Mikrokapsułka alginianowa jako platforma 3D do rozmnażania i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) do różnych linii

Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem enkapsulacji pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i różnicowania ich w neurony dopaminergiczne w systemie 3D. Najpierw potraktuj kolonie inhibitorem skał lub RI i połącz je w pojedyncze komórki za pomocą akuatu zmieszanego z alginianem sodu i przepuszczonego przez urządzenie do kapsułkowania. Kontynuuj leczenie RI przez trzy dni, przenieś zamknięte komórki na sześć komórek PA i różnicuj się przez 28 dni.

Ostatecznie analiza ekspresji genów i białek wykazuje wyższą skuteczność generowania neuronów dopaminergicznych. Główną przewagą tej konkretnej techniki nad istniejącym protokołem różnicowania 2D jest to, że staramy się rozmnażać i różnicować te komórki w środowisku 3D, a środowisko 3D daje możliwość rozmnażania komórek w sposób o dużej gęstości. Daje to również możliwość lepszej interakcji między komórkami w celu różnicowania.

I po trzecie, zapewniają również lepszą skuteczność różnicowania w przyszłości. Dodam jeszcze, że ta konkretna technika może być również zaadaptowana do innych typów komórek, które możemy rozmnażać w środowisku 3D. Pamiętaj również, jak na przykład, ta konkretna technika została zoptymalizowana w oparciu o użycie określonego inhibitora skały, który zapobiega apoptozie komórek, a także zapobiega oderwaniu się komórki od szalek hodowlanych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności na początku, ponieważ technika ta nie jest zwykle wykonywana w hodowli tkankowej. Poniższa technika enkapsulacji została zoptymalizowana w oparciu o badania podsumowujące dr Deana dr Chada dotyczące stosowania rodzaju inhibitora R alginianu, stężenia alginianu i ustawień urządzenia do kapsułkowania. Jamie i Kim, doktorantka z naszego laboratorium, zademonstrują teraz ten protokół.

Dodaj 25 mililitrów sterylnego 0,1% roztworu żelatyny do 275 miligramów oczyszczonego alginianu sodu w sterylnym 50-mililitrowym wirze probówki, aby częściowo rozpuścić proszek alginianu. Następnie umieść probówkę na mikserze orbitalnym w temperaturze 10 razy G przez noc. Następnie dodać 9% sterylny chlorek sodu do roztworu alginianu.

Wirować przez 30 sekund, a następnie wirować przy 95 razy G przez pięć minut. Roztwór alginianu należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw w ciemnym środowisku należy wstępnie potraktować ludzkie embrionalne komórki macierzyste pożywką hodowlaną uzupełnioną 10 mikromolami inhibitora skalnego.

Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Teraz umyj komórki dwukrotnie DPBS, aby usunąć komórki enzymatycznie. Dodaj accutane i inkubuj przez 10 minut.

W temperaturze 37 stopni Celsjusza delikatnie zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś do 15-mililitrowej probówki. Zneutralizować Accutane równą objętością podłoża SL. Następnie przepuść zneutralizowane komórki przez filtr 40 mikronów do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Teraz użyj hemocytometru, aby policzyć komórki. Osadzać komórki przez wirowanie, ostrożnie wyrzucać supinat. Następnie umyj komórki raz za pomocą podgrzewania.

0,9% chlorek sodu. Odwiruj swój zysk i odrzuć supinat. Aby otoczyć ludzkie embrionalne komórki macierzyste, zacznij od zawieszenia komórek w Resus za pomocą wstępnie ciepłego roztworu alginianu.

Aby to zrobić, podłącz 20-mililitrową strzykawkę do miękkiej plastikowej rurki i odessać alginian do strzykawki. Następnie delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą strzykawki, nie tworząc pęcherzyków. Teraz odessać komórki do strzykawki.

Wyrzuć plastikową rurkę, a następnie podłącz strzykawkę do urządzenia do kapsułkowania. Przejdź do konfiguracji przyrządów generatora perełek, pompy strzykawkowej, miernika przepływu powietrza i kąpieli wytrącającej chlorek wapnia. Sprawdź 10-centymetrową przerwę między końcem maszyny do kapsułkowania a punktem pobierania szalki Petriego.

Następnie ustaw pompę strzykawkową na 10 mililitrów na godzinę. Natężenie przepływu powietrza na poziomie ośmiu litrów na minutę i ciśnienie 100 kilo paskalów. Zbierz zamknięte komórki w ciepłej kąpieli strącającej na siedem minut.

Następnie przenieś je przez delikatne zasysanie do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 20 mililitrów 0,9% chlorku sodu, pozwól kapsułkom osiąść na dnie probówki, delikatnie wyrzuć supinian, a następnie przemyj raz 0,9% chlorkiem sodu. Przystąp do ponownego zawieszenia zamkniętych komórek w wstępnie podgrzanym podłożu hodowlanym, uzupełnionym inhibitorem skały. Przenieść do kolby hodowlanej i inkubować przez trzy dni.

Wysiewaj sześć komórek PA linii zrębu myszy w 0,1% pokrytej żelatyną kolbie T 75 i kondycjonuj dopaminergiczne różnicowanie neuronalne przez 24 godziny. Przenieść kapsułki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i pozostawić je do osadzenia się na dnie probówki. Wyrzuć supinat i ponownie zawieś kapsułki w dopaminergicznym różnicowaniu neuronalnym PA w stanie sześciokomórkowym.

Średnia kultura. Kapsułkowane ludzkie embrionalne komórki macierzyste z sześciokomórkową monowarstwą PA przez 21 dni. Podczas uzupełniania nośnika zmień go.

Tylko połowa pożywek za każdym razem kontynuuje hodowlę sześciu komórek PA w dopaminergicznym różnicowaniu neuronalnym. Pożywka uzupełniona czynnikami indukującymi przez tydzień. Najpierw odessać kapsułki i przenieść je do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Gdy kapsułki osiądną na dnie, wyrzuć supinat. Przemyć dwukrotnie DPBS, odrzucając supinat. Następnie dodać pięć mililitrów roztworu do usuwania kapek i dokładnie wymieszać zawiesinę.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu osadu, komórki decap i dwukrotne przemycie DPBS przystępują do wykorzystania komórek decap jako hodowli jednowarstwowej lub do natychmiastowej analizy końcowej. W typowym preparacie średnica mikroczapek alginianowych wynosi od 400 do 500 mikronów.

Tutaj test C-F-D-A-P-I. Wyniki określają zielone, żywotne, otorbione komórki w 80% Analizy żywotności, proliferacji i apoptozy zamkniętych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w różnych punktach czasowych służą optymalizacji warunków hodowli. Co ciekawe, działanie inhibitorów skał zapobiega apoptozie wywołanej dysocjacją i utrzymuje żywotność komórek, co wskazuje na lepszy wzrost otorbionych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych hodowanych w H-F-F-C-M plus ri.

W tym przykładzie zastosowano enkapsulację komórek jako platformę 3D do różnicowania zamkniętych w kapsułkach ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w neurony dopaminergiczne. Zgodnie z oczekiwaniami wielkość ciał zarodków zwiększa się z czasem, na komórkach kapsułki dec wykazują postępującą morfologię neuronów po dwóch do trzech dniach hodowli z ponad 90% żywotnością. Analiza ekspresji genów wskazuje na obniżenie poziomu markera pluripotencjalnego OCT four.

Co ważne, marker neuroprogenitorowy PAC 6 i dopaminergiczny marker neuronalny th pozostają regulowane w górę po siedmiu dniach różnicowania. Dalej zróżnicowane ludzkie embrionalne komórki macierzyste wskazują na więcej niż 90% neuronów TH dodatnich po 21 dniach. Zachodnia analiza strat potwierdza korzystne wzorce ekspresji TH i PAC sześć w systemach hodowli komórkowych 3D w porównaniu z 2D.

Po opanowaniu tej techniki można ją skutecznie wykonać w ciągu dwóch godzin. Pamiętaj, aby potraktować komórki inhibitorem skały przed i po enkapsulacji. Induktory wariantów lub inhibitory mogą dostosować protokół różnicowania 3D do przyszłych eksperymentów.

Jest to szczególna technika kapsułkowania ludzkiego ESL i różnicowania go w środowisku 3D lub w celu potencjalnej terapii komórkowej w wielu chorobach, w szczególności w chorobie Parkinsona.