Name: Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek tworzących kolonie śródbłonka pochodzących z ludzkiej krwi pępowinowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Poznaj izolację i charakteryzację komórek tworzących kolonie śródbłonka z krwi pępowinowej. Metoda obejmuje hodowlę jednokomórkową oraz ocenę tworzenia naczyń in vivo w modelu mysim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Yoder jest konsultantem w firmie EndGenitor Technologies, Inc. oraz członkiem zarządu firmy Rimedion Technologies, Inc.

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li>
<li>Urbich, C., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+characterization+and+role+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology.</a> Circ. Res. 95, 343-353 (2004).</li>
<li>Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+and+defining+cells+to+engineer+human+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Prolif%22%5BJournal%5D)">Isolating and defining cells to engineer human blood vessels.</a> Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).</li>
<li>Matthias, M., David, N., Josef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+bedside%3A+what+physicians+need+to+know+about+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells.</a> Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105, 2783-276 (2005).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Animal+Serum+Free+Expansion+of+Human+Umbilical+Cord+Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+%28MSCs%29+and+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells+%28ECFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs.</a> J. Vis. Exp. (32), e1525(2009).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-135 (2008).</li>
<li>Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+physical+properties+modulate+endothelial+colony+forming+cell-derived+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo.</a> Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ. Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Large+Scale+Expansion+of+Adult+Human+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1524(2009).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Witting, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Large+Volume+Lentiviral+Vector+Production+Using+Flow+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation.</a> Hum. Gene. Ther. , (2011).</li>
<li>Yoon, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+neovascularization+by+mixed+transplantation+of+early+endothelial+progenitor+cells+and+late+outgrowth+endothelial+cells%3A+the+role+of+angiogenic+cytokines+and+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases.</a> Circulation. , 112-1618 (2005).</li>
<li>Dubois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+progenitor+cell+populations+on+left+ventricular+remodeling+and+myocardial+neovascularization+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).</li>
<li>Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+endothelial+cells%3A+characterization+and+their+potential+for+reversing+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna domniemanych komórek progenitorowych śródbłonka jest istotna dla zidentyfikowania bona fide ECFC, które są zdolne do klonalnego i seryjnego przesiewania w kulturze oraz do tworzenia trwałych i funkcjonalnych naczyń krwionośnych możliwych do implantacji in vivo. Krew z pępowiny człowieka jest bogata w ECFC, a stężenie tych krążących komórek spada wraz z wiekiem lub w przebiegu chorób10. Niedawne badania sugerują, że ECFC mogą odgrywać ważną rolę w napr...

<table><tbody><tr><td>Wstrzyknięcie heparyny sodowej, USP</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>504031</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Amersham</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula mieszająca</td><td>Maersk Medical</td><td>500.11.012</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Zdefiniowana FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12605</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I szczura</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Blokada FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>hCD31, koniugowany z FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555445</td><td></td></tr><tr><td>hCD45, sprzężone z FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>hCD14, sprzężone z FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555397</td><td></td></tr><tr><td>hCD144, koniugowany z PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1449-80</td><td></td></tr><tr><td>hCD146, sprzężony z PE</td><td>BD Biosciences</td><td>550315</td><td></td></tr><tr><td>hCD105, koniugowany z PE</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD10504</td><td></td></tr><tr><td>Ksiądz IgG (Ms IgG)&lt;sub&gt;1,k&lt;/sub&gt; przeciwciało koniugowane z FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>mysia IgG&lt;sub&gt;1,k&lt;/sub&gt; przeciwciało sprzężone z PE</td><td>BD Biosciences</td><td>559320</td><td></td></tr><tr><td>anty-IgG mysie&lt;sub&gt;2a,k&lt;/sub&gt; przeciwciało sprzężone z FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555573</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD31</td><td>Dako</td><td>klon JC70/A</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko mysiemu CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>0.22-&amp;mu;system filtracji próżniowej m</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty, 17,4 N</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-środek przeciwgrzybiczy</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Fiksatywa cynkowa do IHC</td><td>BD Biosciences</td><td>550523</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Sytox Green</td><td>Invitrogen</td><td>S33025</td><td></td></tr><tr><td>Cylindry do klonowania, sterylne</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-907-10</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

W literaturze niedawno przeanalizowano utrwalone poglądy na temat powstawania nowych naczyń krwionośnych poprzez angiogenezę, waskulogenezę i arteriogenezę1. Obecność krążących komórek progenitorowych śródbłonka (EPCs) w obwodowej krwi ludzi dorosłych została po raz pierwszy zidentyfikowana przez Asaharę et al. w 1997 roku 2, co zapoczątkowało szereg nowych hipotez i strategii w zakresie regeneracji i naprawy naczyń. EPCs to rzadkie, lecz normalne składniki krążącej krwi, które migrują do miejsc powstawania naczyń krwionośnych lub przebudowy naczyniowej i wspomagają postnatalną waskulogenezę, angiogenezę lub arteriogenezę, głównie poprzez stymulację paracrynną komórek pochodzących ze ścian istniejących naczyń3. Nie zidentyfikowano specyficznego markera pozwalającego rozpoznać pojedynczą komórkę EPC, a obecny stan wiedzy wskazuje, że w stymulację procesu angiogenezy w różnych modelach zwierzęcych przedklinicznych oraz u ludzi w wielu stanach chorobowych zaangażowanych jest wiele typów komórek, w tym proangiogenne hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe, krążące komórki angiogenne, monocyty Tie2+, mieloidalne komórki progenitorowe, makrofagi związane z nowotworem oraz makrofagi aktywowane do fenotypu M24, 5. Komórki tworzące kolonie śródbłonka (ECFCs) to rzadkie, krążące, żywe komórki śródbłonka, które charakteryzują się silnym potencjałem do proliferacji klonalnej, zdolnością do tworzenia wtórnych i trzeciorzędnych kolonii po przesiewaniu oraz zdolnością do tworzenia wewnątrzpochodnych naczyń in vivo po transplantacji do myszy z niedoborem odporności6-8. Choć ECFCs zostały z sukcesem wyizolowane z krwi obwodowej zdrowych dorosłych, krwi pępowinowej (CB) zdrowych noworodków oraz ze ścian wielu ludzkich naczyń tętniczych i żylnych 6-9, krew pępowinowa wykazuje najwyższą częstotliwość występowania ECFCs7, które wykazują najsilniejszy potencjał do proliferacji klonalnej i tworzą trwałe oraz funkcjonalne naczynia krwionośne in vivo8, 10-13. Mimo że przedstawiono metody pozyskiwania ECFC z krwi obwodowej dorosłych14, 15, w niniejszej pracy opisujemy metodologię pozyskiwania, klonowania, ekspansji oraz charakterystyki in vitro i in vivo ECFCs z ludzkiej krwi pępowinowej (CB).

Komórki endotelialne tworzące kolonie (ECFCs) to krążące komórki endotelialne o silnym potencjale proliferacyjnym klonalnym, które wykazują wrodzone in vivo zdolność do tworzenia naczyń. Fenotypowa i funkcjonalna charakterystyka komórek śródbłonka wyhodowanych z krwi pępowinowej jest istotna dla ich identyfikacji i izolacji bona fide ECFCy do potencjalnych zastosowań klinicznych w naprawie uszkodzonych tkanek.

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

Wieloletnie koncepcje powstawania nowych naczyń krwionośnych poprzez angiogenezę, waskulogenezę i arteriogenezę zostały niedawno poddane przeglądowi1. Obecność...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyjaśnienie sposobu wyizolowania komórek tworzących kolonie śródbłonka, czyli eCFC, z ludzkiej krwi pępowinowej. Osiąga się to poprzez najpierw wysianie komórek mononuklearnych z krwi pępowinowej, a następnie klonowanie i ekspansję przerostów kolonii eCFC. Drugim krokiem jest charakterystyka komórek in vitro z wykorzystaniem nowej techniki analizy pojedynczych komórek w celu oceny klonalnego potencjału proliferacyjnego.Na koniec komórki są charakteryzowane w teście tworzenia naczyń in vivo poprzez produkcję i implantację żeli zawierających ECFC u myszy nod skid. Ostatecznie in vivo tworzenie nowych naczyń wypełnionych krwią gospodarza można ocenić za pomocą barwienia H&E implantów komórkowych zawierających ECFC. Główną zaletą tych technik nad istniejącymi metodami jest to, że pozwalają one na badanie potencjału proliferacyjnego komórek śródbłonka na poziomie pojedynczych komórek.Zastosowanie tej techniki można rozszerzyć na poszukiwanie narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych w chorobach takich jak niedokrwienie kończyn dolnych lub PAD, ponieważ metoda ta pozwala na zbadanie potencjału proliferacyjnego i zdolności genicznych komórek śródbłonka pacjenta. Przed rozpoczęciem procedury do każdej studzienki sześciostudzienkowej płytki do hodowli tkanek należy dodać 1 mL kolagenu z ogona szczura typu I, a następnie inkubować płytkę przez noc; w dniu procedury krew pępowinową należy podzielić na alikwoty po 15 mL w 50 mL stożkowych probówkach wirówkowych. Następnie do każdej probówki należy dodać 20 mL PBS i kilkakrotnie pipetować mieszaninę w górę i w dół.Następnie pobierz 15 mililitrów Ficoll-Paque do pipety, umieść końcówkę pipety na dnie probówki z rozcieńczoną krwią i ostrożnie nałóż warstwę. Wirowkuj probówki przez 30 minut przy 740 ×g w temperaturze pokojowej, z wyłączoną funkcją hamowania. Po rozdzieleniu komórek użyj pipety transferowej, aby usunąć mętną warstwę monocyto-limfocytów o niskiej gęstości, znajdującą się na styku Ficoll-Paque i rozcieńczonej plazmy. Przenieś zebrane komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów zawierającej 10 mililitrów pożywki EGM-2 i odwiruj monocyty przez 10 minut przy 515 ×g w temperaturze pokojowej z ustawieniem wysokiego hamowania, a następnie ostrożnie odessaj i odrzuć nadsącz.Następnie, po dwukrotnym przemyciu osadu komórkowego w EGM two, resuspenduj komórki mononuklearne w EGM two do stężenia 1,25 × 10⁷ komórek/ml. Teraz pipetuj 4 ml zawiesiny komórek mononuklearnych do każdej studni płytki powlekanej kolagenem i inkubuj komórki do momentu utworzenia się kolonii w pierwszym dniu. Po inkubacji powoli usuń zużyte medium ze studni za pomocą pipety, uważając, aby nie zaburzyć słabo przytwierdzonych komórek.Następnie ostrożnie dodaj cztery mililitry E GM two do dołków i wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora. Kolonie zazwyczaj pojawiają się między piątym a czternastym dniem, dzień przed procedurą. Do 50 µL kolagenu z ogona szczura.Wlej do każdej studzienki płytki 96-dołkowej jedną jednostkę, tak jak wcześniej, i inkubuj płytkę przez noc w dniu przeprowadzenia procedury. Rozpocznij od dwukrotnego przemycia buforem PBS komórek, które zostały pasażowane jedynie dwa lub trzy razy. Po odessaniu ostatniej porcji PBS umieść wokół każdej kolonii sterylny cylinder do klonowania powlekany żelem, dociskając mocno każdy cylinder do płytki za pomocą sterylnej pęsety.Do każdego cylindra do klonowania należy dodać od dwóch do trzech kropli ciepłego roztworu Triple E Express i inkubować cylindry od trzech do pięciu minut, aż komórki zaczną się odrywać. Po rozpoczęciu odrywania się komórek należy nalać do centrum cylindra około 250 µL pożywki EGM-2 i pipetować ciecz w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Następnie zawiesinę pojedynczych komórek z każdego cylindra do klonowania należy przenieść oddzielnie do osobnej probówki do mikrocentryfugi.Zainfekuj komórki w płytce sześciodołkowej lentiwirusami wykazującymi ekspresję EGFP i wyizoluj komórki wykazujące ekspresję EGFP za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie inkubuj komórki dodatnie pod kątem EGFP w pożywce EGM-2 w płytkach powlekanych kolagenem. Po przygotowaniu E-CFCs, zbierz je, używając TrypLE Express zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie resuspenduj komórki w pożywce EGM-2 do końcowego stężenia wynoszącego około 10⁶ komórek/ml.Następnie, używając sortera przepływowego z niską prędkością przepływu wynoszącą 20 komórek na sekundę, wyselekcjonuj jedną pojedynczą komórkę ECFC wykazującą ekspresję EGP do każdej studzienki wcześniej przygotowanej 96-dołkowej płytki pokrytej kolagenem; dostosuj końcową objętość każdej studzienki za pomocą EGM two do około 200 µL na studzienkę. Następnie użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że w każdej studnience znajduje się tylko jedna komórka. Inkubuj płytkę przez okres dwóch tygodni, wykonując dwie wymiany pożywki w 14. dniu hodowli.Każdy dołek należy przemyć 100 µL PBS przed utrwaleniem komórek za pomocą 100 µL 4% paraformaldehydu przez 30 minut. W przypadku CFC niewykazujących ekspresji EGFP, po utrwaleniu paraformaldehydem należy dodać odczyn cyt, zielony fluorescencyjny barwnik jądrowy, i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego należy wizualnie określić liczbę rozprzestrzenionych komórek śródbłonka; zgodnie z przedstawionym schematem, dołki zawierające od 2 do 50 komórek śródbłonka uznaje się za skupiska komórek śródbłonka.Studnie zawierające od 51 do 2000 komórek uznaje się za eCFC o niskim potencjale proliferacyjnym, natomiast studnie z 2001 lub więcej komórkami uznaje się za eCFC o wysokim potencjale proliferacyjnym. Po odłączeniu komórek za pomocą Triple E Express, jak wcześniej, należy oznaczyć liczbę żywych komórek w kulturze za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Przenieś 2,4 miliona żywych komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie odwiruj komórki w wirówce w celu uzyskania osadu komórkowego.Dokładnie wymieszać składniki macierzy żelowej, a następnie dostosować pH do 7,4 za pomocą wodorotlenku sodu, utrzymując roztwór w lodzie. Po odlaniu nadsączu zawiesić osad w 360 µL ciepłego e GM two. Następnie dodać 840 µL roztworu macierzy żelowej do komórek i ostrożnie mieszać, aż komórki zostaną całkowicie zawieszone w żelu. Przenieść tę 1 mL zawiesinę żelu z komórkami do jednej studni 12-studzienkowej płytki hodowlanej i inkubować płytkę do czasu polimeryzacji żelu.Następnie, przed inkubacją przez noc, ostrożnie pokryj żel dwiema mililitrami ciepłego medium EGM-2; następnego dnia, bezpośrednio przed implantacją, użyj nożyczek irydowych, aby podzielić żel na dwa równe kawałki i przenieś je z powrotem do tej samej studni hodowlanej zawierającej medium EGM-2. Po potwierdzeniu sedacji za pomocą ucisku palca u stopy, ogol dolną część brzucha znieczulonej myszy nude (w wieku od pięciu do sześciu tygodni) i dokładnie oczyść miejsce operacyjne, używając wacików z alkoholem i betadyną.Następnie, używając sterylnych ostrych nożyczek irydowych, wykonaj nacięcie o długości około pięciu milimetrów w dolnej ćwiartce brzucha, odsłaniając przestrzeń podskórną między skórą a mięśniami brzucha. Rozdziel tępo warstwę skóry od mięśni brzucha w dwóch różnych obszarach brzucha, aby stworzyć kieszenie o szerokości od 15 do 20 milimetrów – jedną prowadzącą górnie w stronę górnej ćwiartki brzucha, a drugą w inny obszar brzucha. Następnie unieś warstwę skóry bezpośrednio przy nacięciu.Wprowadź jedną połowę żelu do jednej kieszeni brzusznej, a drugą połowę żelu do drugiej kieszeni brzusznej. Po wprowadzeniu żelu zamknij każde nacięcie dwoma lub trzema szwami, używając nici polipropylenowych 5-0 na igle tnącej. Opisz karty klatek, a następnie przeprowadź monitorowanie pooperacyjne i podawaj leki przeciwbólowe zgodnie z wymogami instytucji i protokołu.Po uśmierceniu zwierzęcia w 14. dniu po implantacji, przemyj brzuch myszy wacikami nasączonymi alkoholem i przetnij skórę wzdłuż linii pierwotnego nacięcia. Następnie wytnij płaty skóry w miejscach prawdopodobnego rozmieszczenia żeli. Wykonaj nacięcia okrężne wokół żeli, aby usunąć każdy implant, a następnie umieść wycięte implanty w utrwalaczu cynkowym.Stosując tę technikę hodowli ECFC, zaobserwowaliśmy wzrost pierwotnych kolonii już w piątym dniu. Należy zwrócić uwagę na morfologię brukową tych pięciodniowych kultur ECFC, wskazaną przez groty strzałek. Powiększone kolonie wykazują ekspresję antygenów śródbłonkowych, ale nie wykazują ekspresji antygenów hematopoetycznych.Jak pokazano w tej reprezentatywnej ocenie fenotypowej in vitro komórek śródbłonka i hematopoetycznych, immunofenotypowanie wykazało, że e CFCs wykazują ekspresję antygenów śródbłonkowych, takich jak CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four oraz NRP two, lecz nie wykazują ekspresji antygenów hematopoetycznych, takich jak CD 45, CD 14, CD 11, BC Kit, CXCR four czy CD 1 33. Co ważne, jak przedstawiono na tym wykresie słupkowym, rozszerzone kolonie wykazują pełną hierarchię klonalnego potencjału proliferacyjnego na poziomie pojedynczych komórek, obejmującą grupy od 2 do 50 komórek, aż po kolonie liczące ponad 200. Te mikrografie kolonii barwionych cyt, zielonym fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym, uzyskano po hodowli e CFCs pochodzących z krwi pępowinowej na poziomie pojedynczych komórek przez 14 dni.Ponadto ECFC tworzą zhumanizowane naczynia krwionośne, które po implantacji do myszy z niedoborem odporności są ukrwione krwinkami czerwonymi gospodarza. Na tym barwieniu H&amp;E implantów z żelu CELLULARIZE zawierających ECFC pochodzące z krwi pępowinowej widoczne są mikronaczynia wypełnione krwinkami czerwonymi gospodarza, które utworzyły się w żelu kolagenowo-fibronektynowym po 14 dniach od implantacji. Tutaj barwienie anty-ludzkim CD 31 w kolorze brązowym dodatkowo potwierdza ludzkie pochodzenie tych naczyń.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować ECFC z krwi pępowinowej człowieka oraz jak klonować, namnażać i charakteryzować funkcjonalność kolonii ECFC po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom śródbłonka naczyniowego do zbadania potencjału klonalnej proliferacji oraz zdolności genetycznych komórek śródbłonka pochodzących z wielu źródeł.

phenotypic-functional-characterization-endothelial-colony-forming

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek tworzących kolonie śródbłonka pochodzących z ludzkiej pępowiny

Endotelialne komórki progenitorowe tworzące kolonie (ECFCs) stanowią obiecujące narzędzie do badania homeostazy i regeneracji naczyń krwionośnych.1,2 Niniejsza praca przedstawia nową metodę izolacji i ekspansji ECFC z heparynowanej krwi obwodowej dorosłego człowieka bez użycia surowicy zwierzęcej, z wykorzystaniem puli lizatu płytek krwi człowieka (pHPL), co zmniejsza ryzyko immunizacji przeciwko białkom bydlęcym.

Izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Test tworzenia kolonii (CFC) to badanie in vitro, w którym komórki progenitorowe krwiotwórcze tworzą kolonie w podłożu półstałym. Do oceny zdolności progenitorów do proliferacji i różnicowania się wzdłuż różnych linii krwiotwórczych wykorzystuje się kombinację analizy morfologii kolonii, morfologii komórek oraz cytometrii przepływowej.

Test tworzenia kolonii (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Ten protokół pozwala na wiarygodne generowanie i charakteryzowanie komórek śródbłonka (BOEC) z małej objętości dorosłej krwi obwodowej. BOEC mogą być stosowane jako substytut komórek śródbłonka od pacjentów z zaburzeniami naczyniowymi oraz jako substrat do wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie i hodowla komórek śródbłonka przerostu krwi z ludzkiej krwi obwodowej

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Charakterystyka komórek śródbłonka rozrostu krwi (BOEC) z krwi obwodowej świń

Poznaj izolację i charakteryzację komórek tworzących kolonie śródbłonka z krwi pępowinowej. Metoda obejmuje hodowlę jednokomórkową oraz ocenę tworzenia naczyń in vivo w modelu mysim.

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

Przeglądaj więcej filmów