Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w populację neuronów połączonych w sieć

Wysiewaj embrionalne komórki macierzyste myszy w naczyniu o niskim stopniu przylegania zawierającym pożywkę różnicującą.

Inkubuj pod rotacją, aby ułatwić agregację komórek i różnicowanie w linię neuronalną.

Przenieś agregaty do rurki i pozwól im osiąść grawitacyjnie. Wyrzuć nośnik.

Ponownie zawiesić i przenieść agregaty do oryginalnego naczynia zawierającego pożywki różnicujące uzupełnione kwasem retinowym.

Kwas retinowy indukuje ekspresję genów neuronalnych, wywołując różnicowanie w nerwowe komórki progenitorowe.

Przenieś kruszywa do rury. Usuń pożywkę i dodaj trypsynę, aby oddzielić agregaty.

Dodaj inhibitor, aby zneutralizować trypsynę.

Kilkakrotnie pipetować w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek. Przefiltrować zawiesinę, aby usunąć kruszywa.

Odwirować i usunąć supernatant. Ponownie zawieś komórki w pożywce.

Zasiej komórki na naczyniu pokrytym polimerem, aby ułatwić adhezję komórek.

Wyjmij nośnik. Dodaj świeże pożywki zawierające czynniki wzrostu, aby przyspieszyć dojrzewanie neuronów i utworzyć populację neuronów w sieci.

Różnicowanie ESC w neurony rozpoczyna się podczas rutynowego pasażu komórkowego. Oddziel ESC tak jak poprzednio, ale dołącz dodatkową płytkę do różnicowania neuronów. Przenieś 350 mikrolitrów zawiesiny komórek do 10-centymetrowego naczynia o niskim przyczepiu zawierającego 25 mililitrów pożywki różnicującej.

Umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 30 do 45 obr./min w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i inkubuj przez 48 godzin. Po 48 godzinach użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby przenieść agregacje komórek różnicujących się do 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Natychmiast po tym dodaj 25 mililitrów świeżej pożywki różnicującej do szalki Petriego. Pozwól agregatom osiąść przez dwie do pięciu minut, wytwarzając widoczną granulkę o głębokości od jednego do dwóch milimetrów. Ostrożnie zassać pożywkę, ignorując wszelkie pojedyncze komórki lub małe skupiska nadal w zawiesinie, i użyć pipety P1000, aby przenieść osad komórek z powrotem na szalkę Petriego. Włóż naczynie z powrotem do wytrząsarki obrotowej w inkubatorze. Po kolejnych 48 godzinach powtórz procedurę wymiany nośnika. Tym razem dodaj 30 mililitrów pożywki różnicującej uzupełnionej sześcioma mikromolowymi kwasami all-trans retinowymi.

Utworzony granulek będzie miał teraz od dwóch do czterech milimetrów głębokości. Po inkubacji komórek jak poprzednio, powtórz procedurę zmiany pożywki z suplementacją kwasu retinowego po raz ostatni. W tym momencie granulka będzie miała od czterech do ośmiu milimetrów głębokości.

Następnego dnia należy przygotować powierzchnie poszycia zgodnie z opisem w pisemnej części protokołu. Po południu w dniu posiewu rozmrozić po 5 mililitrów wstępnie podzielonego podłoża trypsynizacyjnego NPC i 0,1% inhibitora trypsyny sojowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów przenieś kruszywa różnicujące z płytki hodowlanej do 50-mililitrowej probówki stożkowej.

Pozwól agregatom osiąść przez trzy do pięciu minut, a następnie ostrożnie zassaj podłoże, nie naruszając osadu. Następnie umyj granulat 5 do 10 mililitrami PBS, a po osiadaniu agregatów odessaj PBS i powtórz mycie. Po drugim płukaniu PBS dodaj 5 mililitrów pożywki trypsynizacyjnej NPC do osadu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, delikatnie przesuwając probówkę dwa do trzech razy podczas inkubacji.

Następnie dodaj 5 mililitrów 0,1% inhibitora trypsyny sojowej do komórek i szybko wymieszaj przez odwrócenie. Następnie delikatnie rozcieraj komórki od 10 do 15 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety, aż do uzyskania stosunkowo jednorodnej zawiesiny komórek. Powoli przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 lub 70 mikronów umieszczone na 50-mililitrowej stożkowej probówce.

Następnie, po przefiltrowaniu całej zawiesiny, dodaj 1 mililitr pożywki N2 do filtra, aby przepłukać pozostałe komórki przez sitko. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj przez sześć minut w temperaturze 200 razy g.

Po zassaniu pożywki, bez naruszania osadu, rozcierać w 2 mililitrach pożywki N2, a następnie dodać pożywkę N2 do całkowitej objętości 10 mililitrów. Wirować przez pięć minut przy 200 razy g. Odessać pożywkę i powtórzyć proces mycia granulek, ponownie, ponownie zawieszając osad w 10 mililitrach pożywki N2.

Usuń podwielokrotność komórek i policz za pomocą hemocytometru, a następnie powtórz wirowanie. Zawiesić komórki w pożywce N2 do końcowego stężenia 1x razy^{10 7} komórek na mililitr i płytkować w gęstości od 150 000 do 200 000 komórek na centymetr kwadratowy w naczyniach przygotowanych w DIV minus 1 i umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Utrzymuj ESN-y zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnym protokole.