Skuteczne różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe

Ogólnym celem tej procedury jest różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe. Pierwsza hodowla myszy, embrionalne komórki macierzyste na pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy i suplement czynnikiem hamującym białaczkę. Następnie wzmocnij proces normalizacji, dodając nogginę BFG F i FGF osiem indukuje specyfikację neuronów ruchowych poprzez inkubację z kwasem retinowym i wygładzonym agonistą, po czym następuje wydłużenie aksonów i dojrzewanie neuronów ruchowych.

Na koniec użyj mikroskopii immunofluorescencyjnej do zbadania zróżnicowanych komórek MES, które wyrażają silną fluorescencję GFP Generowanie dużych ilości neuronów ruchowych ułatwiło badania nad chorobami neuronu ruchowego w porównaniu z obecnie istniejącymi protokołami. To podejście polegające na różnicowaniu embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe jest bardziej efektywne. Ta metoda może dostarczyć informacji na temat rdzeniowego zaniku mięśni.

Może być również stosowany w innych chorobach neuronu ruchowego, takich jak stwardnienie zanikowe boczne Aby pokryć pierwotne fibroblasty embrionalne myszy pokryj cztery 100-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych ośmioma mililitrami 0,1% roztworu żelatyny. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej wylej nadmiar płynu. Teraz rozcieńczyć jedną fiolkę mitomycyny C w aktywowanym PMEF w 40 mililitrach pożywki PMEF na czterech płytkach i hodować przez okres do jednego tygodnia.

Następnie rozmrozić jedną fiolkę z komórkami MES w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni. Umyj komórki pięcioma mililitrami pożywki E ES w 15-mililitrowej probówce. Po odwirowaniu z prędkością 800 obr./min przez pięć minut.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki MES w 20 mililitrach pożywki ES ze świeżo dodanym czynnikiem hamującym białaczkę. Kontynuuj usuwanie 10 mililitrów pożywki z kultur PMEF i zastąp 10 mililitrami zawiesiny trzech komórek HBG ES. Monitoruj postęp komórek MES w czasie od małych kolonii po 24 godzinach do kolonii o średnicy około 100 mikrometrów po 72 godzinach od posiewu.

Codziennie wymieniaj pożywkę, aby utrzymać proliferację komórek w celu indukcji komórek MES. Różnicowanie w neurony ruchowe. Embrionalne komórki macierzyste myszy muszą najpierw zostać oddzielone od komórek żywiących PMEF, a następnie hodowane w środowisku zawiesinowym w dniu indukcji.

Na każdą 100 milimetrową hodowlę ES przygotować kolbę T one 50 pokrytą 0,1% żelatyną Po 30 minutach w temperaturze pokojowej usunąć nadmiar żelatyny i przemyć trzykrotnie PBS. Kontynuuj ostrożne odsysanie pożywki z kultury ES, uważając, aby nie usunąć luźno przyczepionych kolonii. Następnie umyj raz 10 mililitrami PBS.

Teraz, aby oddzielić komórki MES od PMEF, dodaj trzy mililitry 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj przez trzy do pięciu minut. W temperaturze 37 stopni Celsjusza sprawdź, czy komórki macierzyste i PMEF oderwały się od płytki. Następnie dodaj 15 mililitrów świeżej pożywki ES i rozbij kolonie przez pipetowanie.

Przenieść zawiesinę komórek do przygotowanej kolby T one 50 pokrytej żelatyną, inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby PFS przyłączył się do zżelowanej powierzchni. Teraz zbierz pływające komórki MES w 50-mililitrowej probówce i granuluj przez centrację. Ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach różnicowania neuronalnego.

Pożywkę należy policzyć za pomocą hemocytometru, a następnie umieścić na 100-milimetrowej naczyniu do hodowli zawiesiny podczas różnicowania. Pierwszego dnia sprawdź pod mikroskopem, czy komórki MES utworzyły małe pływające agregaty zwane ciałami embrionalnymi. Ponieważ do naczynia dołączony jest jakikolwiek PMEF przeniesiony, przenieś komórki zawiesinowe ES i pożywkę do 15-mililitrowej probówki, a następnie odwiruj z prędkością 500 obr./min przez trzy minuty.

Aby zebrać ciała embrionalne, ostrożnie odessać pożywkę, ostrożnie dodaj 10 mililitrów świeżego różnicowania nerwowego, pożywki do granulowanych ebs, a następnie umieść komórki w nowej kulturze bakteryjnej przez 24 godziny po różnicowaniu. Dzień drugi zakręć naczyniem hodowlanym i przenieś pożywkę i EBS do 15-mililitrowej probówki. Pozwól EBS osiąść grawitacyjnie, a następnie ostrożnie odessaj pożywkę i zreusuj zawiesić EBS i 10 mililitrów różnicowania neuronów ruchowych.

Pożywka EBS w nowym naczyniu bakteryjnym przez pięć dni po różnicowaniu. Siódmego dnia sprawdź, czy EBS mają średnicę około 150 do 200 mikrometrów i wyrażają silne sygnały GFP podczas różnicowania. Piąty dzień, dwa dni przed dysocjacją EBS, umieść 12-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe na dnie płytki 24-dołkowej.

Następnie dodaj 0,5 mililitra 100 mikrogramów na mililitr, poli DL ornitynę i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Zassać suche na powietrzu płytki i szkiełka nakrywkowe z poli DL ornityny w kapturze do hodowli tkankowych. Przepłucz studzienki płytki trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną.

Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, aby pokryć szkiełka nakrywkowe. Wykonaj świeże rozcieńczenie dwóch mikrogramów na mililitr mysiej lamininy w pięciu mililitrach mrożonego zimnego XPBS. Dodaj 0,5 mililitra na studzienkę i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Umyć dwukrotnie PBS po różnicowaniu. Siódmego dnia zbierz EBS do 15-mililitrowej rurki i pozwól EBS osiąść grawitacyjnie. Po czterech praniach z PBS dodaj jeden mililitr ACU max do EBS, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessaj nadmiar ACU max pokrywając ebs.

Teraz dodaj trzy mililitry pożywki MND i zdysocjuj EBS, pipetując około 20 razy za pomocą mikropipety einor o pojemności jednego mililitra, a następnie inkubuj przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, przełóż zawiesinę komórek przez nasadkę trenera komórek do probówki o wymiarach 12 na 75 milimetrów. Powtórzyć ten etap dysocjacji z pozostałymi grudkami i komórkami zatrzymanymi przez filtr, aby wzbogacić wydajność pojedynczych komórek w końcowej zawiesinie pojedynczej komórki o objętości sześciu mililitrów. Delikatnie wymieszaj zawiesinę pojedynczej komórki i policz komórki za pomocą cytometru hemocytometru, rozcieńczyć komórki w kompletnym pożywce MND do gęstości dwa razy 10 do piątej komórki na mililitr płytki.

0,5 mililitra zawiesiny komórek na studzienkę przygotowanych 24-dołkowych płytek zawierających szkiełka nakrywkowe pokryte poli DL ornityną lamininą. Zróżnicowane komórki wydłużają długie neuryty po dwóch dniach. W hodowli HBG 3 jest linią komórkową ES pochodzącą od transgenicznej myszy wykazującej ekspresję EGFP pod kontrolą specyficznego dla neuronu ruchowego promotora HB nine o określonym protokole różnicowania.

Komórki MES mogą być wykorzystywane do wyprowadzania neuronów ruchowych. Niezróżnicowane komórki MES tworzą okrągłe kolonie na wierzchu warstwy zasilającej fiberblast. Mają słabą ekspresję GFP.

Te komórki MES oddzielono od warstw zasilających i hodowano na szalkach o niskim przyczepie, aby utworzyć ciała embrionalne. Zróżnicowane komórki MES wykazywały silną fluorescencję GFP po siódmym dniu. Różnicowanie EBS zdysocjowano i posiano na płytkach pokrytych poli DL ornityną lamininą.

Zróżnicowane komórki rozciągają długie neuryty z ciał komórkowych posianych komórek po dwóch dniach hodowli, neurony ruchowe pochodzące z komórek MES można scharakteryzować przez barwienie immunofluorescencyjne. Te komórki GFP dodatnie wyrażają neurofilament markerowy pan neuronal i dwa markery specyficzne dla neuronów ruchowych. Powieka pierwsza i acetylotransferaza choliny DPI barwi jądra razem wzięte.

Nasz dwuetapowy protokół różnicowania zapewnia skuteczny sposób różnicowania komórek MES w rdzeniowe neurony ruchowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak skutecznie różnicować embrionalne komórki macierzyste myszy w neurony ruchowe. Podsumowując, pamiętaj, że wysoka jakość embrionalnych komórek macierzystych myszy jest najważniejszym parametrem dla wydajnego generowania neuronów ruchowych.