Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

W naszym laboratorium badamy ludzkiego raka jelita grubego, jego progresję do choroby przerzutowej oraz odpowiedź na leczenie, w tym immunoterapię. Staramy się znaleźć nowe biomarkery predykcyjne i prognostyczne poprzez badanie mikrośrodowiska immunologicznego guza i mikrobiomu wewnątrznowotworowego w chorobie pierwotnej i przerzutowej. W naszym projekcie wdrażamy obecnie kilka technologii, takich jak sekwencjonowanie RNA, sekwencjonowanie całego eksomu, sekwencjonowanie TCR, analiza krążącego bezkomórkowego DNA, immunofluorescencja i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ.

W tej chwili naszym głównym wyzwaniem jest połączenie barwienia fluorescencyjnego hybrydyzacji in situ z immunofluorescencją multipleksową ze wzmocnieniem sygnału tyramidu w celu zbadania interakcji między mikrobiomem a komórkami odpornościowymi. Nasza metoda jest solidna, powtarzalna, łatwa w użyciu i opłacalna. Można go skonfigurować w dowolnym laboratorium posiadającym fluorescencyjny skaner do slajdów, a ponadto metoda może być stosowana z dowolnym dostępnym na rynku przeciwciałem IHC, w przeciwieństwie do dostępnych na rynku zestawów, które są zwykle zoptymalizowane pod kątem ograniczonego panelu antygenów.

Przed barwieniem immunofluorescencyjnym multipleksowym należy utrwalić tkankę i przeprowadzić deparafinowanie oraz hamowanie endogennej peroksydazy. Następnie, w celu barwienia immunofluorescencyjnego multipleksowego, zanurz szkiełka w 300-mililitrowym słoiku barwiącym zawierającym 10-milimolowy bufor cytrynianu uzupełniony 0,1% Triton X-100. Umieść słoik do barwienia z zamkniętą pokrywką w kuchence mikrofalowej na trzy do pięciu minut z maksymalną mocą, aż bufor zacznie wrzeć.

Po ugotowaniu pozostaw bufor w temperaturze bliskiej wrzenia, ustawiając kuchenkę mikrofalową na małej mocy na 15 minut. Ponownie podgrzej bufor, ustawiając kuchenkę mikrofalową na maksymalną moc na 90 sekund. Wyjmij słoik z kuchenki mikrofalowej i pozwól buforowi ostygnąć przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Opłucz szkiełka trzy razy przez pięć minut w wodzie destylowanej, a następnie przez pięć minut spłukuj i tris-buforowaną solą fizjologiczną zawierającą 0,1% Tween 20 lub TBS Tween. Po ostatnim praniu wyjmij TBS Tween i osusz szkiełka na ręczniku papierowym. Następnie umieść szkiełka na pudełku ze szkiełkami mikroskopowymi i owiń tkankę hydrofobowym pisakiem.

Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania, pokrywając tkankę 5% BSA rozpuszczonym w TBS Tween. Po 30 minutach usuń bufor blokujący, osuszając szkiełka na ręczniku papierowym. Następnie inkubuj tkankę przez 60 minut z 300 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA TBS Tween.

Po inkubacji przepłukać szkiełka trzy razy przez trzy minuty za pomocą TBS Tween. Po umyciu inkubować tkankę przez 40 minut z 300 mikrolitrami przeciwciała wtórnego poli-HRP. Po inkubacji przepłukać szkiełka trzy razy przez trzy minuty za pomocą TBS Tween.

Następnie inkubować tkankę przez 10 minut z 300 mikrolitrami odczynnika tyramidu fluorochromowego rozcieńczonego 200-krotnie w buforze boranowym uzupełnionym doraźnie 0,003% nadtlenkiem wodoru. Następnie trzykrotnie przepłukać szkiełka preparatem TBS Twineen i inkubować tkankę przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z ludzkim przeciwciałem pan-cytokeratynowym rozcieńczonym w 1% BSA TBS Tween. Następnego dnia przepłucz tkankę TBS Tween i inkubuj przez 120 minut z przeciwciałem drugorzędowym bezpośrednio sprzężonym z fluorochromem rozcieńczonym 200-krotnie i 1% BSA TBS Tween.

Po inkubacji przepłukać tkankę TBS Tween, a następnie wybarwić jądra bisbenzimidem rozcieńczonym 1000-krotnie w 10% BSA TBS Tween przez pięć minut. Opłucz chusteczkę trzy razy przez trzy minuty w wodzie destylowanej przed umieszczeniem jej na szkiełku za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego i borokrzemianowego szkła nakrywkowego. W celu analizy obrazu zaimportuj skany do oprogramowania do analizy obrazu.

Następnie przejdź do zakładki Analiza i wybierz algorytm fluorescencji high-plex klikając Ustawienia, Akcje, a następnie Załaduj. Wybierz zakładkę Wybór barwnika i interesujący Cię barwnik. Na karcie Nuclear Detection (Wykrywanie jądrowe) przejdź do pozycji Nuclear Segmentation Type (Typ segmentacji jądrowej) i wybierz opcję AI Custom.

Następnie w klasyfikatorze Segmentacja jądrowa wybierz zapisane wytrenowane AI.In zakładki Wykrywanie błon i cytoplazm, wybierz maksymalny promień cytoplazmy i liczbę barwników błonowych. Dla każdego barwnika wybierz próg dodatni jądra, próg dodatni cytoplazmy i próg dodatni błony. Dla każdego barwnika wybierz procentowy procent błony jądra i cytoplazmy wartości kompletności.

Zapisz algorytm, wybierając pozycję Ustawienia, Akcje i Zapisz. Przeanalizuj obszar zainteresowań, klikając przycisk Analizuj i wybierając opcję Warstwa adnotacji. Następnie przechodzimy do zakładki Wyniki i zaznaczamy wszystkie dane w polu Dane obiektu.

Wyeksportuj dane w formacie CSV, klikając prawym przyciskiem myszy pozycję Eksportuj i wybierając pozycję CSV z danymi obiektowymi. Przedstawiono reprezentatywny wynik optymalnego barwienia metodą immunofluorescencji multipleksowej. Wybór właściwego rozcieńczenia był niezbędny do zweryfikowania swoistości przeciwciał i optymalizacji stosunku sygnału do szumu barwienia.