfologii. (A) Mikrofotografia z powiększeniem x40 pokazuje dwa sąsiadujące obszary guza o różnej morfologii. Widoki przy dużym powiększeniu (x20) ujawniają komórki z przejaśnieniem cytoplazmy i litym wzorcem wzrostu w górnej części guza (B), podczas gdy dolna część tkanki (C) wykazuje bardziej jednorodną, eozynofilną cytoplazmę i brodawkowaty wzorzec wzrostu. Guz ten zostałby jednak sklasyfikowany jako surowiczy podtyp histologiczny brodawkowaty w celu dalszego postępowania terapeutycznego.
<img alt="Analiza receptorów estrogenowych; mapa cieplna wpływu terapii; porównanie danych; ekspresja od wysokiej do niskiej." src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Mapy ciepła heterogeniczności ekspresji białka ER w tkance raka jajnika wykazującej obecność cytokeratyny, przed (panel górny) i po (panel dolny) zastosowaniu terapii.
<img alt="Poziomy ekspresji białka HER2 przedstawione na mapie ciepła przed i po terapii; wykres intensywności z kodowaniem kolorystycznym." src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Mapy ciepła heterogeniczności ekspresji białka HER2 w tkance raka jajnika wykazującej pozytywny wynik w kierunku cytokeratyn, przed (panel górny) i po (panel dolny) terapii.

<ol><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%3A+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li>
<li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li>
<li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%3A+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li>
<li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li>
<li>Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+tumor+heterogeneity+on+clinical+tissue+specimens+with+multiplexed+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots.</a> ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).</li>
<li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).</li>
<li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measurement of biodiversity.</a> Nature. 163, 688-68 (1949).</li>
<li>Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+Quantitative+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Immunohistochem.+Mol.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel+plus+carboplatin+versus+standard+chemotherapy+with+either+single-agent+carboplatin+or+cyclophosphamide%2C+doxorubicin%2C+and+cisplatin+in+women+with+ovarian+cancer%3A+the+ICON3+randomised+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial.</a> Lancet. 360, 505-515 (2002).</li>
<li>McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide+and+cisplatin+compared+with+paclitaxel+and+cisplatin+in+patients+with+stage+III+and+stage+IV+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer.</a> N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).</li>
<li>Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+III+randomized+study+of+cisplatin+versus+paclitaxel+versus+cisplatin+and+paclitaxel+in+patients+with+suboptimal+stage+III+or+IV+ovarian+cancer%3A+a+gynecologic+oncology+group+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study.</a> J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).</li>
<li>Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+intergroup+trial+of+cisplatin-paclitaxel+versus+cisplatin-cyclophosphamide+in+women+with+advanced+epithelial+ovarian+cancer%3A+three-year+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).</li>
<li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+of+the+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li>
<li>Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).</li>
<li>Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portrait+of+tissue+phosphoprotein+stability+in+the+clinical+tissue+procurement+process%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process.</a> Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).</li>
<li>Klymkowsky, M. W., Savagner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition%3A+a+cancer+researcher%27s+conceptual+friend+and+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe.</a> Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).</li>
<li>Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail+and+slug+mediate+radioresistance+and+chemoresistance+by+antagonizing+p53-mediated+apoptosis+and+acquiring+a+stem-like+phenotype+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem.+Cells%22%5BJournal%5D)">Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells.</a> Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).</li>
<li>Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).</li>
<li>Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+changes+in+ER%2C+PR+and+HER2+expression+in+primary+breast+cancer+and+paired+nodal+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases.</a> Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).</li>
<li>Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li>
</ol>

JC, MG, CJ i CS są pracownikami firmy HistoRx, Inc.

Metoda opisana w niniejszym opracowaniu umożliwia ilościowe określenie heterogeniczności molekularnej w standardowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie przekrojach histologicznych materiału nowotworowego. Metoda ta pozwala na przypisanie wartości do stopnia heterogeniczności w przekroju tkankowym, dzięki czemu może ona zostać uwzględniona jako zmienna w opracowaniu i analizie biomarkerów. Choć ogólnie preferowane jest, aby biomarkery tkankowe były homogeniczne pod względem ekspresji, co zmniejsza podatność testu na błędy próbkowania lub obciążenia, w pewnych okolicznościach ilościowe określenie heterogeniczności jako parametru może być przydatne. Na przykład, jak pokazano w przykładowym zestawieniu dla ER i HER2, powszechne biomarkery wykazują znaczną heterogeniczność ekspresji i obecnie nie jest wiadomo, czy stanowi to niezależny czynnik prognostyczny lub predykcyjny w odniesieniu do wyniku klinicznego lub odpowiedzi na terapię. Podobnie, jak zilustrowano, sama terapia może dynamicznie zmieniać składowe populacje komórek, w związku z czym pomiar wzbogacenia celu może być przydatny w podejmowaniu decyzji terapeutycznych.
Technika ta jest jednak ograniczona przez te same czynniki, które ograniczają tradycyjne analizy histopatologiczne lub analizy biomarkerów (np. immunohistochemiczne). Wynik zależy od rodzaju, wielkości i jakości analizowanej tkanki, w związku z czym pojedynczy przekrój tkanki może nie być reprezentatywny dla całego guza. W rzeczywistości indeks Simpsona może być nadmiernie obciążony wielkością tkanki (liczbą zarejestrowanych klatek i zmierzonymi wynikami AQUA). Immunogenność mierzonych epitopów może podlegać niekontrolowanym czynnikom przedanalitycznym, które w sposób artefaktowy zmieniają ich ekspresję w przekroju tkanki (takim jak czas zimnego niedokrwienia, czas utrwalania oraz artefakty brzeżne). Jest to szczególnie problematyczne w przypadku fosfo-epitopów, które są znane z dużej labilności14, 15. Z tego powodu technika ta może być lepiej dostosowana do materiałów z resekcji niż do małych biopsji i powinna być wykonywana na wielu przekrojach, a nie tylko na jednym. Ostatecznie techniki obrazowania 3D mogą stworzyć możliwość dokładniejszego określenia ilościowego tego parametru.
Przedstawiona technika może być również ograniczona przez czynniki biologiczne, takie jak zmienność w ekspresji epitopu maskującego cytokeratynę. Może to być szczególnie istotne w przypadku nowotworów, w tym raka jajnika i piersi, które ulegają przejściu nabłonkowo-mezenchymalnemu (EMT) lub są wzbogacone w komponenty nienabłonkowe bądź komórki macierzyste16, co wykazano niedawno w przypadku raka jajnika leczonego chemioterapią in vitro17 oraz u pacjentek z rakiem piersi w odpowiedzi na terapię18. Ograniczenie to można pokonać, stosując alternatywne przeciwciała maskujące (lub koktajle przeciwciał), takie jak cytokeratyna wraz z wimentyną, której ekspresja wzrasta podczas EMT16. Ponadto, ponieważ inne komponenty tkanki (mikrośrodowisko), takie jak fibroblasty lub komórki śródbłonka naczyniowego, są również coraz częściej celem terapii biologicznych, technikę tę można rozszerzyć w celu oceny tych komponentów, stosując specyficzne maski dla interesujących przedziałów, np. PECAM/ CD31 do barwienia komórek śródbłonka naczyniowego.
Choć w niniejszym protokole ze względu na prostotę zastosowano adaptację indeksu Simpsona jako miarę heterogeniczności, można by użyć innych miar, takich jak proste pomiary tendencji centralnej (średnia, wariancja, mediana itp.). Dodatkowo obliczenia indeksu Simpsona można zmodyfikować, aby lepiej dostosować je do konkretnej populacji badawczej. Zastosowanie transformacji Z-score sprawia, że punktacja jest bardziej odpowiednia dla wielu markerów, ponieważ heterogeniczność opiera się na odchyleniu od średniej dla danego zestawu danych. Jednakże całkowity zakres punktacji może być ograniczony w tego typu transformacji. W niektórych projektach badań bardziej odpowiednie może być proste pogrupowanie (binning) rzeczywistych wyników AQUA dla wszystkich próbek danego zestawu markerów. Wybór liczby przedziałów i wartości progowych stanowi również ograniczenie w zakresie uzyskiwanych wartości i może zostać zoptymalizowany pod kątem alternatywnych projektów eksperymentalnych.
W niniejszym badaniu jako potencjalne biomarkery wykorzystaliśmy ER i HER2, ponieważ są one już stosowane w praktyce klinicznej, pomagają odpowiedzieć na istotne pytania kliniczne dotyczące skuteczności terapii celowanych oraz wiadomo, że wykazują znaczną heterogeniczność i zmienność w chorobie pierwotnej i rozsianej19. Jednakże optymalny marker heterogeniczności pozostaje do ustalenia. Inne możliwości mogą obejmować cytogenetyczne markery klonalności, takie jak te wykorzystywane wcześniej w badaniach FISH w fazie interfazy20. Podejście to wymaga dalszej walidacji w dużych, dobrze opisanych kohortach klinicznych lub w badaniach klinicznych, aby dokładniej określić znaczenie tego parametru w biologii nowotworów.

<table><tbody><tr><td>ScanScope FL</td><td>Aperio Technologies</td><td>ScanScope FL</td><td>Używany w konfiguracji dostarczonej przez producenta</td></tr><tr><td>Spectrum</td><td>Aperio Technologies</td><td>Spectrum</td><td>Konfiguracja i numery katalogowe będą różnić się w zależności od tego, jak lokalne instytucje skonfigurowały swoją bazę danych i strukturę IT.</td></tr><tr><td>AQUAnalysis, w połączeniu z AQUAjustment</td><td>HistoRx</td><td>V2.3</td><td>Pakiet AQUAjustment umożliwia programowi AQUAnalysis korzystanie z obrazów przechowywanych w programie Spectrum.</td></tr><tr><td>HER2</td><td>Dako</td><td>A0485</td><td>rozcieńczenie 1 w 400</td></tr><tr><td>mysi przeciwciała anty-pan cytokeratyna</td><td>Dako</td><td>M3515</td><td>rozcieńczenie 1 w 50</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Envision kozi-króliczy HRP</td><td>Dako</td><td>K4003</td><td></td></tr><tr><td>Blokada białkowa</td><td>Dako</td><td>X0909</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciała anty-mysie Alexa555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Tyramida Cy5</td><td>HistoRx</td><td>AQ-EMR1-00001</td><td></td></tr><tr><td>Sequenza Immunostaining Center</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>73300001</td><td>Użyty tutaj do immunofluorescencyjnego barwienia na blacie laboratoryjnym</td></tr></tbody></table>

mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w guzach z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogeniczność morfologiczna w obrębie pojedynczego guza jest dobrze znana histopatologom w praktyce chirurgicznej. Choć często przybiera ona formę obszarów o wyraźnym różnicowaniu w uznane podtypy histologiczne lub różny stopień złośliwości, często występują bardziej subtelne różnice fenotypowe, które wymykają się dokładnej klasyfikacji (Rycina 1). Ostatecznie, ponieważ morfologia jest determinowana przez podstawowy fenotyp molekularny, obszary z widocznymi różnicami prawdopodobnie wiążą się z różnicami w ekspresji białek sterujących funkcją i zachowaniem komórek, a tym samym ich wyglądem. Znaczenie widocznej i niewidocznej (molekularnej) heterogeniczności dla rokowań pozostaje nieznane, jednak niedawne dowody sugerują, że przynajmniej na poziomie genetycznym heterogeniczność występuje w guzie pierwotnym1,2, a niektóre z tych subklonów dają początek przerzutowej (a zatem śmiertelnej) chorobie.
Ponadto niektóre białka są mierzone jako biomarkery, ponieważ stanowią one cele terapii (na przykład ER i HER2 odpowiednio dla tamoksyfenu i trastuzumabu (Herceptin)). Jeśli białka te wykazują zmienną ekspresję w obrębie guza, odpowiedzi terapeutyczne również mogą być zmienne. Powszechnie stosowane schematy oceny histopatologicznej dla immunohistochemii albo pomijają, albo ujednolicają numerycznie kwantyfikację ekspresji białek. Podobnie w technikach destrukcyjnych, w których próbki guza są homogenizowane (takich jak profilowanie ekspresji genów), można uzyskać informacje ilościowe, ale tracone są informacje przestrzenne. Podejścia do mapowania heterogeniczności genetycznej w raku trzustki opierały się albo na generowaniu zawiesiny pojedynczych komórek3, albo na makrodysekcji4. W niedawnym badaniu wykorzystano kropki kwantowe w celu zmapowania heterogeniczności morfologicznej i molekularnej w tkance raka prostaty5, co stanowiło dowód koncepcji, że mapowanie morfologiczne i molekularne jest wykonalne, jednak nie doprowadziło do kwantyfikacji tej heterogeniczności. Ponieważ immunohistochemia jest w najlepszym razie jedynie półilościowa i obarczona błędem wewnątrz- i międzyobserwatorowym, wymagane są bardziej czułe i ilościowe metodologie, aby dokładnie mapować i kwantyfikować heterogeniczność tkanek in situ.
Opracowaliśmy i zastosowaliśmy eksperymentalną i statystyczną metodologię w celu systematycznego określenia stopnia heterogeniczności ekspresji białek w całych przekrojach tkanek nowotworowych, w oparciu o system Automated QUantitative Analysis (AQUA)6. Przekroje tkanek są znakowane specyficznymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko cytokeratynom oraz interesującym badacza celom, sprzężonym z wtórnymi przeciwciałami znakowanymi fluorochromami. Preparaty są obrazowane przy użyciu skanera fluorescencyjnego do całych slajdów. Obrazy są dzielone na setki lub tysiące kafelków, a każdemu kafelkowi przypisywany jest wynik AQUA, który stanowi miarę stężenia białka w obrębie komponentu nabłonkowego (nowotworowego) tkanki. Generowane są mapy ciepła reprezentujące ekspresję białek w tkance, a następnie przypisywany jest wynik heterogeniczności, przy użyciu statystycznej miary heterogeniczności pierwotnie stosowanej w ekologii, opartej na indeksie różnorodności biologicznej Simpsona7.
Do tej pory nie podejmowano prób systematycznego mapowania i ilościowego określania tej zmienności w powiązaniu z ekspresją białek w preparatach histologicznych. W niniejszej pracy prezentujemy pierwsze zastosowanie tej metody w analizie ekspresji biomarkerów ER oraz HER2 w raku jajnika. Wykorzystanie tej metody otwiera drogę do analizy heterogeniczności jako niezależnej zmiennej w badaniach translacyjnych nad ekspresją biomarkerów, w celu ustalenia znaczenia heterogeniczności w prognozie i przewidywaniu odpowiedzi na terapię.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę ilościowego określania heterogeniczności molekularnej w przekrojach histologicznych materiału nowotworowego z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji, analizy obrazu oraz statystycznego miernika heterogeniczności. Metoda ta jest przeznaczona do zastosowania w opracowywaniu i analizie klinicznych biomarkerów.

Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w guzach z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji

Heterogeniczność morfologiczna w obrębie pojedynczego guza jest dobrze znana histopatologom w praktyce chirurgicznej. Choć często przybiera ona formę...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest dokładne określenie ilościowej ekspresji biomarkerów w całych przekrojach tkanek nowotworowych człowieka, aby przypisać wartość numeryczną stopniowi heterogeniczności ekspresji białek. Osiąga się to poprzez najpierw zeskanowanie immunofluorescencyjnie znakowanych przekrojów tkanki nowotworowej przy użyciu fluorescencyjnego skanera do całych preparatów. Następnie do oceny wybierane są obszary zainteresowania w obrębie guza.Następnie ekspresję badanego białka w obszarach nacieku nowotworowego określa się ilościowo przy użyciu zautomatyzowanego systemu analizy obrazów aqua analysis. Ostatecznie metodę tę można wykorzystać do mapowania ekspresji biomarkerów w tkance nowotworowej, która często wykazuje dużą heterogenność w obrębie przekroju tkankowego. Główną zaletą stosowania tych technik w porównaniu z metodami tradycyjnymi, takimi jak immunohistochemia z wykorzystaniem barwników i odczynników wizualizacji metrycznej, jest fakt, że immunofluorescencja jest bardziej ilościowa i czulsza.Połączenie tych metod analitycznych ze skanowaniem immunofluorescencyjnym całych przekrojów umożliwia precyzyjne mapowanie subtelnych różnic w ekspresji biomarkerów w obrębie tkanek. Procedury te prezentuje po raz pierwszy Mark Gustafson, dyrektor operacyjny laboratorium Histo RX. Po wykonaniu mikrotomii biopsji tkanki nowotworowej oraz barwieniu immunofluorescencyjnym preparatu w celu wykazania ekspresji interesujących biomarkerów, należy umieścić do pięciu szkiełek z zabarwionymi przekrojami w kasecie skanera do preparatów.Następnie, korzystając z interfejsu w konsoli skanera, dla każdego preparatu należy zaznaczyć obszar obejmujący całą tkankę na szkiełku, niezależnie od wzoru barwienia lub innych obserwowalnych cech próbki. Następnie, za pomocą konsoli skanera, należy wybrać obszar tkanki do oceny, najlepiej w obrębie regionu nowotworowego, aby zapewnić jak najpełniejszą reprezentatywność.Używając funkcji automatycznej ekspozycji w konsoli skanera, należy określić czas ekspozycji dla każdego kanału oraz ostrość obrazu; za pomocą niebieskiego rombu na obrazie w konsoli skanera należy wybrać dodatkowy obszar oddalony od tkanki, lecz wciąż znajdujący się w obrębie preparatu pod szkiełkiem podstawowym, aby zdefiniować obszar tła, w którym zostaną pozyskane obrazy do korekcji pola płaskiego. Dla każdego filtra należy dodać punkty ostrości w obszarze tkanki, reprezentowane przez żółte kwadraty, aby zoptymalizować akwizycję obrazu. Jeśli obrazy wykazują wysokie tło lub inne artefakty, należy przenieść obszar obrazowania i ponownie pozyskać obrazy.Następnie tkanka zostaje zeskanowana, a uzyskane cyfrowe obrazy preparatów są automatycznie przesyłane do bazy danych Aperio spectrum. Kliknij dwukrotnie miniaturę obrazu w programie spectrum, aby wybrać z listy cyfrowych preparatów w bazie danych spectrum preparat do analizy. Następnie, korzystając z dołączonego obrazu z adnotacjami h i D, zaznacz obszar zainteresowania na obrazie fluorescencyjnym.Na pojedynczej próbce można zaznaczyć wiele obszarów zainteresowania, wyznaczając je za pomocą poszczególnych okręgów. Adnotowane obrazy są automatycznie zapisywane w bazie danych widm. Teraz wybierz Analyze z paska menu u góry ekranu; gdy pojawi się okno analizy, wybierz histo RX aqua analysis z menu rozwijanego.Po przygotowaniu do rozpoczęcia należy nacisnąć przycisk analizy. Na pasku zadań systemu Windows pojawi się zminimalizowane okno konsoli wyświetlające postęp przesyłania obrazów z bazy danych Spectrum na komputer lokalny. Po przesłaniu danych zostanie uruchomiona analiza aqua w celu wygenerowania wyniku aqua przy użyciu algorytmu punktacji aqua bez nadzoru, opartego na klastrowaniu danych pierwszego progu próbki, czyli sygnału obrazu pancytokeratyny powyżej sygnału obrazu tła. Pozwoli to na wykorzystanie pikseli do zdefiniowania maski guza, która może być następnie użyta do dalszych obliczeń.Wykorzystaj piksele o wysokiej ekspresji pankytokeratyny do zdefiniowania również obszarów cytoplazmatycznych lub pozajądrowych komórek nowotworowych. Jak widać tutaj, piksele z silnym sygnałem w kanale DPI, które znajdują się w obrębie maski nowotworu, są identyfikowane jako jądrowe. Jeśli podczas przeglądu zidentyfikowane zostaną pola nienadające się do oceny z powodu artefaktów próbki lub obrazowania, pola te zostaną wykluczone z oceny, co również spowoduje końcowy wynik negatywny.Wyniki oceny aqua są przedstawione w formie tabeli wyników przypisanych do każdego fragmentu o wymiarach 512 na 512 pikseli w obszarze zainteresowania w obrębie całej próbki przekroju tkanki, którą można zapisać i wykorzystać do późniejszej analizy statystycznej. Te mikrofotografie barwione hematoksyliną i eozyną pokazują, jak różne obszary tego samego raka jajnika mogą wykazywać zmienną morfologię. Powiększenie w prawym górnym rogu rysunku B uwydatnia komórki z przejaśnieniami cytoplazmatycznymi oraz lity wzorzec wzrostu w górnej części guza.Dolna część tkanki powiększona w prawym dolnym fragmencie Rysunku C wykazuje jednak bardziej jednorodną eozynofilną cytoplazmę oraz brodawkowy wzorzec wzrostu. Tutaj, w panelach górnym i dolnym, przedstawiono odpowiednio mapy ciepła heterogeniczności ekspresji ER w przekroju tkanki raka jajnika przed i po leczeniu chemioterapią. Należy zwrócić uwagę na zmianę ze zmiennej ekspresji ER w całym przekroju, z obszarami zarówno wysokiej, jak i niskiej ekspresji na górnej rycini, na równomierny rozkład wysokiej ekspresji ER, zaznaczony kolorem czerwonym na dolnej rycini.Numeryczna reprezentacja tej zmiany jest oznaczona po lewej stronie poprzez spadek indeksu Simpsona. Na tej rycinie ponownie przedstawiono mapy ciepła heterogeniczności HER two w przekroju tkankowym raka jajnika przed i po terapii, odpowiednio w panelu górnym i dolnym. Należy ponownie zwrócić uwagę na zmianę ze zmiennej ekspresji HER two w całym przekroju, z obszarami o wysokiej i niskiej ekspresji na górnej rycinie, do równomiernego rozkładu wysokiej ekspresji HER two na rycinie dolnej.Ponownie zauważalny jest spadek indeksu Simpsona. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że jakość danych generowanych przez analizę obliczeniową zależy bezpośrednio od jakości barwienia, która musi stać na wysokim poziomie technicznym.

heterogeneity-mapping-protein-expression-tumors-using-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opracowanie mapy heterogeniczności ekspresji białek w guzach z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji

Ten film demonstruje technikę wielospektralnej fluorescencji in-situ do analizy różnych subpopulacji infiltrujących limfocytów T w tkance nowotworowej. Kriosekcja tkankowa raka nerkowokomórkowego jest traktowana przeciwciałami znakującymi limfocyty T CD8 +, które wyrażają specyficzne receptory hamujące i wykazują fenotyp oporny na immunoterapię. Oznaczony odcinek jest wizualizowany za pomocą mikroskopu wielospektralnego w celu identyfikacji odrębnych subpopulacji limfocytów T CD8 +.

Multipleksowane obrazowanie immunofluorescencyjne w celu analizy subpopulacji limfocytów T opornych na immunoterapię

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Badanie mikrośrodowiska guza może zidentyfikować prognostyczne lub predykcyjne biomarkery klinicznej odpowiedzi na immunoterapię. Przedstawiona tutaj jest innowacyjna metoda oparta na obrazowaniu wielospektralnym fluorescencji in situ w celu automatycznej analizy i zliczania różnych subpopulacji limfocytów T CD8 +. Ta powtarzalna i niezawodna technika nadaje się do dużych analiz kohortowych.

Multipleksowa analiza immunofluorescencyjna i kwantyfikacja wewnątrznowotworowych limfocytów T PD-1 + Tim-3 + CD8 +

Heterogeniczny rozkład komórek HER2-dodatnich można zaobserwować w podgrupie nowotworów piersi i rodzi dylematy kliniczne. W tym miejscu przedstawiamy niezawodny i opłacalny protokół definiowania, ilościowego określania i porównywania heterogeniczności genetycznej HER2 wewnątrz guza w dużej serii heterogennie przetworzonych nowotworów piersi.

Stworzenie wysokoprzepustowej platformy badań przesiewowych w celu oceny heterogeniczności amplifikacji genu HER2 w raku piersi

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu do walidacji histologii immunofluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu jako sposobu ilościowego oznaczania interesującego białka w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Nasze wyniki wskazują na przydatność histologii immunofluorescencyjnej do ustalania względnej ilości białek biomarkerowych w rutynowych próbkach biopsji.

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak przeprowadzana jest charakterystyka komórek odpornościowych mikrośrodowiska guza za pomocą multipleksowej immunohistochemii.

Multipleksowa analiza immunohistochemiczna przestrzennego krajobrazu komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Poznaj metodę ilościowej immunofluorescencji do mapowania heterogeniczności ekspresji białek w tkankach nowotworowych. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę biomarkerów i wspiera rozwój terapii celowanych.

Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w guzach z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów