Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek tworzących kolonie śródbłonka pochodzących z ludzkiej krwi pępowinowej

Ogólnym celem tej procedury jest wyjaśnienie, w jaki sposób uzyskać komórki tworzące kolonie śródbłonka lub e CFC z ludzkiej krwi pępowinowej. Osiąga się to najpierw poprzez posiew komórek jednojądrzastych z krwi pępowinowej, a następnie klonowanie i rozszerzanie wyrostków kolonii E CFC. Drugim krokiem jest scharakteryzowanie komórek in vitro przy użyciu nowatorskiej techniki oznaczania potencjału proliferacyjnego klonów.

Na koniec komórki są charakteryzowane w teście tworzenia naczyń in vivo poprzez produkcję i implantację żeli zawierających E CFC u myszy z poślizgiem nodowym. Ostatecznie, tworzenie in vivo naczyń krwionośnych de novo gospodarza można ocenić za pomocą barwienia h i e ECFC zawierających implanty komórkowe. Główną przewagą tych technik nad istniejącymi metodami jest to, że metody te pozwalają na badanie potencjału proliferacyjnego komórek śródbłonka na poziomie pojedynczej komórki.

Implikacje tej techniki można rozszerzyć w kierunku znalezienia narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych dla chorób takich jak dzika choroba tętnic lub PAD, ponieważ technika ta pozwala nam zbadać potencjał proliferacyjny i zdolność genową komórek śródbłonka pacjenta. Przed rozpoczęciem zabiegu dodaj jeden mililitr kolagenu z ogona szczura, wpisz po jednym do każdej studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej, a następnie inkubuj płytkę przez noc w dniu zabiegu, podwielokrotność krwi pępowinowej w 15 mililitrowych jednostkach do 50-mililitrowych stożkowych probówek wirówkowych. Następnie dodaj 20 mililitrów PBS do każdej probówki i kilkakrotnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół.

Następnie pobrać 15 mililitrów fial PA do pipety, umieścić końcówkę pipety na dnie probówki z rozcieńczoną krwią i ostrożnie podłożyć probówki alpac, odwirować probówki przez 30 minut w temperaturze 740 razy G w temperaturze pokojowej bez ustawienia hamulca zwalniającego. Po rozdzieleniu komórek użyj pipety transferowej, aby usunąć zamgloną warstwę komórek jednojądrzastych o niskiej gęstości znajdujących się na granicy faz między pikiem fiala a rozcieńczonym osoczem. Dozować zebrane komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 10 mililitrów dwu pożywki E GM i osadzać komórki jednojądrzaste przez 10 minut w temperaturze 515 razy G w temperaturze pokojowej z wysokim ustawieniem hamulca opóźniającego, ostrożnie zassać i wyrzucić supernatant.

Następnie po przemyciu granulowanych komórek dwukrotnym EGM dwa resus, zawieś je komórki jednojądrzaste w EGM dwa w ilości 1,25 razy 10 do siódmych komórek na mililitr. Teraz odpipetuj cztery mililitry zawiesiny komórek jednojądrzastych do każdej studzienki płytki pokrytej kolagenem i inkubuj komórki, aż utworzą się kolonie pierwszego dnia. Po inkubacji powoli wyjmij zużytą pożywkę z dołków za pomocą pipety, nie naruszając luźno przylegających komórek.

Następnie ostrożnie dodaj cztery mililitry E GM dwa do studzienek i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. Kolonie pojawiają się zazwyczaj między piątym a czternastym dniem poprzedzającym zabieg. Na 50 mikrolitrów kolagenu z ogona szczura.

Wpisz po jednym do każdego dołka na 96-dołkowej płytce, tak jak poprzednio, i inkubuj płytkę przez noc w dniu zabiegu. Zacznij od umycia komórek, które przeszły tylko dwa do trzech razy dwa razy za pomocą PBS. Po zassaniu końcowego przemywania PBS należy umieścić sterylny cylinder klonujący pokryty żelem wokół każdej kolonii, mocno dociskając każdy cylinder do płytki za pomocą sterylnych kleszczyków.

Dodaj dwie do trzech kropli ciepłego potrójnego ekspresu E do każdego cylindra klonującego i inkubuj cylindry przez trzy do pięciu minut, aż komórki zaczną się odłączać. Po tym, jak komórki zaczną się odłączać przy około 250 mikrolitrach EGM, dwie pożywki do środka cylindra i pipety w górę iw dół, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Teraz przenieś zawiesinę jednokomórkową z każdego cylindra klonującego osobno do pojedynczej probówki mikrowirówkowej.

Zainfekuj komórki w sześciodołkowej płytce lentiwirusami wykazującymi ekspresję EGFP i zbierz komórki wyrażające EGFP za pomocą cytometrii fluorescencyjnej. Następnie inkubuj komórki dodatnie EEG FP i EGM dwa w płytkach pokrytych kolagenem. Gdy E CFC są gotowe, zbierz je za pomocą ekspresu E wycieczki, jak właśnie pokazano, i ponownie zawiesić komórki i e GM dwie pożywki do końcowego stężenia około 10 do szóstych komórek na mililitr.

Następnie, za pomocą sortownika przepływowego o niskim natężeniu przepływu wynoszącym 20 komórek na sekundę, sortuj jeden pojedynczy ECFC z dodatnim wynikiem EGP na studzienkę do wcześniej przygotowanej 96-dołkowej płytki pokrytej kolagenem, dostosuj końcową objętość każdej studzienki za pomocą EGM dwa do około 200 mikrolitrów na studzienkę. Następnie użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że każda studzienka zawiera tylko jedną komórkę. Inkubować płytkę przez okres dwóch tygodni z dwiema zmianami pożywki w 14 dniu hodowli.

Umyj każdą studzienkę 100 mikrolitrami PBS przed utrwaleniem komórek 100 mikrolitrami 4% aldehydu paraform przez 30 minut. W przypadku eCFC, które nie wykazują ekspresji EGFP, dodać odczynnik cyt, zielony fluorescencyjny barwnik jądrowy po utrwaleniu para formaldehydu i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby w widoczny sposób określić ilościowo liczbę rozszerzonych komórek śródbłonka, jak pokazano tutaj, studzienki o liczbie komórek śródbłonka od dwóch do 50 są uważane za klastry komórek śródbłonka.

Studzienki z 51 do 2000 komórek mają niski potencjał proliferacyjny e CFC, a studzienki z 2001 lub więcej są uważane za eCFC o wysokim potencjale proliferacyjnym. Po odłączeniu komórek z potrójną ekspresją E jak poprzednio, uzyskaj żywotną liczbę komórek w hodowli komórkowej za pomocą hemo, cytometru i błękitu trianowego. Przenieś 2,4 miliona żywych komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, a następnie granuluj komórki przez odwirowanie, podczas gdy komórki są wirowane.

Dokładnie wymieszać składniki matrycy żelowej, a następnie dostosować pH do 7,4 za pomocą wodorotlenku sodu, utrzymując roztwór na lodzie. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 360 mikrolitrach ciepłego e GM dwa. Następnie dodaj 840 mikrolitrów roztworu matrycy żelowej do komórek i ostrożnie wymieszaj roztwór, aż komórki zostaną dokładnie zawieszone w żelu Przenieś tę jednomililitrową zawiesinę żelu komórkowego do jednego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubuj płytkę, aż żel ulegnie polimeryzacji.

Następnie przed inkubacją przez noc delikatnie przykryj żel dwoma mililitrami ciepłego EGM dwa następnego dnia i bezpośrednio przed implantacją. Użyj nożyczek do tęczówki, aby rozciąć żel na dwie równe części i włóż kawałki żelu do tej samej studni hodowlanej zawierającej pożywkę GM dwa. Po potwierdzeniu sedacji przez uszczypnięcie palca u nogi, ogol dolną część brzucha znieczulonego pięcio- do sześciotygodniowego znieczulonego kiwnięcia, poślizgnij mysz i dokładnie oczyść miejsce operowane, obracając podkładki nasączone alkoholem i betadyną.

Następnie użyj sterylnych, ostrych nożyczek do tęczówki, aby wykonać około pięciomilimetrowe nacięcie w dolnej ćwiartce brzucha, odsłaniając podskórną przestrzeń między skórą a mięśniem brzucha. . Wypreparuj warstwę skórną z mięśnia brzucha w dwóch różnych obszarach brzucha, aby utworzyć kieszenie o szerokości od 15 do 20 milimetrów, jedną prowadzącą powyżej górnej części kwadrantu brzucha, a drugą do innego obszaru brzucha. Następnie unosząc warstwę skórną, po prostu rozpieszczaj do nacięcia.

Włożyć jedną połówkę żelu do jednej kieszeni brzusznej, a drugą połowę do drugiej kieszeni brzusznej. Po wprowadzeniu żeli zamknij każde nacięcie dwoma lub trzema szwami za pomocą pięciu szwów polipropylenowych na igle tnącej. Oznacz karty klatki i wykonaj monitorowanie pooperacyjne i analgezję zgodnie z wymaganiami instytucjonalnymi i protokołem.

Po złożeniu zwierzęcia w ofierze w 14 dniu po implantacji, przetrzyj brzuch myszy wacikami nasączonymi alkoholem i przetnij skórę rozpieszczoną do pierwotnej linii nacięcia. Następnie wycięte płaty skóry rozpieszczały się do prawdopodobnej lokalizacji żeli. Nacina obwodowo wokół żeli, aby usunąć każdy implant, a następnie umieszcza wycięte implanty w utrwalaczu cynkowym.

Korzystając z tej techniki wyprowadzania ECFC, zaobserwowaliśmy wzrost pierwotnego tworzenia kolonii już w piątym dniu. Zwróć uwagę na morfologię bruku tych pięciu kultur ECFC, jak wskazują groty strzałek. Rozszerzone kolonie wyrażają antygeny śródbłonka, ale nie wyrażają antygenów krwiotwórczych.

Jak wykazano w tej reprezentatywnej ocenie fenotypowej in vitro komórek śródbłonka i komórek krwiotwórczych, immunofenotypowanie ujawniło, że e CFC wyrażają antygeny śródbłonka, takie jak CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL jeden, flick jeden, odwrócony czwarty i NRP dwa, ale nie wyrażają antygenów krwiotwórczych, CD 45 CD 14, CD 11 BC Kit CXCR 4 lub CD 1 33. Co ważne, jak pokazano na tym wykresie słupkowym, rozszerzone kolonie wykazują pełną hierarchię klonalnego potencjału proliferacyjnego na poziomie pojedynczej komórki, która waha się od klastrów od dwóch do 50 komórek do kolonii większych niż 2001. Te mikrofotografie kolonii barwionych cyt, zielonym fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym, uzyskano po hodowli E CFC pochodzących z krwi pępowinowej na poziomie pojedynczej komórki przez 14 dni.

Co więcej, e CFC tworzą humanizowane naczynia krwionośne, które są perfundowane czerwonymi krwinkami gospodarza po wszczepieniu myszom z niedoborem odporności. W tym barwieniu krwi pępowinowej ECFC zawierającego implanty żelowe CELLULARIZE można zaobserwować mikronaczynia wypełnione czerwonymi krwinkami gospodarza, które utworzyły się w kolagenowym żelu fibronektyny po 14 dniach od implantacji. W tym przypadku anty-ludzkie zabarwienie CD 31 na brązowo dodatkowo potwierdza ludzkie pochodzenie tych naczyń.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać e CFC z ludzkiej krwi pępowinowej oraz jak klonować, rozszerzać i charakteryzować funkcjonalność kolonii ECFC po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się śródbłonkiem naczyniowym do zbadania potencjału proliferacyjnego klonów śródbłonka i zdolności genowej komórek śródbłonka, które są pozyskiwane z wielu źródeł.