Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyjaśnienie sposobu wyizolowania komórek tworzących kolonie śródbłonka, czyli eCFC, z ludzkiej krwi pępowinowej. Osiąga się to poprzez najpierw wysianie komórek mononuklearnych z krwi pępowinowej, a następnie klonowanie i ekspansję przerostów kolonii eCFC. Drugim krokiem jest charakterystyka komórek in vitro z wykorzystaniem nowej techniki analizy pojedynczych komórek w celu oceny klonalnego potencjału proliferacyjnego.

Na koniec komórki są charakteryzowane w teście tworzenia naczyń in vivo poprzez produkcję i implantację żeli zawierających ECFC u myszy nod skid. Ostatecznie in vivo tworzenie nowych naczyń wypełnionych krwią gospodarza można ocenić za pomocą barwienia H&E implantów komórkowych zawierających ECFC. Główną zaletą tych technik nad istniejącymi metodami jest to, że pozwalają one na badanie potencjału proliferacyjnego komórek śródbłonka na poziomie pojedynczych komórek.

Zastosowanie tej techniki można rozszerzyć na poszukiwanie narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych w chorobach takich jak niedokrwienie kończyn dolnych lub PAD, ponieważ metoda ta pozwala na zbadanie potencjału proliferacyjnego i zdolności genicznych komórek śródbłonka pacjenta. Przed rozpoczęciem procedury do każdej studzienki sześciostudzienkowej płytki do hodowli tkanek należy dodać 1 mL kolagenu z ogona szczura typu I, a następnie inkubować płytkę przez noc; w dniu procedury krew pępowinową należy podzielić na alikwoty po 15 mL w 50 mL stożkowych probówkach wirówkowych. Następnie do każdej probówki należy dodać 20 mL PBS i kilkakrotnie pipetować mieszaninę w górę i w dół.

Następnie pobierz 15 mililitrów Ficoll-Paque do pipety, umieść końcówkę pipety na dnie probówki z rozcieńczoną krwią i ostrożnie nałóż warstwę. Wirowkuj probówki przez 30 minut przy 740 ×g w temperaturze pokojowej, z wyłączoną funkcją hamowania. Po rozdzieleniu komórek użyj pipety transferowej, aby usunąć mętną warstwę monocyto-limfocytów o niskiej gęstości, znajdującą się na styku Ficoll-Paque i rozcieńczonej plazmy. Przenieś zebrane komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów zawierającej 10 mililitrów pożywki EGM-2 i odwiruj monocyty przez 10 minut przy 515 ×g w temperaturze pokojowej z ustawieniem wysokiego hamowania, a następnie ostrożnie odessaj i odrzuć nadsącz.

Następnie, po dwukrotnym przemyciu osadu komórkowego w EGM two, resuspenduj komórki mononuklearne w EGM two do stężenia 1,25 × 10⁷ komórek/ml. Teraz pipetuj 4 ml zawiesiny komórek mononuklearnych do każdej studni płytki powlekanej kolagenem i inkubuj komórki do momentu utworzenia się kolonii w pierwszym dniu. Po inkubacji powoli usuń zużyte medium ze studni za pomocą pipety, uważając, aby nie zaburzyć słabo przytwierdzonych komórek.

Następnie ostrożnie dodaj cztery mililitry E GM two do dołków i wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora. Kolonie zazwyczaj pojawiają się między piątym a czternastym dniem, dzień przed procedurą. Do 50 µL kolagenu z ogona szczura.

Wlej do każdej studzienki płytki 96-dołkowej jedną jednostkę, tak jak wcześniej, i inkubuj płytkę przez noc w dniu przeprowadzenia procedury. Rozpocznij od dwukrotnego przemycia buforem PBS komórek, które zostały pasażowane jedynie dwa lub trzy razy. Po odessaniu ostatniej porcji PBS umieść wokół każdej kolonii sterylny cylinder do klonowania powlekany żelem, dociskając mocno każdy cylinder do płytki za pomocą sterylnej pęsety.

Do każdego cylindra do klonowania należy dodać od dwóch do trzech kropli ciepłego roztworu Triple E Express i inkubować cylindry od trzech do pięciu minut, aż komórki zaczną się odrywać. Po rozpoczęciu odrywania się komórek należy nalać do centrum cylindra około 250 µL pożywki EGM-2 i pipetować ciecz w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Następnie zawiesinę pojedynczych komórek z każdego cylindra do klonowania należy przenieść oddzielnie do osobnej probówki do mikrocentryfugi.

Zainfekuj komórki w płytce sześciodołkowej lentiwirusami wykazującymi ekspresję EGFP i wyizoluj komórki wykazujące ekspresję EGFP za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie inkubuj komórki dodatnie pod kątem EGFP w pożywce EGM-2 w płytkach powlekanych kolagenem. Po przygotowaniu E-CFCs, zbierz je, używając TrypLE Express zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie resuspenduj komórki w pożywce EGM-2 do końcowego stężenia wynoszącego około 10⁶ komórek/ml.

Następnie, używając sortera przepływowego z niską prędkością przepływu wynoszącą 20 komórek na sekundę, wyselekcjonuj jedną pojedynczą komórkę ECFC wykazującą ekspresję EGP do każdej studzienki wcześniej przygotowanej 96-dołkowej płytki pokrytej kolagenem; dostosuj końcową objętość każdej studzienki za pomocą EGM two do około 200 µL na studzienkę. Następnie użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że w każdej studnience znajduje się tylko jedna komórka. Inkubuj płytkę przez okres dwóch tygodni, wykonując dwie wymiany pożywki w 14. dniu hodowli.

Każdy dołek należy przemyć 100 µL PBS przed utrwaleniem komórek za pomocą 100 µL 4% paraformaldehydu przez 30 minut. W przypadku CFC niewykazujących ekspresji EGFP, po utrwaleniu paraformaldehydem należy dodać odczyn cyt, zielony fluorescencyjny barwnik jądrowy, i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego należy wizualnie określić liczbę rozprzestrzenionych komórek śródbłonka; zgodnie z przedstawionym schematem, dołki zawierające od 2 do 50 komórek śródbłonka uznaje się za skupiska komórek śródbłonka.

Studnie zawierające od 51 do 2000 komórek uznaje się za eCFC o niskim potencjale proliferacyjnym, natomiast studnie z 2001 lub więcej komórkami uznaje się za eCFC o wysokim potencjale proliferacyjnym. Po odłączeniu komórek za pomocą Triple E Express, jak wcześniej, należy oznaczyć liczbę żywych komórek w kulturze za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Przenieś 2,4 miliona żywych komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie odwiruj komórki w wirówce w celu uzyskania osadu komórkowego.

Dokładnie wymieszać składniki macierzy żelowej, a następnie dostosować pH do 7,4 za pomocą wodorotlenku sodu, utrzymując roztwór w lodzie. Po odlaniu nadsączu zawiesić osad w 360 µL ciepłego e GM two. Następnie dodać 840 µL roztworu macierzy żelowej do komórek i ostrożnie mieszać, aż komórki zostaną całkowicie zawieszone w żelu. Przenieść tę 1 mL zawiesinę żelu z komórkami do jednej studni 12-studzienkowej płytki hodowlanej i inkubować płytkę do czasu polimeryzacji żelu.

Następnie, przed inkubacją przez noc, ostrożnie pokryj żel dwiema mililitrami ciepłego medium EGM-2; następnego dnia, bezpośrednio przed implantacją, użyj nożyczek irydowych, aby podzielić żel na dwa równe kawałki i przenieś je z powrotem do tej samej studni hodowlanej zawierającej medium EGM-2. Po potwierdzeniu sedacji za pomocą ucisku palca u stopy, ogol dolną część brzucha znieczulonej myszy nude (w wieku od pięciu do sześciu tygodni) i dokładnie oczyść miejsce operacyjne, używając wacików z alkoholem i betadyną.

Następnie, używając sterylnych ostrych nożyczek irydowych, wykonaj nacięcie o długości około pięciu milimetrów w dolnej ćwiartce brzucha, odsłaniając przestrzeń podskórną między skórą a mięśniami brzucha. Rozdziel tępo warstwę skóry od mięśni brzucha w dwóch różnych obszarach brzucha, aby stworzyć kieszenie o szerokości od 15 do 20 milimetrów – jedną prowadzącą górnie w stronę górnej ćwiartki brzucha, a drugą w inny obszar brzucha. Następnie unieś warstwę skóry bezpośrednio przy nacięciu.

Wprowadź jedną połowę żelu do jednej kieszeni brzusznej, a drugą połowę żelu do drugiej kieszeni brzusznej. Po wprowadzeniu żelu zamknij każde nacięcie dwoma lub trzema szwami, używając nici polipropylenowych 5-0 na igle tnącej. Opisz karty klatek, a następnie przeprowadź monitorowanie pooperacyjne i podawaj leki przeciwbólowe zgodnie z wymogami instytucji i protokołu.

Po uśmierceniu zwierzęcia w 14. dniu po implantacji, przemyj brzuch myszy wacikami nasączonymi alkoholem i przetnij skórę wzdłuż linii pierwotnego nacięcia. Następnie wytnij płaty skóry w miejscach prawdopodobnego rozmieszczenia żeli. Wykonaj nacięcia okrężne wokół żeli, aby usunąć każdy implant, a następnie umieść wycięte implanty w utrwalaczu cynkowym.

Stosując tę technikę hodowli ECFC, zaobserwowaliśmy wzrost pierwotnych kolonii już w piątym dniu. Należy zwrócić uwagę na morfologię brukową tych pięciodniowych kultur ECFC, wskazaną przez groty strzałek. Powiększone kolonie wykazują ekspresję antygenów śródbłonkowych, ale nie wykazują ekspresji antygenów hematopoetycznych.

Jak pokazano w tej reprezentatywnej ocenie fenotypowej in vitro komórek śródbłonka i hematopoetycznych, immunofenotypowanie wykazało, że e CFCs wykazują ekspresję antygenów śródbłonkowych, takich jak CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four oraz NRP two, lecz nie wykazują ekspresji antygenów hematopoetycznych, takich jak CD 45, CD 14, CD 11, BC Kit, CXCR four czy CD 1 33. Co ważne, jak przedstawiono na tym wykresie słupkowym, rozszerzone kolonie wykazują pełną hierarchię klonalnego potencjału proliferacyjnego na poziomie pojedynczych komórek, obejmującą grupy od 2 do 50 komórek, aż po kolonie liczące ponad 200. Te mikrografie kolonii barwionych cyt, zielonym fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym, uzyskano po hodowli e CFCs pochodzących z krwi pępowinowej na poziomie pojedynczych komórek przez 14 dni.

Ponadto ECFC tworzą zhumanizowane naczynia krwionośne, które po implantacji do myszy z niedoborem odporności są ukrwione krwinkami czerwonymi gospodarza. Na tym barwieniu H&E implantów z żelu CELLULARIZE zawierających ECFC pochodzące z krwi pępowinowej widoczne są mikronaczynia wypełnione krwinkami czerwonymi gospodarza, które utworzyły się w żelu kolagenowo-fibronektynowym po 14 dniach od implantacji. Tutaj barwienie anty-ludzkim CD 31 w kolorze brązowym dodatkowo potwierdza ludzkie pochodzenie tych naczyń.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować ECFC z krwi pępowinowej człowieka oraz jak klonować, namnażać i charakteryzować funkcjonalność kolonii ECFC po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom śródbłonka naczyniowego do zbadania potencjału klonalnej proliferacji oraz zdolności genetycznych komórek śródbłonka pochodzących z wielu źródeł.