Name: Skuteczne różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj protokół różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w neurony ruchowe. Ta metoda wykorzystuje czynniki wzrostu i kwas retinowy do generowania dużych ilości neuronów z markerami specyficznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejszy manuskrypt jest dedykowany pamięci dr Wenlan Wang, która zmarła 26 maja 2011 roku. Dziękujemy dr. Douglasowi A. Kerrowi za hojność w udostępnieniu linii komórek mES HBG3 wykorzystanych w tej pracy. Praca ta była finansowana przez Nemours, grant (2 RR016472-10) w ramach programu INBRE Narodowego Centrum Zasobów Badawczych (NCRR), a także grant COBRE przyznany przez NCRR (5 P20 RR020173-05) na wsparcie Centrum Badań Pediatrycznych w Alfred I. duPont Hospital for Children w Wilmington, Delaware, USA.

1. Krok 1: Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy (mES) (Czas trwania: 3 dni)
1. Wysiewanie pierwotnych embrionalnych fibroblastów mysich (PMEF)
<ol>
	<li>Pokryj cztery 100-milimetrowe naczynia do hodowli tkankowej żelatyną w celu zapewnienia adhezji PMEF. Dodaj 8 ml 0,1% roztworu żelatyny (StemCell Technologies) do każdego naczynia i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń nadmiar żelatyny z naczyń. Nie płucz naczyń.</li>
	<li>Rozcieńcz jedną fiolkę PMEF inaktywowanych mitomycyną C (Millipore), zawierającą ok. 5 x 106 komórek, w 40 ml pożywki dla PMEF (patrz przepis w Tabeli 1) i wysiej na cztery 100-milimetrowe naczynia do hodowli tkankowej. Komórki PMEF stanowią warstwę pokarmową dla komórek mES.</li>
	<li>PMEF powinny zostać wysiane co najmniej jeden dzień przed dodaniem kultur komórek mES. PMEF można wykorzystać do 1 tygodnia po wysianiu.</li>
</ol>
2. Wysiewanie komórek mES
Aby monitorować wydajność różnicowania komórek mES w neurony ruchowe, wykorzystano linię komórek ES HBG3, pochodzącą od myszy transgenicznej wykazującej ekspresję eGFP pod kontrolą specyficznego dla neuronów ruchowych promotora Hb9.
<ol>
	<li>Rozmrozić 1 ampułkę komórek mES HBG3 (ok. 1 x 107, udostępnionych przez dr. Douglasa Kerra z Johns Hopkins University) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Do probówki o pojemności 15 ml dodać 5 ml pożywki ES (patrz przepis w Tabeli 1) i odwirować komórki przy 800 rpm przez 5 min.</li>
	<li>Odssać supernatant i resuspendować komórki mES w 20 ml pożywki ES z dodanym na świeżo czynnikiem hamującym białaczkę (LIF) w stężeniu końcowym 10 ng/ml. UWAGA: LIF należy dodać w dniu użycia; jest on niezbędny do utrzymania komórek mES w stanie niedróżnicowanym.</li>
	<li>Usunąć 10 ml pożywki PMEF z każdego naczynia z PMEF i dodać do każdego naczynia 10 ml zawiesiny komórek ES HBG3.</li>
	<li>24 h po wysianiu komórki mES tworzą małe kolonie, o rozmiarze zbliżonym do kolonii wskazanej grotem strzałki na Rysunku 1B. 72 h po wysianiu kolonie zwiększają swoją wielkość, przy czym wiele z nich ma średnicę około 100 μm (Rysunek 1B, wskazane strzałkami). Komórki te są gotowe do różnicowania. Pożywkę należy wymieniać codziennie, aby utrzymać proliferację komórek.</li>
</ol>
2. Krok 2: Indukcja neuronalna (Czas trwania: 2 dni)
Aby indukować różnicowanie komórek mES w neurony ruchowe, komórki mES muszą zostać oddzielone od PMEF i hodowane w środowisku zawiesiny. Do oddzielenia PMEF od komórek mES stosuje się kolby powlekane żelatyną.
<ol>
	<li>Gdy kolonie mES są gotowe do indukcji neuronalnej (definiowanej jako dzień 0 różnicowania), pokryj 2 kolby T150 0,1% żelatyną (18 ml/kolba) przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie usuń nadmiar żelatyny i przemyj trzykrotnie 1x PBS. UWAGA: Każda hodowla w szalce 100-mm będzie wymagać jednej kolby T150 pokrytej żelatyną w celu oddzielenia PMEF.</li>
	<li>Ostrożnie usuń medium poprzez aspirację, uważając, aby nie oderwać słabo przytwierdzonych kolonii. Dodaj na krótko 10 ml PBS, a następnie usuń je przez aspirację, aby zakończyć etap płukania.</li>
	<li>Aby oddzielić komórki mES od PMEF, dodaj 0,25% trypsyny/EDTA (3 ml/szalka, StemCell Technologies) i inkubuj przez 3-5 min w 37 °C, aż komórki macierzyste i PMEF oddzielą się od płytki. Dodaj 15 ml świeżego medium ES bez LIF i pipetuj komórki w górę i w dół, aby rozbić kolonie (około 15-20 razy). Następnie przenieś je do kolby T150 pokrytej 0,1% żelatyną i inkubuj przez 30 min w 37 °C. Po inkubacji PMEF powinny przytwierdzić się do żelatynowanej powierzchni, podczas gdy komórki ES powinny pozostać w zawiesinie. Zbierz pływające komórki mES do probówki 50 ml.</li>
	<li>Wirować przy 800 rpm i resuspendować komórki w 10 ml Medium do Różnicowania Neuronalnego (patrz receptura w Table 1).</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie wysiej około 2 x 106 komórek mES na 100-mm szalkę do hodowli bakterii lub kultur w zawiesinie. Płytki te umożliwiają wzrost kultur w zawiesinie i wspomagają tworzenie ciałek zarodkowych (EBs).</li>
	<li>W 1 dniu różnicowania komórki mES tworzą małe pływające agregaty (EBs), które są widoczne pod mikroskopem świetlnym. Wszelkie pozostałe PMEF przytwierdzają się do szalki. Przenieś komórki w zawiesinie wraz z medium do probówki 15 ml i wiruj przy niskiej prędkości (500 rpm) przez 3 min. Ostrożnie aspiruj medium, dodaj 10 ml świeżego Medium do Różnicowania Neuronalnego do osadu EBs, a następnie wysiej komórki na nową szalkę do hodowli bakterii. Ten krok, oprócz uzupełnienia medium, usuwa wszelkie PMEF, które przeniosły się z poprzedniego etapu.</li>
	<li>W 2 dniu różnicowania EBs są gotowe do indukcji w neurony ruchowe.</li>
</ol>
3. Krok 3: Specyfikacja neuronów ruchowych (Czas trwania: 5 dni)
<ol>
	<li>W 2. dniu różnicowania delikatnie zamieszaj naczynie hodowlane, a następnie przenieś medium wraz z EB do probówki o pojemności 15 ml. Pozostaw EB do osadzenia pod wpływem grawitacji (~ 10 min) lub poprzez wirowanie z niską prędkością (500 rpm) przez 3 min.</li>
	<li>Ostrożnie odessij medium i resuspenduj EB w 10 ml medium do różnicowania neuronów ruchowych (MND) (patrz przepis w Tabeli 1). Przenieś EB do nowej szalki bakteriologicznej i wymieniaj medium codziennie przez 5 dni.</li>
	<li>W 7. dniu różnicowania EB powinny mieć średnicę około 150 - 200 μm i wykazywać silny sygnał GFP (Rycina 1C). Takie EB są gotowe do dysocjacji i wysiania na naczynia lub szkiełka nakrywkowe powlekane poli-DL-ornityną/lamininą.</li>
</ol>
4. Krok 4: Przygotowanie szkiełek podstawowych pokrytych poly-DL-ornityną/lamininą (Czas trwania: 2 dni)
Na dwa dni przed dysocjacją ciał embrioidalnych (EB) (tj. w 5. dniu różnicowania) należy przygotować szkiełka podstawowe pokryte poly-DL-ornityną/lamininą.
<ol>
	<li>Umieść okrągłe szkiełka nakrywki o średnicy 12 mm (Warner Instruments) na dnie płytki 24-dołkowej. Rozpuść 25 mg poli-DL-ornityny (Sigma-Aldrich) w 25 ml sterylnej, dwukrotnie destylowanej wody (d2H2O), aby otrzymać 10X roztwór zapasowy (1 mg/ml). Przed użyciem przygotuj 1/10 rozcieńczenie poli-DL-ornityny w d2H2O, aby uzyskać stężenie 100 μg/ml. Dodaj 0,5 ml do każdego dołka płytki 24-dołkowej i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia (6. dzień różnicowania) odessij poli-DL-ornitynę i pozostaw płytki oraz szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przepłucz dołki płytki trzykrotnie wodą d2H2O. Pozostaw do wyschnięcia przez kolejną godzinę.</li>
	<li>Rozpuść 1 mg lamininy mysiej (Millipore) w 5 ml schłodzonego 1X PBS, aby przygotować 100x roztwór zapasowy (200 μg/ml). Przed użyciem wykonaj 1/100 rozcieńczenie w schłodzonym 1X PBS (2 μg lamininy/ml). Dodaj 0,5 ml na dołek w płytce 24-dołkowej i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Przed wysianiem komórek należy usunąć nadmiar lamininy i dwukrotnie przepłukać dołki roztworem 1X PBS. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w medium MND (0,5 ml/dołek).</li>
</ol>
5. Krok 5: Wydłużanie aksonów (Czas trwania: 2 dni)
<ol>
	<li>W 7. dniu różnicowania zebrać ciała embroidalne (EBs) do probówki 15 ml i pozwolić im osiaść (około 3 min). Odessać medium i resuspendować EBs w PBS. Pozostawić EBs do osiadania, a następnie odessać PBS. Powtórzyć ten krok 3 razy. Dodać 1 ml Accumax (Millipore) do EBs, delikatnie wymieszać i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Następnie odessać nadmiar Accumax pokrywający EBs.</li>
	<li>Aby zdysocjować EBs, dodać 3 ml medium MND. Pipetować 20 razy w górę i w dół za pomocą mikropipety Eppendorf 1 ml (niebieska końcówka), aby rozbić EBs. Inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 12x75 mm z nakrętką z filtrem do komórek (BD Falcon), aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Powtórzyć ten krok dysocjacji z pozostałymi skupkami i komórkami zatrzymanymi przez filtr w celu zwiększenia wydajności uzyskania pojedynczych komórek. Końcowa objętość zawiesiny pojedynczych komórek wyniesie 6 ml.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać tę zawiesinę pojedynczych komórek i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć komórki w medium MND (uzupełnionym o 10 ng/ml każdego z czynników BDNF, GDNF, CNTF i NT-3) do gęstości 2x105 komórek na ml. Przenieść zawiesinę komórkową (0,5 ml/dołek) do płytek 24-dołkowych zawierających szkiełka podstawowe pokryte poly-DL-ornityną/lamininą (przygotowane wcześniej zgodnie z powyższym opisem). Zróżnicowane komórki wykształcają długie neuryty po 2 dniach hodowli (Rycyna 1D).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1A przedstawia schemat protokołu. W kroku 1 komórki mES są hodowane na PMEF z dodatkiem LIF w celu zapobiegania spontanicznej różnicowaniu. Zazwyczaj niezróżnicowane kolonie mES są okrągłe, zwarte i mają wyraźnie zdefiniowane krawędzie. Kolonie nie stykają się ze sobą. Typowo komórki mES powinny być pasażowane w stosunku 1:4 co 2~3 dni. Jednak każda poszczególna linia komórkowa rośnie w innym tempie, a stosunek pasażowania musi zostać określony empirycznie. Strzałki na Rysunku 1B wskazują typowy wygląd komórek mES po 3 dniach hodowli na warstwie zasilającej PMEF. Kolonie te są duże (50-100 μm średnicy), lecz nadal zachowują okrągłe i wyraźne krawędzie. Na tym etapie kolonie są gotowe do różnicowania lub subkultury. Grot strzałki na Rysunku 1B pokazuje małą kolonię mES, którą typowo spotyka się 24 h po wysianiu. Cztery dni po wysianiu komórki mES stają się przerośnięte. Wykazują spłaszczony wygląd i utratę wyraźnych granic, co wskazuje na rozpoczęcie procesu różnicowania. Takie komórki nie są optymalne do różnicowania w komórki neuronalne.
Aby zróżnicować komórki mES w neurony ruchowe, komórki mES muszą być hodowane w warunkach zawiesiny, aby umożliwić tworzenie ciałek zarodkowych (EB). W kroku 2 komórki ES są przenoszone na powierzchnię hodowlaną bez warstwy karmionej, aby promować tworzenie EB. Na tym etapie są one inkubowane w medium do różnicowania neuralnego uzupełnionym o Noggin, bFGF i FGF-8 przez 2 dni, aby skierować komórki na linię neuralną. Małe EB można zaobserwować pod mikroskopem w 1. dniu różnicowania. Powinny one unosić się w medium. W 1. dniu różnicowania mogą być obecne również pozostałości PMEF, które muszą zostać usunięte. Komórki te przylegają do naczyń bakteryjnych, więc są eliminowane podczas pasażowania EB do nowego naczynia bakteryjnego. Zatem do 2. dnia różnicowania w naczyniu hodowlanym powinno być widocznych niewiele lub żadnych PMEF. W kroku 3 dalsze przenoszenie EB do nowych naczyń powinno zapewnić usunięcie wszelkich pozostałych PMEF. EB są hodowane w medium do różnicowania neuronów ruchowych (MND) uzupełnionym o RA i SAG przez 5 dni, aby zróżnicować komórki w neurony ruchowe. Podczas hodowli EB nadal zwiększają swoją wielkość i mogą być widoczne gołym okiem w 3–4. dniu różnicowania. Rycina 1C przedstawia wygląd mikroskopowy EB w 7. dniu różnicowania. W przeciwieństwie do komórek niezróżnicowanych, EB wykazują silną fluorescencję dzięki ekspresji GFP. Te EB są optymalnie zróżnicowane i gotowe do dysocjacji. Cytometria przepływowa wykazała, że 51% ± 0,8% komórek z dysocjowanych EB zróżnicowało się w komórki wykazujące ekspresję GFP5. W kroku 5 hodowla tych neuronów ruchowych w obecności GDNF, CNTF, BDNF i NT3 prowadzi do wydłużenia długich projekcji aksonalnych. Rycina 1D przedstawia wygląd zróżnicowanych komórek 2 dni po wysianiu dysocjowanych EB. Zwróć uwagę na długie neuryty wychodzące z ciał komórkowych wysianych komórek. Barwienie immunofluorescencyjne pokazuje, że komórki GFP+ wykazują ekspresję markera pan-neuronalnego (neurofilament średniołańcuchowy) oraz dwóch markerów specyficznych dla neuronów ruchowych (Islet-1 oraz cholinoacetylotransferazy, Rycina 2).
<img alt="Schemat procesu różnicowania neuronalnego z obrazami mikroskopowymi pokazującymi hodowlę ESC, indukcję, elongację." src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Różnicowanie komórek mES w neurony ruchowe (rysunek zmodyfikowany z Wu et al.5). A) Schemat protokołu różnicowania komórek mES w neurony ruchowe. B) Niedoróżnicowane komórki mES tworzą okrągłe kolonie na powierzchni warstwy karmionej z fibroblastów. Wykazują słabą ekspresję GFP. C) Komórki mES oddzielono od warstw karmionych i hodowano na naczyniach o niskim stopniu przylegania w celu utworzenia ciał embroidalnych (EB). Podczas pierwszych dwóch dni procesu różnicowania komórki poddano działaniu 50 ng/ml Noggin, 20 ng/ml bFGF oraz 20 ng/ml FGF-8. Następnie indukowano ich różnicowanie za pomocą 1 μM kwasu retinowego i 1 μM agonisty sonic hedgehog SAG przez 5 dni. Zróżnicowane komórki mES wykazały silną fluorescencję GFP. D) Po 7-dniowym różnicowaniu EB rozdzielono i wysiano na płytki pokryte poli-DL-ornityną/lamininą. Zróżnicowane komórki wytworzyły długie wypustki neuronalne po 2 dniach hodowli. Pasek skali = 200 μm. MN = neuron ruchowy. B, C i D to obrazy w polu jasnym, a B', C' i D' to odpowiadające im obrazy fluorescencyjne.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna GFP, ChAT, DAPI w neuronach; znakowanie komórek, analiza ekspresji białek." src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Charakterystyka neuronów ruchowych pochodnych z komórek mES. Barwienie immunofluorescencyjne dla średniołańcuchowego neurofilamentu (NF-M, czerwony), ChAT (czerwony) i Islet-1 (czerwony) pokrywało się z ekspresją GFP (zielony). DAPI (niebieski) zastosowano do identyfikacji jąder komórkowych. Pasek skali = 50 μm.

<ol><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li>
<li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li>
<li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li>
<li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies%2C+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li>
<li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25(2011).</li>
<li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li>
<li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li>
<li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li>
<li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
<li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Jakość komórek mES jest krytycznym parametrem dla wydajnej generacji neuronów ruchowych. Komórki mES muszą być hodowane na PMEF, aby zapobiec spontanicznej różnicowaniu. Dodatek LIF pomaga utrzymać komórki mES w stanie nieróżnicowanym. Ponieważ komórki mES dzielą się co 12-15 h, pożywka hodowlana szybko ulega wyczerpaniu i musi być wymieniana codziennie.
Efektywna aktywacja szlaku Shh jest krytycznym parametrem niezbędnym do indukcji specyfikacji neuronów ruchowych. W celu promowania tworzenia...

<table><tbody><tr><td>PMEF </td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-H</td><td>N.D.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td>N.D.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>10%</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1%</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15240-063</td><td>1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>36250</td><td>N.D.</td></tr><tr><td>FBS kwalifikowany dla komórek ES</td><td>Invitrogen</td><td>16141-079</td><td>15%</td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1%</td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1%</td></tr><tr><td>Nukleozydy</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-008-D</td><td>1%</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-007-E</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-AB2-C</td><td>1%</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>LIF2010</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>36250</td><td>N.D.</td></tr><tr><td>FBS ES Cult</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>06905</td><td>15%</td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1%</td></tr><tr><td>Monotioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-6145</td><td>1mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Invitrogen</td><td>PHC1506</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF-8</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0274</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0024</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Podłoże podstawowe ES-Cult Medium-A</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5801</td><td>N.D.</td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy Knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Suplement N-2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>1%</td></tr><tr><td>Suplement ITS-B</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07155</td><td>1% </td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07157</td><td>1%</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-AB2-C</td><td>1%</td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1%</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-8270</td><td>0.15% w d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Fibrynektyna</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07159</td><td>5 &amp;#x03BC;g/ml </td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>20 &amp;#x03BC;g/ml w d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-007-E</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-2625</td><td>1 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660</td><td>1 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Podłoże podstawowe ES-Cult Medium-A</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5801</td><td>N.D.</td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy Knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Suplement N-2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>1%</td></tr><tr><td>Suplement ITS-B</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07155</td><td>1% </td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07157</td><td>1%</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-AB2-C</td><td>1%</td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1%</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-8270</td><td>0.15% w d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Fibrynektyna</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07159</td><td>5 &amp;#x03BC;g/ml </td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>20 &amp;#x03BC;g/ml w d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-007-E</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>248-BD-005/CF</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>CNTF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>257-NY-010/CF</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>212-GD-010/CF</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>267-N3-005/CF</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">N.D. = nie dotyczy</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; PMEF i podłoża do hodowli lub różnicowania komórek mES</td></tr><tr><td>0,1% żelatyny</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07903</td><td>N.D.</td></tr><tr><td>Poly-DL-ornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0421</td><td>0.1 mg/ml w d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Laminina mysia</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td>2 &amp;#x03BC;g/ml w PBS</td></tr><tr><td>0,25% trypsyny/EDTA</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07901</td><td>N.D.</td></tr><tr><td>Accumax</td><td>EMD Millipore</td><td>SCR006</td><td>N.D.</td></tr><tr><td colspan="4">N.D. = nie dotyczy</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Odczynniki do powlekania i dysocjacji</td></tr></tbody></table>

efektywna różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Bezpośrednia różnicowanie komórek macierzystych zarodkowych (ES) w funkcjonalne neurony ruchowe stanowi obiecujące narzędzie do badania mechanizmów chorobowych, przesiewania nowych związków leczniczych oraz opracowywania nowych terapii chorób neuronów ruchowych, takich jak rdzeniowy zanik mięśni (SMA) i stwardnienie zanikowe boczne (ALS). Wiele aktualnych protokołów wykorzystuje kombinację kwasu retinowego (RA) i białka sonic hedgehog (Shh) do różnicowania mysich komórek macierzystych zarodkowych (mES) w neurony ruchowe1-4. Jednakże wydajność różnicowania komórek mES w neurony ruchowe osiągała dotychczas jedynie umiarkowany sukces. Opracowaliśmy dwuetapowy protokół różnicowania5, który znacząco poprawia wydajność różnicowania w porównaniu z obecnie ustanowionymi protokołami. Pierwszy etap polega na wzmocnieniu procesu neuralizacji poprzez dodanie Noggin oraz czynników wzrostu fibroblastów (FGFs). Noggin jest antagonistą białka morfogenetycznego kości (BMP), który uczestniczy w indukcji neuralnej zgodnie z modelem domyślnym neurogenezy, co prowadzi do powstania przedniej struktury układu nerwowego6. Sygnalizacja FGF działa synergistycznie z Noggin w indukowaniu tworzenia tkanki nerwowej poprzez promowanie tylnej tożsamości neuralnej7-9. Na tym etapie komórki mES poddano działaniu Noggin, bFGF i FGF-8 przez dwa dni, aby promować różnicowanie w kierunku linii neuralnych. Drugim etapem jest indukcja specyfikacji neuronów ruchowych. Komórki mES eksponowane na Noggin/FGFs inkubowano z RA oraz agonistą Shh, agonistą białka Smoothened (SAG), przez kolejne 5 dni, aby ułatwić generowanie neuronów ruchowych. W celu monitorowania różnicowania mES w neurony ruchowe wykorzystano linię komórek ES pochodzącą od myszy transgenicznej wykazującej ekspresję eGFP pod kontrolą specyficznego dla neuronów ruchowych promotora Hb91. Stosując ten skuteczny protokół, osiągnęliśmy wydajność różnicowania na poziomie 51±0.8% (n = 3; p &lt; 0.01, test t Studenta)5. Wyniki barwienia immunofluorescencyjnego wykazały, że komórki GFP+ wykazują ekspresję markerów specyficznych dla neuronów ruchowych: Islet-1 oraz cholinoacetylotransferazy (ChAT). Nasz dwuetapowy protokół różnicowania stanowi wydajny sposób różnicowania komórek mES w rdzeniowe neurony ruchowe.

Opracowaliśmy nowy protokół w celu zwiększenia wydajności różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe in vitro. Zróżnicowane komórki ES nabyły cechy neuronów ruchowych, co potwierdzono poprzez wykazanie ekspresji markerów neuronalnych i neuronów ruchowych z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych.

Efektywna różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe

Bezpośrednia różnicowanie komórek macierzystych zarodkowych (ES) w funkcjonalne neurony ruchowe stanowi obiecujące narzędzie do badania mechanizmów chorób, przesiewowania...

Ogólnym celem tej procedury jest różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe. Najpierw należy hodować embrionalne komórki macierzyste myszy na pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy, uzupełniając pożywkę o czynnik hamujący białaczkę (leukemia inhibitory factor). Następnie procesy normalizacji należy wzmocnić poprzez dodanie noggin, bFGF oraz FGF8. Specyfikację neuronów ruchowych indukuje się poprzez inkubację z kwasem retinowym oraz agonistą receptora smoothened, po czym następuje wydłużanie aksonów i dojrzewanie neuronów ruchowych.Na koniec należy zastosować mikroskopię immunofluorescencyjną w celu zbadania zróżnicowanych komórek MES, które wykazują silną fluorescencję GFP. Generowanie dużych ilości neuronów ruchowych ułatwiło badania nad chorobami neuronów ruchowych w porównaniu z obecnymi protokołami. To podejście do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe jest bardziej wydajne. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat rdzeniowego zaniku mięśni.Metodę tę można zastosować również w innych chorobach neuronów ruchowych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne. Aby wysiać pierwotne embrionalne fibrobla

efficient-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-motor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skuteczne różnicowanie komórek macierzystych mysich zarodkowych w neurony ruchowe

Opisujemy protokół oparty na małych cząsteczkach służący do różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Protokół ten pozwala na wysokowydajne generowanie komórek OPC Olig2+NG2+ w ciągu 30 dni różnicowania. Opisujemy również metodę generowania „spiking” OPC, które są zdolne do generowania potencjałów czynnościowych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Ten film prezentuje metodę różnicowania nerwowych komórek progenitorowych rdzenia kręgowego (NPC) w neurony ruchowe. Szczegółowo opisuje proces hodowli NPC na powlekanej płytce hodowlanej przy użyciu specjalistycznych pożywek wzbogaconych specyficznymi inhibitorami, których celem jest ułatwienie różnicowania NPC w dojrzałe neurony ruchowe.

Różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych rdzenia kręgowego w neurony ruchowe

Ten film demonstruje technikę różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w połączoną w sieć populację neuronów z funkcjonującymi synapsami. Przedstawiono w nim etapy związane z różnicowaniem embrionalnych komórek macierzystych w neurony, indukcją tworzenia sieci neuronalnej i wzbogacaniem kultury w neurony połączone w sieć.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w populację neuronów połączonych w sieć

Ten film pokazuje proces różnicowania ludzkich iPSC w neurony ruchowe. Uzasadnienie obejmuje wykorzystanie iPSC, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji określonych czynników transkrypcyjnych. Po wyhodowaniu w pożywce zawierającej doksycyklinę, antybiotyk ten wyzwala ekspresję czynników transkrypcyjnych, promując w ten sposób różnicowanie iPSC w komórki progenitorowe neuronów ruchowych. Ostatecznie przodkowie są hodowani w pożywce neuronalnej, aby uzyskać dojrzałe i...

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne neurony ruchowe

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Ten protokół umożliwia szybką i efektywną konwersję indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony ruchowe o tożsamości rdzeniowej lub czaszkowej, poprzez ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych z indukowalnych wektorów piggyBac.

Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Poznaj protokół różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w neurony ruchowe. Ta metoda wykorzystuje czynniki wzrostu i kwas retinowy do generowania dużych ilości neuronów z markerami specyficznymi.

Efektywna różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe

Przeglądaj więcej filmów