Name: Mikrokapsułka alginianowa jako platforma 3D do rozmnażania i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) do różnych linii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj mikrokapsułkowanie alginianowe do różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w neurony dopaminergiczne w systemie 3D. Ta metoda zwiększa gęstość komórek i interakcje międzykomórkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest wspierana przez grant programowy NHMRC nr 568969 (PSS) oraz Faculty of Medicine, University of New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).

Wszystkie poniższe procedury są przeprowadzane z zachowaniem zasad aseptyki w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Wykorzystane odczynniki i sprzęt wymieniono w poniższych tabelach.
1. Przygotowanie 1,1% alginianu (m/v)
<ol>
	<li>Do sterylnej probówki o pojemności 50 ml wsypać 0,275 g oczyszczonego alginianu sodu (wysoka zawartość kwasu glukuronowego ≥60%, lepkość &gt;200 mPa s oraz zawartość endotoksyn ≤100 EU/g), a następnie dodać 25 ml wcześniej przygotowanego sterylnego 0,1% roztworu żelatyny (0,5 g żelatyny/500 ml wody milli-Q H2O, rozpuszczonej w autoklawie).</li>
	<li>Probówkę mieszać na wortexie przez około 30 sekund do częściowego rozpuszczenia proszku alginianowego, a następnie umieścić ją na mieszadle orbitalnym przy 10 x g na noc (w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Do 25 ml roztworu alginianu dodać 2,778 ml 9% sterylnego NaCl (4,5 g NaCl/50 ml wody milli-Q H2O). Probówkę mieszać na wortexie przez około 30 sekund, a następnie wirować przy 95 x g przez 5 min.</li>
	<li>Roztwór alginianu przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku przechowywania krótkoterminowego (1-2 miesiące) lub w temperaturze -20 °C w przypadku przechowywania długoterminowego (około roku).</li>
</ol>
2. Przygotowanie kąpieli wytrącania CaCl2
<ol>
	<li>Rozpuścić 14,7 g CaCl2.2H2O oraz 2,38 g HEPES w 1 litrze wody milli-Q H2O.</li>
	<li>Dostosować pH do wartości 7,4.</li>
	<li>Sterylizować roztwór, używając filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Kąpiel do precypitacji można przechowywać w temperaturze pokojowej (6–12 miesięcy).</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworu do usuwania otoczki
<ol>
	<li>Do 500 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (D-PBS) dodać 50 ml 0.5M EDTA oraz 5 ml 1M HEPES.</li>
	<li>Sterylizować za pomocą filtra 0.22 μm lub w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.</li>
	<li>Roztwór do usuwania kapsydy przechowywać w temperaturze pokojowej (od 6 do 12 miesięcy).</li>
</ol>
4. Przygotowanie pożywki z zamiennikiem surowicy (SR)
<ol>
	<li>Przed enkapsulacją należy wcześniej przygotować medium SR zgodnie z opisem w Tabeli specyficznych odczynników i sprzętu.</li>
</ol>
5. Przygotowanie inhibitora ROCK (Y-27632)
<ol>
	<li>Rozpuścić proszek Y-27632 w 0,1% albuminie ludzkiej (HSA) w D-PBS, aby przygotować roztwór o stężeniu 5 mM.</li>
</ol>
6. Przygotowanie hESC do enkapsulacji
<ol>
	<li>Poddać komórki wstępnej inkubacji w pożywce hodowlanej uzupełnionej o 10 μM inhibitora ROCK (RI) przez dwie godziny w temperaturze 37 °C (chroniąc przed światłem).</li>
	<li>Po traktowaniu RI przemyć komórki dwukrotnie roztworem D-PBS i odłączyć komórki od płytek hodowlanych enzymatycznie za pomocą accutase przez 10 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie zebrać komórki za pomocą pipety lub skrobaka do komórek i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Zneutralizować accutase pożywką SR w stosunku 1:1.</li>
	<li>W celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek przefiltrować zneutralizowane komórki przez filtr 40 μm i zebrać do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Obliczyć całkowitą liczbę komórek w roztworze przy użyciu hemocytometru.</li>
	<li>Wirować zawiesinę komórkową z prędkością 95 x g przez 5 min, a następnie ostrożnie usunąć nadsącz. Przemyć komórki uprzednio ogrzanym 0,9% NaCl. Wirować z prędkością 95 x g przez 5 min i usunąć nadsącz.</li>
</ol>
7. Enkapsulacja komórek
<ol>
	<li>Przygotuj strzykawkę o pojemności 1 ml z podłączonym miękkim plastikowym drenem kaniuli dożylnej (I.V.) o rozmiarze 14G x 2". Służy ona do aspiracji zawiesiny komórkowej, która zostanie załadowana do pompy strzykawkowej, jak pokazano na Rysunku 1.</li>
	<li>Resuspenduj komórki w uprzednio ogrzanym roztworze alginianu, aby uzyskać gęstość 1,25 miliona komórek/ml alginianu. Delikatnie wymieszaj zawartość strzykawki, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Ustaw generator kulek, pompę strzykawkową i przepływomierz powietrza zgodnie z Rysunkiem 1. Więcej szczegółów dotyczących tych urządzeń znajduje się w Tabeli specyficznych odczynników i sprzętu.</li>
	<li>Po aspiracji komórek do strzykawki usuń plastikowy dren kaniuli dożylnej i podłącz strzykawkę do urządzenia do enkapsulacji. Upewnij się, że między końcem urządzenia do enkapsulacji a punktem zbierania zachowana jest przerwa 10 cm, jak pokazano na Rysunku 1.</li>
	<li>Przeprowadź enkapsulację komórek, ustawiając pompę strzykawkową na 20 ml/hr, przepływ powietrza na 8 L/min oraz ciśnienie na 100 kPa (rozmiar kapsułek można zmienić poprzez modyfikację szybkości przepływu powietrza).</li>
	<li>Zbierz enkapsulowane komórki do szalki Petriego (100 x 15 mm) wypełnionej 20 ml uprzednio ogrzanej kąpieli wytrącającej na 7 min w celu stabilizacji kapsułek.</li>
	<li>Przenieś enkapsulowane komórki poprzez delikatną aspirację do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml wypełnionych 20 ml 0,9% NaCl.</li>
	<li>Pozostaw kapsułki do momentu opadnięcia na dno probówki, a następnie delikatnie usuń nadsącz. Powtórz proces płukania przy użyciu 0,9% NaCl.</li>
	<li>Resuspenduj enkapsulowane komórki w uprzednio ogrzanym medium hodowlanym uzupełnionym o RI (10 μM), przenieś je do kolby hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 °C/5% CO2.</li>
</ol>
8. Różnicowanie enkapsulowanych hESC w neurony DA
Enkapsułowane hESC są traktowane RI przez 3 dni przed różnicowaniem.
<ol>
	<li>Wysiać linię komórek zrębowych myszy, komórki PA6, w gęstości 1.0 x 104 na cm2 do kolby T75 powleczonej 0,1% żelatyną i przygotować komórki PA6 w medium do różnicowania neuronalnego DA (tabela materiałów) na 24 godziny przed różnicowaniem.</li>
	<li>Przenieść kapsułki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i pozwolić im osiąść na dnie probówki.</li>
	<li>Odpiłować nadsącz i resuspendować kapsułki w medium do różnicowania neuronalnego DA warunkowanym przez komórki PA6.</li>
	<li>Kulturować enkapsulowane hESC z monowarstwą komórek PA6 ( 9 x 106 hESCs na 7.5 x 105 komórek PA6 ) przez 28 dni, wymieniając medium w dniu 4. oraz co drugi dzień w dalszym ciągu (za każdym razem wymieniać tylko połowę medium).</li>
	<li>Po 3 tygodniach hodowli z komórkami PA6, uzupełnić medium do różnicowania neuronalnego DA o 100 ng/ml SHH oraz 100 ng/ml FGF8a w ostatnim tygodniu.</li>
</ol>
9. Dekapsulacja enkapsulowanych hESC
<ol>
	<li>Przenieś kapsułki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozwól im opaść na dno probówki. Następnie ostrożnie odlej nadsącz.</li>
	<li>Przemyj kapsułki dwukrotnie roztworem D-PBS. Pozostaw kapsułki do opadnięcia na dno probówki, a następnie usuń nadsącz.</li>
	<li>Dodaj do kapsułek 5 ml roztworu do dekapsulacji. Przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 4-5 min dokładnie wymieszaj zawiesinę poprzez aspirację.</li>
	<li>Odwiruj dekapsulowane komórki przy 95 x g przez 3 min i usuń nadsącz.</li>
	<li>Przemyj osad komórkowy roztworem D-PBS, a następnie wiruj przy 95 x g przez 3 min. Powtórz czynność.</li>
	<li>Dekapsulowane komórki można następnie hodować jako monowarstwę lub wykorzystać do dalszych analiz.</li>
</ol>
10. Reprezentatywne wyniki
Średnica mikrokapsułek alginianowych wynosi 400-500 μm. Liczbę komórek wewnątrz kapsułki oszacowano, obliczając całkowitą liczbę komórek podzieloną przez całkowitą liczbę kapsułek w jednym cyklu. W związku z tym oszacowano, że na jedną kapsułkę przypada około 5,0 x 104 komórek. Na tej podstawie zakładamy, że maksymalna liczba komórek, jaką może pomieścić kapsułka, wynosi około 1,0 x 105. Żywotność enkapsulowanych hESC wynosi &gt;80% (Rysunek 2), co określono za pomocą testu z użyciem estru bursztynianowego diacetatu karboksyfluoresceiny (CFDA) i jodku propidyny (PI). Zoptymalizowaliśmy warunki enkapsulacji hESC poprzez zmniejszenie stężenia alginianu z 2,2% do 1,1% oraz zmianę kąpieli wytrącającej z chlorku baru na chlorek wapnia. W tych warunkach wykazaliśmy, że przeżyć, proliferować i tworzyć ciała inkluzyjne (EB) in vitro1 mogły jedynie komórki enkapsulowane w 1,1% alginianie wapnia. Aby dalej zoptymalizować te warunki, zbadano wpływ pożywek hodowlanych oraz RI i Y-27632. Dane przedstawione na Rysunku 2 i 3 wykazują, że RI zapobiegał apoptozie indukowanej przez dysocjację, utrzymywał żywotność komórek i promował tworzenie skupisk1,6. Co więcej, żywotność enkapsulowanych hESC hodowanych w hFF-CM + RI była znacznie wyższa niż w pozostałych grupach bez suplementacji RI; nie różniła się ona jednak znacząco od żywotności enkapsulowanych hESC hodowanych w SR + RI. Podobnie proliferacja komórek w teście BrdU wzrosła z 25% do 75% w miarę rozwoju pojedynczych komórek w skupiska (Rysunek 3). Test apoptozy metodą TUNEL wykazał, że pojedyncze komórki w mikrokapsułkach hodowane w medium SR ulegały apoptozie (dane nie przedstawiono), podczas gdy odzyskane skupiska z hFF-CM były w większości negatywne w teście TUNEL. W pewnym stopniu hFF-CM suplementowany bFGF również promował przeżycie i proliferację enkapsulowanych hESC w obecności Y-27632. Jednakże traktowanie Y-27632 przed (2 godziny) i po enkapsulacji (przez dodatkowe 4 dni) wyraźnie zwiększyło żywotność, proliferację i tworzenie skupisk enkapsulowanych hESC w mikrokapsułkach z 1,1% alginianu wapnia.
Wcześniej wykazaliśmy, że enkapsulowane hESC mogą zostać pomyślnie zróżnicowane do definitywnej endodermy1. W niniejszej pracy zbadaliśmy zastosowanie enkapsulacji komórek jako platformy 3D do różnicowania enkapsulowanych hESC w neurony DA. Komórki hESC, które utworzyły ciała embrionalne (EB) w kapsułkach, poddano bezpośredniemu różnicowaniu; po dekapsulacji, w opisanych warunkach, wykazały one progresywną morfologię neuronalną (Rysunek 4) po 2-3 dniach hodowli, przy zachowaniu ponad 90% żywotności. Analiza ekspresji genów wykazała obniżenie poziomu markeru pluripotencji OCT4, podczas gdy marker neuroprogenitorowy PAX6 oraz marker neuronów DA, TH, uległy zwiększeniu po 7 dniach różnicowania (Rysunek 5A). Barwienie immunofluorescencyjne ujawniło, że zróżnicowane hESC były PAX6-dodatnie (&gt;80%), ale OCT4-ujemne w 7. dniu. Dalsze różnicowanie hESC doprowadziło do powstania neuronów TH-dodatnich (&gt;90%) po 21 dniach (Rysunek 5B). Analiza Western blot wykazała również wzrost ekspresji TH od 14. dnia (Rysunek 5C), podczas gdy ekspresja PAX6 spadła po 21. dniu. W porównaniu z nimi, komórki hodowane w środowisku dwuwymiarowym (2D) w podobnych warunkach (np. wstępna obróbka RI przez 2 godziny i obróbka RI po 3 dniach przed różnicowaniem) utrzymywały wysoki odsetek komórek PAX6-dodatnich (&gt;80%) przez cały okres różnicowania i nie różnicowały się w komórki TH-dodatnie (&lt;60%) tak efektywnie, jak w środowisku 3D zapewnionym przez enkapsulację (Rysunek 5A i C).

<ol><li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li>
<li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li>
<li>Cell encapsulation: promise and progress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. Orive, G. 9, 104-107 (2003).</li>
<li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li>
<li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li>
<li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li>
<li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li>
<li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Wiele badań z wykorzystaniem mysich embrionalnych komórek macierzystych oraz hESC wykazało korzyści płynące z zastosowania systemów hodowli 3D w biomateriałach i inżynierii tkankowej2,3. Wykorzystaliśmy mikrokapsułki alginianu wapnia jako odpowiednią platformę 3D do badania propagacji i różnicowania hESC w porównaniu z alginianem baru, ponieważ hESC wykazały znacznie wyższą żywotność po enkapsulacji w alginianie wapnia niż w alginianie baru. Ten system hodowli umożliwia również hodowlę komórek o wysokiej gęsto...

<table><tbody><tr><td>Alginian (Pronova UP MVG) </td><td>NovaMatrix</td><td>4200101</td><td>wysoka zawartość kwasu glukuronowego &amp;#8805;60%, lepkość &amp;gt;200 mPa s oraz endotoksyny &lt;u&gt;&amp;lt;&lt;/u&gt;100 EU/g</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>AHF7123</td><td></td></tr><tr><td>Generator kulek typu J1 </td><td>Nisco engineering Inc</td><td>SPA-0447</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa Multi-Phaser</td><td>New Era</td><td>Model NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Przepływomierz medyczny Ezi-Flow</td><td>Gascon Systems</td><td>G0149</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4327-1G</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula dożylna 14G x 2&amp;#8221;</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SR-OX1451C</td><td></td></tr><tr><td>Knockout-DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>Do pożywki SR (podstawowa)</td></tr><tr><td>GlutaMAX -I </td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Do pożywki SR (2 mM)</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement </td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Do pożywki SR (20%)</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>Do pożywki SR (2.5 U/ml)</td></tr><tr><td>Insulina-transferyna-selen (ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>41400045</td><td>Do pożywki SR (1x)</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>Do pożywki SR (0.1 mM)</td></tr><tr><td>Roztwór MEM NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>Do pożywki SR (5 mM)</td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11710035</td><td>Do pożywki do różnicowania neuronalnego DA (podstawowa)</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement </td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Do pożywki do różnicowania neuronalnego DA (10%)</td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td>Do pożywki do różnicowania neuronalnego DA (1 mM)</td></tr><tr><td>Roztwór MEM NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>Do pożywki do różnicowania neuronalnego DA (0.1 mM)</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>Do pożywki do różnicowania neuronalnego DA (0.1 mM)</td></tr><tr><td>Sonic hedgehog (SHH)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1314-SH-025/CF</td><td>Do różnicowania neuronalnego DA (100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów 8a (FGF8a) </td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>4745-F8-050</td><td>Do różnicowania neuronalnego DA (100 ng/ml)</td></tr></tbody></table>

mikrokapsułka alginianowa jako trójwymiarowa platforma do propagacji i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hesc) w różne linie komórkowe

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) stają się atrakcyjnym alternatywnym źródłem dla terapii zastępczej komórek, ponieważ mogą być namnażane w hodowli w nieskończoność i różnicowane w dowolne typy komórek w organizmie. W hodowlach komórek macierzystych stosowano również różne rodzaje biomateriałów w celu zapewnienia mikrośrodowiska naśladującego niszę komórek macierzystych1-3. Jest to istotne dla promowania interakcji międzykomórkowych, proliferacji komórek i różnicowania w określone linie, a także organizacji tkanki poprzez zapewnienie trójwymiarowego (3D) środowiska4, takiego jak enkapsulacja. Zasada enkapsulacji komórek polega na uwięzieniu żywych komórek w obrębie półprzepuszczalnych membran w hodowlach 3D2. Membrany te umożliwiają wymianę składników odżywczych, tlenu i bodźców, podczas gdy przeciwciała i komórki odpornościowe gospodarza, które są większe niż pory kapsuły, zostają wykluczone5. W niniejszej pracy przedstawiamy podejście do hodowli i różnicowania hESC w neurony dopaminergiczne (DA) w mikrośrodowisku 3D przy użyciu mikrokapsułek alginianowych. Zmodyfikowaliśmy warunki hodowli2, aby zwiększyć żywotność enkapsulowanych hESC. Wykazaliśmy wcześniej, że dodatek inhibitora kinazy p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK), Y-27632 oraz pożywki zastępczej z serum kondycjonowanym przez ludzkie fetalne fibroblasty (hFF-CM) do platformy 3D znacząco zwiększył żywotność enkapsulowanych hESC, w których komórki wykazywały ekspresję genów markerów ostatecznej endodermy1. Wykorzystaliśmy obecnie tę platformę 3D do propagacji hESC i efektywnego różnicowania w neurony DA. Analizy ekspresji białek i genów po końcowym etapie różnicowania neuronów DA wykazały wzrost ekspresji hydroksylazy tyrozynowej (TH), markera neuronów DA, ponad &gt;100-krotny po 2 tygodniach. Postawiliśmy hipotezę, że nasza platforma 3D wykorzystująca mikrokapsułki alginianowe może być użyteczna do badania proliferacji i ukierunkowanego różnicowania hESC w różne linie. Ten system 3D pozwala również na oddzielenie komórek karmiacych od hESC podczas procesu różnicowania, a także posiada potencjał do izolacji immunologicznej podczas przyszłych transplantacji.

Zoptymalizowaliśmy technikę mikroenkapsulacji jako efektywną platformę 3D do propagacji i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w endodermę oraz neurony dopaminergiczne (DA). Zapewnia ona również możliwość immunoisolacji komórek od gospodarza podczas transplantacji. Platforma ta może zostać dostosowana do innych typów komórek.

Mikrokapsułka alginianowa jako trójwymiarowa platforma do propagacji i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w różne linie komórkowe

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) stają się atrakcyjnym alternatywnym źródłem dla terapii komórkowej, ponieważ mogą być namnażane w hodowli ...

Niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem enkapsulacji pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich różnicowania w neurony dopaminergiczne w systemie 3D. Najpierw należy potraktować kolonie inhibitorem ROCK (RI), a następnie rozbić je do pojedynczych komórek, zmieszać z alginianem sodu i przepuścić przez urządzenie do enkapsulacji. Kontynuować podawanie RI przez trzy dni, a następnie przenieść zenkapsulowane komórki na podłoże PA6 i różnicować przez 28 dni.Ostatecznie analiza ekspresji genów i białek wykazała wyższą wydajność generowania neuronów dopaminergicznych. Główną zaletą tej konkretnej techniki w porównaniu z istniejącym protokołem różnicowania 2D jest to, że staramy się namnażać i różnicować te komórki w środowisku 3D, a środowisko 3D stwarza możliwość namnażania komórek przy zachowaniu wysokiej gęstości. Zapewnia to również szansę na lepsze oddziaływania międzykomórkowe sprzyjające różnicowaniu.Po trzecie, zapewnia to również lepszą wydajność różnicowania w dalszych etapach. Pragnę także dodać, że tę konkretną technikę można zaadaptować do innych typów komórek, które możemy namnażać w środowisku 3D. Należy również pamiętać, że na przykład ta konkretna technika została zoptymalizowana pod kątem zastosowania określonego inhibitora ROCK, który zapobiega apoptozie komórek, a także zapobiega ich odrywaniu się od naczyń hodowlanych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają na początku trudności, ponieważ technika ta nie jest typowo stosowana w hodowlach tkankowych. Poniższa technika enkapsulacji została zoptymalizowana na podstawie badań podsumowujących przeprowadzonych przez Dr.Dean Dr.Chad w zakresie zastosowania alginianu typu inhibitor R, stężenia alginianu oraz ustawień urządzenia do enkapsulacji. Jamie oraz Kim, doktorantka z naszego laboratorium, zaprezentują teraz ten protokół.Do 275 mg oczyszczonego alginianu sodu w sterylnej probówce o pojemności 50 ml dodać 25 ml sterylnego 0,1% roztworu żelatyny, a następnie wymieszać w wstrząsaczu wirówkowym (vortex), aby częściowo rozpuścić proszek alginianu. Następnie umieścić probówkę na mieszadle orbitalnym przy 10 ×g przez noc. W kolejnym kroku do roztworu alginianu dodać 9% sterylny chlorek sodu.Mieszać w vortexie przez 30 sekund, a następnie wirować z przyspieszeniem 95 ×g przez pięć minut. Roztwór alginianu przechowywać w temperaturze 4 °C. W ciemności przeprowadzić wstępną inkubację ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w pożywce hodowlanej uzupełnionej o 10 µM inhibitora ROCK.Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Następnie przemyć komórki dwukrotnie DPBS, aby usunąć je enzymatycznie. Dodać accutane i inkubować przez 10 minut.W temperaturze 37 °C ostrożnie zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml. Zneutralizuj Accutane równą objętością medium SL. Następnie przepuść zneutralizowane komórki przez filtr 40 µm do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.Następnie należy użyć hemocytometru do zliczenia komórek. Komórki należy osadzić przez wirowanie, a nadsącz ostrożnie odlać. Następnie komórki należy raz przemyć podgrzanym roztworem.0,9% chlorek sodu. Odwiruj osad i odrzuć nadosad. Aby enkapsulować ludzkie embrionalne komórki macierzyste, rozpocznij od resuspensji komórek w podgrzanym roztworze alginianu.Aby to zrobić, należy podłączyć strzykawkę o pojemności 20 ml do miękkiego plastikowego wężyka i zassać do niej alginian. Następnie delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą strzykawki, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Teraz należy zassać komórki do strzykawki.Wyrzuć plastikowy przewód, a następnie podłącz strzykawkę do urządzenia do enkapsulacji. Przejdź do konfiguracji instrumentów: generatora kuleczek, pompy strzykawkowej, przepływomierza powietrza oraz kąpieli wytrącającej z chlorkiem wapnia. Upewnij się, że między końcem urządzenia do enkapsulacji a punktem zbierania w szalce Petri znajduje się odstęp 10 centimeter.Następnie ustaw pompę strzykawkową na 10 milliliters per hour. Przepływ powietrza ustaw na eight liters per minute, a ciśnienie na 100 kilo pascals. Zbieraj enkapsulowane komórki do wstępnie podgrzanej kąpieli wytrącania przez siedem minut.Następnie przenieś je delikatnie poprzez aspirację do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0.9% Sodium chloride. Pozostaw kapsułki do momentu, aż osiądą na dnie probówki, ostrożnie odlej nadsącz, a następnie przemyj raz 0.9% Sodium chloride. Przejdź do resuspensji inkapsulowanych komórek w uprzednio ogrzanym medium hodowlanym z dodatkiem inhibitora ROCK. Przenieś zawiesinę do kolby hodowlanej i inkubuj przez trzy dni.Wysiej linię komórek zrębowych myszy PA six w kolbie T 75 powleczonej 0,1% żelatyną i inkubuj w medium do różnicowania neuronów dopaminergicznych warunkowanym przez komórki PA six przez 24 godziny. Przenieś kapsułki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i pozwól im opaść na dno probówki. Odlej nadsącz i resuspenduj kapsułki w medium do różnicowania neuronów dopaminergicznych warunkowanym przez komórki PA six.Kultura w pożywce. Enkapsułowane ludzkie embrionalne komórki macierzyste wraz z monowarstwą komórek PA six przez 21 dni. Wymiana pożywki podczas jej uzupełniania.Za każdym razem wymieniaj tylko połowę pożywki, aby kontynuować hodowlę sześciu komórek PA w procesie różnicowania w kierunku neuronów dopaminergicznych. Pożywkę uzupełnia się czynnikami indukującymi przez jeden tydzień. Najpierw odessaj kapsułki i przenieś je do probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów.Gdy kapsułki osiądą na dnie, odlej nadsącz. Przemyj dwukrotnie DPBS, odlewając nadsącz. Następnie dodaj pięć mililitrów roztworu dekapsulującego i dokładnie wymieszaj zawiesinę.Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu osadu, zdekapulować komórki i przepłukać dwukrotnie DPBS, a następnie wykorzystać zdekapulowane komórki w hodowli monowarstwy lub do natychmiastowej analizy w dalszych etapach. W typowym przygotowaniu średnica mikrokapsułek alginianowych wynosi od 400 do 500 mikronów.Tutaj zastosowano test C-F-D-A-P-I. Wyniki określają liczbę żywych zielonych komórek enkapsulowanych przy 80% analizach żywotności, proliferacji i apoptozy enkapsulowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w różnych punktach czasowych, co służy optymalizacji warunków hodowli. Co ciekawe, efekty inhibitora ROCK zapobiegają apoptozie indukowanej dysocjacją i utrzymują żywotność komórek, wskazując na lepszy wzrost enkapsulowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych hodowanych w H-F-F-C-M z dodatkiem ri.Niniejszy przykład wykorzystuje enkapsulację komórek jako platformę 3D do różnicowania enkapsulowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w neurony dopaminergiczne. Zgodnie z oczekiwaniami, rozmiar ciał embrionalnych zwiększa się wraz z czasem; po dekapsulacji komórki wykazują postępującą morfologię neuronalną po dwóch do trzech dniach hodowli, przy żywotności przekraczającej 90%. Analiza ekspresji genów wskazuje na obniżenie poziomu ekspresji markera pluripotencji OCT four.Co istotne, marker progenitorów neuronalnych PAX6 oraz marker neuronów dopaminergicznych TH pozostają podwyższone po siedmiu dniach różnicowania. Dalsze różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych wskazuje na obecność ponad 90% neuronów TH-dodatnich po 21 dniach. Analiza Western blot potwierdza korzystne wzorce ekspresji TH i PAX6 w systemach hodowli komórkowej 3D w porównaniu z 2D.Po opanowaniu, technikę tę można efektywnie przeprowadzić w ciągu dwóch godzin. Należy pamiętać o traktowaniu komórek inhibitorem ROCK przed i po enkapsulacji. Induktory lub inhibitory wariantów mogą pozwolić na dostosowanie protokołu różnicowania 3D do przyszłych eksperymentów.Ta konkretna technika enkapsulacji ludzkich ESL i ich różnicowania w środowisku 3D służy do badania potencjału w terapii komórkowej wielu chorób, w szczególności choroby Parkinsona.

alginate-microcapsule-as-3d-platform-for-propagation-differentiation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikrokapsułki alginianowe jako platforma 3D do propagacji i różnicowania ludzkich komórek macierzystych zarodkowych (hESC) do różnych linii

Ten film pokazuje rozwój i różnicowanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych w trójwymiarowym rusztowaniu. Powłoka lamininowa na rusztowaniu sprzyja przyczepianiu się komórek, podczas gdy pożywka nerwowa wolna od czynnika wzrostu indukuje różnicowanie komórek w neuronalne komórki progenitorowe, które rozszerzają swoje procesy w porowatej architekturze w wielu kierunkach, tworząc trójwymiarową...

Różnicowanie ludzkich neuronalnych komórek macierzystych w kulturę 3D za pomocą porowatego rusztowania

W tym filmie pokazany jest krok po kroku protokół przekształcania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w organoidy nerwowe. Metoda polega na indukowaniu tworzenia rozety neuronalnej, a następnie kontrolowanej dojrzałości i końcowej hodowli na błonie hydrofobowej w celu uzyskania w pełni rozwiniętych organoidów nerwowych.

Różnicowanie i dojrzewanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do organoidów nerwowych

Szczegóły protokołu są dostępne dla in vitro znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą nanocząsteczek generujących drugą harmoniczną. Przedstawiono również metodyki badania hESC za pomocą mikroskopii wielofotonowej i ich różnicowania w klastry sercowe.

Nanocząstki harmoniczne w badaniach regeneracyjnych

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Ustaliliśmy metodę kapsułkowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek PS) w kapsułkach hydrożelowych alginianowych za pomocą dyszy współosiowej.  Zapobiega to nadmiernej agregacji komórek i ogranicza naprężenia ścinające doświadczane przez komórki w hodowli zawiesinowej.  Technika ta ma zastosowanie do masowej produkcji komórek PS, a także do badań nad niszą komórek macierzystych.

Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Ten protokół opisuje podejście do produkcji hepatosfer z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu hodowli i samoorganizacji komórek. Protokół ten jest powtarzalny w wielu liniach komórkowych, jest opłacalny i pozwala na produkcję stabilnych ludzkich hepatosfer do zastosowań biomedycznych.

Produkcja trójwymiarowych ludzkich hepatosfer bez surowicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów (HLC) poprzez ciągłe uzupełnianie Activiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC do ostatecznej endodermy (DE).

Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje enkapsulację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) za pomocą urządzenia do ogniskowania przepływu współosiowego. Wykazaliśmy, że ta technologia enkapsulacji mikroprzepływowej umożliwia efektywne tworzenie sferoid hPSC.

Mikroprzepływowe wytwarzanie mikrokapsułek typu core-shell zawierających sferoidy ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj mikrokapsułkowanie alginianowe do różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w neurony dopaminergiczne w systemie 3D. Ta metoda zwiększa gęstość komórek i interakcje międzykomórkowe.

Mikrokapsułka alginianowa jako platforma 3D do rozmnażania i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) do różnych linii (Wideo) | JoVE Journal

Mikrokapsułka alginianowa jako trójwymiarowa platforma do propagacji i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w różne linie komórkowe

Przeglądaj więcej filmów