Name: Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Naucz się izolować śródbłonkowe komórki progenitorowe z ludzkiej krwi pępowinowej w specjalistycznym medium bez sortowania. Ta metoda umożliwia badanie neowaskularyzacji i inżynierię tkankową naczyń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez National Science Foundation w ramach grantu nr. CMMI-1452943 oraz przez University of Arkansas Honors College. Chcielibyśmy również podziękować Bankowi Krwi Pępowinowej w Arkansas za udostępnienie nam jednostek krwi pępowinowej.

To badanie zostało przeprowadzone za zgodą University of Arkansas Institutional Review Board (numer zatwierdzenia 16-04-722). Jednostki krwi pępowinowej pobrano w roztworze dekstrozy fosforanowej cytrynianowej (CPD) w Banku Krwi Pępowinowej w Arkansas, a jednostki, które nie spełniały wymogu przechowywania, zostały przekazane do badań. Jednostki krwi pępowinowej zostały dostarczone kurierem do laboratorium w ciągu 24 godzin od pobrania w temperaturze otoczenia.
1. Izolacja komórek progenitorowych śródbłonka z krwi pępowinowej
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników.
	<ol>
		<li>Przygotować NWZ, dodając śródbłonkowe podłoże podstawowe (EBM) do 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) uzupełnionej 20 ng/ml insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF), 1 μg/ml kwasu askorbinowego, 5 ng/ml rekombinowanego ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (rhEGF), 22,5 μg/ml heparyny i 0,5 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) wraz z 10 ng/ml rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów B (rhFGF-B), 0,2 μg/ml hydrokortyzonu i 2% penicylina-streptomycyna-glutamina. Wysterylizuj pożywkę hodowlaną za pomocą membranowego filtra próżniowego z polieterosulfonu (PES) o grubości 0,2 μm.</li>
		<li>Przygotować roztwór kolagenu szczurzego ogona I o stężeniu 50 μg/ml przy użyciu 0,02 N kwasu octowego. Wysterylizuj ten roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm.</li>
		<li>Wstępnie pokryj 6-dołkowe płytki 2 ml przygotowanego roztworu kolagenu ze szczurzego ogona I dla każdej studzienki. Umieścić je w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę przed siewem.</li>
		<li>Rozcieńczyć około 25 ml krwi pępowinowej zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) w stężeniu 1:1.</li>
		<li>Przygotować bufor do testu strącania radioimmunologicznego (RIPA) przy użyciu 150 mM chlorku sodu, 1% Triton X-100, 0,5% deoksycholanu sodu, 1 mM β-glicerofosforanu, 0,1% SDS i 50 mM Tris (pH 8,0).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych.
	<ol>
		<li>Przed izolacją ogrzać wszystkie przygotowane odczynniki w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 20 ml odczynnika o gradiencie gęstości do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Ostrożnie umieścić 20 ml rozcieńczonej krwi pępowinowej w probówce wirówkowej zawierającej pożywkę o gradiencie gęstości, nie przerywając tej warstwy, kierując pipetę w stronę bocznych ścianek probówki.</li>
		<li>Oddziel składniki krwi na podstawie ich gęstości (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) przez wirowanie przy 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przy wyłączonych hamulcach wirnika wirówki. Nie naruszaj różnych warstw.</li>
		<li>Usuń warstwę plazmy, ostrożnie pipetując ją z probówki, nie naruszając innych warstw komórek, aż końcówka pipety będzie w stanie dotrzeć do warstwy MNC (patrz Rysunek 1). Wyrzuć usunięte osocze. 
		UWAGA: Używając końcówek pipet do usuwania plazmy, pozostaw niewielką warstwę plazmy nad warstwą MNC (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), aby zmniejszyć zakłócenia.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki umieszczonej na igle o rozmiarze 18 należy zebrać kożuchową powłokę zawierającą MNC i przenieść ją do świeżej probówki wirówkowej.</li>
		<li>Dodać równą objętość EBM do zebranych MNC. Odwirować te probówki przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. 
		UWAGA: Osad komórkowy będzie wyglądał na czerwony z powodu obecności czerwonych krwinek/erytrocytów.</li>
		<li>Dodać 5 ml roztworu chlorku amonu, aby zlizować czerwone krwinki. Inkubować tę probówkę na lodzie przez 5 - 10 minut, od czasu do czasu wstrząsając. 
		UWAGA: Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby nie przekroczyć czasu trwania, ponieważ może to być szkodliwe dla korporacji wielonarodowych.</li>
		<li>Odwirować probówki o sile 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Jeśli erytrocyty utrzymują się, powtarzaj kroki 1.2.8 i 1.2.9, aż nie zaobserwuje się czerwonego koloru w osadzie.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad w przygotowanym NWZ i użyć hemocytometru do policzenia MNC.</li>
		<li>Odessać 6-dołkową płytkę pokrytą kolagenem z ogona szczura I (z kroku 1.1.3) i trzykrotnie przemyć studzienki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).</li>
		<li>Wysiewaj osad MNC zawieszony ponownie w EGM na płytce kolagenowej w stężeniu 1 x 107 MNC w każdym dołku. Umieścić go w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Po 24 godzinach odessać pożywkę i raz umyć studzienki EGM. Dodać 3 ml pożywki EGM do każdej studzienki i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Uzupełniaj talerz świeżą pożywką EGM codziennie przez 7 dni. Po upływie 7 dni należy zmieniać medium NWZ co drugi dzień.</li>
		<li>Korzystając z mikroskopu jasnego pola, codziennie rób zdjęcia 6-dołkowej płytki, aby śledzić postęp kolonii komórek śródbłonka. Zaznacz płytkę, na której powstają kolonie, aby śledzić ich wzrost. 
		UWAGA: Zwykle potrzeba od 5 do 9 dni, aby kolonie pojawiły się w kulturze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspansja śródbłonkowych komórek progenitorowych.
	<ol>
		<li>Pokryć kolbę hodowlaną T-25 kolagenem z ogona szczura I (50 μg/ml) i umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na co najmniej 60 minut. Przed wysiewem komórek należy odessać i umyć kolbę do hodowli komórek T-25 trzykrotnie 1x PBS.</li>
		<li>Trypsynizuj kolonie komórek śródbłonka, gdy osiągną wielkość około 3 mm, używając 150 μl 0,05% roztworu trypsyny-EDTA w każdym dołku. Umieścić 6-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 2 - 3 minuty.</li>
		<li>Delikatnie postukaj w płytkę 6-dołkową, aby usunąć przyczepione komórki. Natychmiast dodać 2 ml EGM i odzyskać komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz początkową gęstość wysiewu.</li>
		<li>Wirować probówki wirówkowe o pojemności 15 ml o masie 400 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w EGM i wysiać kolbę T-25 z ~500 000 komórek. Oznaczyć tę kolbę jako przejście 1 i umieścić kolbę T-25 z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . 
		UWAGA: Ogniwa można posiać w EBM i DMEM w celu porównania wzrostu z EGM.</li>
		<li>W przypadku dalszych pasaży, gdy kolba osiągnie 90% konfluencji, należy postępować zgodnie z krokami 1.3.1 - 1.3.5 i ponownie zasiać komórki w odległości 104 komórek/cm2 w kolbach do hodowli komórkowych T-75 lub T-175. Przejdź do charakterystyki izolowanych komórek (kroki 2 i 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka izolowanych komórek za pomocą Western Blotting
<ol>
	<li>Dodaj 50 - 100 μl buforu do lizy przy każdym pasażu, postępując zgodnie z etapami ekspansji, aby scharakteryzować izolowane komórki. Zbierz białka z około 500 000 lub więcej komórek.</li>
	<li>Energicznie pipetuj w górę i w dół, aby rozerwać komórki i uwolnić białka. Zebrać i przenieść bufor do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Odwirować probówkę do mikrowirówki o masie 500 x g i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Oznaczyć i przechowywać probówki w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Określ ilościowo ilość białek w każdej probówce za pomocą testu Bradforda lub BCA27,28,29.</li>
	<li>Przeprowadź Western blotting przy użyciu standardowych procedur27,28,29. Przeanalizuj 5 μg białka całkowitego pod kątem ekspresji CD31, CD34, VEGFR2 i α-SMA. Użyj α-tubuliny do normalizacji danych.</li>
</ol>
3. Immunofluorescencja pośrednia
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm zanurzyć w 50% etanolu i wysuszyć. Pozostaw czyste szkiełka nakrywkowe na noc w 12-dołkowej płytce w kapturze bezpieczeństwa biologicznego z włączoną lampą UV, aby je wysterylizować.</li>
	<li>Pokryj szkiełka nakrywkowe 50 μg/ml kolagenu I ze szczurzego ogona i przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na co najmniej 60 minut.</li>
	<li>Odessać kolagen i dodać 1 ml 1x PBS do 12-dołkowej płytki, aby umyć szkiełka nakrywkowe. Zassać 1x PBS i powtórzyć dwukrotnie.</li>
	<li>Wysiewaj 250 000 kultur EPC w każdym dołku i umieść je z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na co najmniej 3 dni przed przeprowadzeniem barwienia immunologicznego.</li>
	<li>Umyj płytkę 3 razy za pomocą 1x PBS. Dodaj 1 ml lodowatego metanolu do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby utrwalić komórki.</li>
	<li>Barwienie immunologiczne należy przeprowadzić przy użyciu standardowego protokołu27,28,29. Stosować przeciwciała w ich odpowiednich rozcieńczeniach (np. CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1:100) i VEGFR2 (1:50)).</li>
	<li>Zrób zdjęcia immunologicznie wybarwionych szkiełek nakrywkowych za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275 (5302), 964-967 (1997).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).</li>
<li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92 (2), 362-367 (1998).</li>
<li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+identity%2C+phenotype%2C+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li>
<li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li>
<li>Sales, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta1+modulates+extracellular+matrix+production%2C+proliferation%2C+and+apoptosis+of+endothelial+progenitor+cells+in+tissue-engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds.</a> Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).</li>
<li>Sales, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Progenitor+Cells+as+a+Sole+Source+for+Ex+Vivo+Seeding+of+Tissue-Engineered+Heart+Valves%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves.</a> Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).</li>
<li>Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+diagnostic+and+therapeutic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations.</a> Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).</li>
<li>Hur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+two+types+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+different+contributions+to+neovasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).</li>
<li>Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unresolved+questions%2C+changing+definitions%2C+and+novel+paradigms+for+defining+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells.</a> Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).</li>
<li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).</li>
<li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial progenitor cells.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692(2012).</li>
<li>Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+what+use+for+the+cardiologist%5BTitle%5D)+AND+%22J+Angiogenes+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist.</a> J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).</li>
<li>Camci-Unal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-modified+hyaluronic+acid+hydrogels+to+capture+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells.</a> Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).</li>
<li>Hill, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+progenitor+cells%2C+vascular+function%2C+and+cardiovascular+risk%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk.</a> N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).</li>
<li>Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologic+properties+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+potential+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Cardiovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy.</a> Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).</li>
<li>Mehta, J. L., Szwedo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+progenitor+cells%2C+microparticles+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease.</a> J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).</li>
<li>Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).</li>
<li>Cebotari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+tissue+engineered+human+heart+valves+using+autologous+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells.</a> Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).</li>
<li>Ito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+as+putative+targets+for+angiostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin.</a> Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).</li>
<li>Vasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+circulating+endothelial+progenitor+cells+by+statin+therapy+in+patients+with+stable+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease.</a> Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+microvessels+on+three-dimensional+biodegradable+scaffolds+using+human+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).</li>
<li>Boyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+and+their+progenitor+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood.</a> J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).</li>
<li>Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+and+hydrocortisone+on+the+co-culture+of+mature+adipocytes+and+endothelial+cells+for+vascularized+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering.</a> Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).</li>
<li>Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetazolamide+Mitigates+Astrocyte+Cellular+Edema+Following+Mild+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury.</a> Sci Rep. 6, 33330(2016).</li>
<li>Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valve+interstitial+cell+contractile+strength+and+metabolic+state+are+dependent+on+its+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape.</a> Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).</li>
<li>Tandon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valve+interstitial+cell+shape+modulates+cell+contractility+independent+of+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype.</a> J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).</li>
<li>Cockshell, M. P., Bonder, C. S. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e1772">Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells.</a> Bio-Protocol. 6 (7), (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak wspomniano wcześniej, przylegające EPC mają morfologię kostki brukowej. Nasze izolowane MNC rozwijały się od wrzecionowatej kolonii komórkowej (ryc. 2A-2D) we wczesnych stadiach do kolonii brukowej (ryc. 2E-2F) w ciągu dziesięciu dni w hodowli. EPC zostały oznaczone w różny sposób przez różne grupy badawcze, a mianowicie jako późne komórki progenitorowe śródbłonka10, komórki tworzące kolonie śródbłonk...

Kilku badaczy badało cechy i potencjał ludzkich EPCs5,10,11,12,13. EPC można opisać jako krążące komórki, które mają zdolność przylegania do tkanki śródbłonka w miejscach niedotlenienia, niedokrwienia, urazu lub powstawania guza i przyczyniają się do tworzenia nowych struktur naczyniowych4,14. Ich zaobserwowany udział w neowaskularyzacji, w postaci poporodowej waskulogenezy, doprowadził do zrozumienia patofizjologii tych komórek i ich wykorzystania w zastosowaniach terapeutycznych4,15,16. Wykazano, że liczba EPC u danej osoby jest skorelowana z patologią sercowo-naczyniową9,15,16,17,18,19,20. Inne badania również zróżnicowały EPC w fenotyp podobny do fibroblastów zastawki i zasugerowały, że komórki te mogą być wykorzystane do inżynierii tkankowej zastawek serca7,21.
Poszczególne cząsteczki na powierzchni komórki potrzebne do wyizolowania EPC nie zostały wyraźnie zidentyfikowane z powodu rozbieżności między badaniami4. Adhezja MNC do określonej matrycy, z ekspozycją na różne warunki hodowli, została przeprowadzona przez kilka grup1,17,22,23, co sugeruje, że domniemane EPC mogą wykazywać różne właściwości fenotypowe. Właściwości te obejmują brak zdolności fagocytotycznych, tworzenie się rurki w Matrigel i wychwyt lipoprotein o niskiej gęstości Dil-acetylowane. Wysoki potencjał klonogenny i proliferacyjny to dwie właściwości, dzięki którym EPC mogą być hierarchizowane5. EPC mogą również tworzyć kanaliki in vitro w korozji z ludzkimi płodowymi fibroblastami płuc4. Wiadomo, że komórki te wyrażają markery powierzchni komórek śródbłonka i dzielą niektóre markery krwiotwórcze13,24,25. Dodatnio wyrażone markery, które są powszechnie akceptowane do fenotypowania EPC, to CD31, CD34, receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 2 (VEGFR2), czynnik von Willebranda (vWF), CD133, c-Kit i kadheryna śródbłonka naczyniowego (VE-kadheryna)4,18. Komórki, które wykazują współekspresję CD90, CD45, CD14, CD115 lub aktyny alfa-mięśni gładkich (α-SMA) nie są uważane za EPC ze względu na ich ograniczony potencjał proliferacyjny, zdolność do fagocytozy bakterii i niezdolność do tworzenia ludzkich naczyń de novo in vivo4,7. W artykule przedstawiono zmodyfikowany protokół izolacji śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej bez konieczności stosowania jakichkolwiek protokołów sortowania komórek. W tym artykule użyliśmy CD31, CD34 i VEGFR2 jako markerów dodatnich, z α-SMA jako wskaźnikiem ujemnym.
W tym artykule proponujemy metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych śródbłonka z krwi pępowinowej bez sortowania komórek za pomocą specjalistycznego podłoża do wzrostu śródbłonka uzupełnionego czynnikami wzrostu (EGM). To NWZ zawiera czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF), które zwiększają przeżywalność, proliferację i migrację komórek śródbłonka26. Zawiera również kwas askorbinowy, który jest odpowiedzialny za utrzymanie morfologii komórek kostki brukowej; insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (IGF-1), który zapewnia funkcję angiogenną i migracyjną; oraz heparyna, która powoduje poprawę długoterminowej stabilności czynników wzrostu w klasie Medium<sup="xref">26. Inne czynniki wzrostu dodawane do pożywki do hodowli komórek śródbłonka obejmują suplementację naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), który pomaga w stymulowaniu proliferacji i różnicowania komórek, oraz hydrokortyzonem, który uwrażliwia komórki na EGF26. Pokazujemy, że zastosowanie tej specyficznej pożywki wzrostowej daje większą liczbę EPC w porównaniu z śródbłonkowym podłożem podstawowym (EBM) lub zmodyfikowanym podłożem orła Dulbecco (DMEM).

<table><tbody><tr><td><silny>A) Do izolacji i hodowli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Ten produkt zawiera wszystkie czynniki wzrostu potrzebne do wytworzenia płodowej</td></tr><tr><td>surowicy bydlęcej</td> pożywki wzrostu śródbłonka <td>Thermofisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycyna-Glutamina (100x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Heatlhcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>chlorku amonu</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>1x Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail I Kolagen</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Amresco</td><td>0714-500ML</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>bufor HEPES</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>B) Przeciwciała i lizaty komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>1:250 rozcieńczenie&nbsp; dla Western blotting</td></tr><tr><td>CD34</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7045</td><td>1:100 rozcieńczenie dla Western blotting</td></tr><tr><td>&alpha;-SMA</td><td>abcam</td><td>ab5694</td><td>1:100 rozcieńczenie dla Western blotting</td></tr><tr><td>&alpha;-tubulina</td><td>abcam</td><td>ab7291</td><td>1:2,500 rozcieńczenie dla Western blotting</td></tr><tr><td>VEGFR2</td><td>abcam</td><td>sc504</td><td>Rozcieńczenie 1:100 do Western blot</td></tr><tr><td>Ludzki lizat komórek śródbłonka żyły pępowinowej</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc24709&nbsp;</td><td></td></tr><tr>Lizat <td></td><td></td><td>komórek śródmiąższowych zastawki</td><td>Pierwotna linia komórkowa wyhodowana z własnego laboratorium i poddana lizie z buforem RIPA</td></tr> <tr><td>< silny>C) Western blot i barwienie immunologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor Tris/Glycine/SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0772</td><td>Używany jako bufor do biegania</td></tr><tr><td>10x Bufor Tris/Glycine</td><td>Biorad</td><td>161-0771</td><td>Używany jako bufor transferowy</td></tr><tr><td>Membrana transferowa Immobilon-FL</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL0010</td><td>Jest to membrana transferowa PVDF, która ma 45 &mikro; m wielkości porów i jest wymieniony w protokole jako membrana western blot</td></tr><tr><td>4x bufor do próbek Laemmli</td><td>Biorad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Biorad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>10% Criterion TGX żel prefabrykowany</td><td>Biorad</td><td>5671033</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Służy do montażu immunologicznie barwionych szkiełek nakrywkowych do długotrwałego przechowywania</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Istnienie śródbłonkowych komórek progenitorowych (EPC) we krwi obwodowej i ich udział w waskulogenezie zostało po raz pierwszy zgłoszone przez Asharę i współpracowników1. Później inni udokumentowali istnienie podobnych typów EPC pochodzących ze szpiku kostnego2,3. Niedawno Yoder i Ingram wykazali, że EPC pochodzące z krwi pępowinowej mają wyższy potencjał proliferacyjny w porównaniu z tymi wyizolowanymi z dorosłej krwi obwodowej 4,5,6. Oprócz udziału w waskulogenezie poporodowej, EPC okazały się również obiecujące jako źródło komórek do tworzenia inżynierii tkankowej konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca7,8. Istnieją różne protokoły izolacji, z których niektóre obejmują sortowanie komórek jednojądrzastych (MNC) pochodzących ze źródeł wymienionych wcześniej za pomocą markerów śródbłonka i hematopoetycznych lub hodowlę tych MNC za pomocą specjalistycznej pożywki do wzrostu śródbłonka, lub kombinację tych technik9. W tym miejscu przedstawiono protokół izolacji i hodowli EPC przy użyciu specjalistycznej pożywki śródbłonkowej uzupełnionej czynnikami wzrostu, bez użycia immunosortingu, a następnie charakterystykę izolowanych komórek za pomocą Western blotting i barwienia immunologicznego.

Izolacja i ekspansja komórek progenitorowych śródbłonka: 
Przedstawiono schemat (Rysunek 1>) obrazujący cały protokół. Różne warstwy składników krwi zaobserwowano po wirowaniu w gradiencie gęstości krwi pępowinowej człowieka z zastosowaniem medium do gradientu gęstości. Po wysianiu MNC na płytki traktowane kolagenem, wzrost kolonii zaobserwowano po raz pierwszy między 5. a 7. dniem (Rysunek 2A...

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja komórek progenitorowych śródbłonka z krwi pępowinowej człowieka. Metoda ta opisuje izolację komórek progenitorowych śródbłonka z krwi pępowinowej w celu ich potencjalnego wykorzystania jako komórek autologicznych w inżynierii tkankowej przeszczepów naczyniowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedura izolacji może być przeprowadzona w specjalistycznych mediach bez konieczności stosowania sortowania aminowego.Wyizolowane komórki progenitorowe śródbłonka mogą być wykorzystane do badania neowaskularyzacji, a doniesienia sugerują również, że komórki te mogą służyć jako biomarkery do identyfikacji pacjentów z grupy ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego. Przed rozpoczęciem procedury izolacji, pokryj płytki 6-dołkowe dwiema mililitrami świeżo przygotowanego roztworu kolagenu typu I z ogona szczura na każdą dołkę. Równoważ płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej jedną godzinę.Następnie rozcieńczyć około 25 mililitrów krwi pępowinowej w roztworze HBSS w stosunku jeden do jednego. Potem do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów dodać 20 mililitrów odczynnika do gradientu gęstości, a następnie ostrożnie nalać 20 mililitrów rozcieńczonej krwi pępowinowej po ściance probówki, aby krew utworzyła warstwę na medium. Rozdzielić komórki poprzez wirowanie, a następnie ostrożnie usunąć warstwę osocza.Za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 18 G pobierz warstwę leukocytową zawierającą komórki mononuklearne do nowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie dodaj do komórek taką samą objętość podstawowego medium dla komórek śródbłonka. Przemyj komórki poprzez wirowanie, a następnie poddaj lizie erytrocyty w powstałym osadzie, dodając pięć ml roztworu chlorku amonu w warunkach chłodniczych (na lodzie).Po pięciu do 10 minutach, przy okazjonalnym wstrząsaniu, należy zebrać komórki poprzez wirowanie i resuspendować biały osad w świeżej pożywce do wzrostu komórek śródbłonka. Po przeliczeniu należy odessać kolagen z każdej studni płytki sześcio-dołkowej i przemyć studnie trzykrotnie w PBS. Należy wysiać komórki mononuklearne w stężeniu 1 × 10⁷ komórek na 2 mL pożywki na studnię.Następnie należy umieścić płytkę w inkubatorze na 24 godziny. Następnego dnia komórki należy wypłukać jednorazowo świeżą pożywką do wzrostu komórek śródbłonka. Następnie płuczkę należy zastąpić trzema mililitrami świeżej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i ponownie umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych.Używając mikroskopu w jasnym polu, wykonuj codzienne zdjęcia komórek, aby monitorować rozwój kolonii komórek śródbłonka, zaznaczając płytki, na których pojawiają się kolonie, w celu śledzenia ich wzrostu. Gdy kolonie komórek śródbłonka osiągną rozmiar około 3 mm, pokryj kolbę hodowlaną T25 świeżym kolagenem typu I z ogona szczura, pozostawiając ją na co najmniej jedną godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie zbierz komórki, dodając 150 µL 0,05% Trypsyny-EDTA na każdą studnię i inkubując w inkubatorze do hodowli komórkowych przez dwie do trzech minut.Należy delikatnie ostukać płytkę, aby odczepić przytwierdzone komórki. Gdy komórki zaczną się odrywać, należy natychmiast dodać 2 mL świeżej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i przenieść komórki do jednej probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Komórki należy zebrać poprzez wirowanie, a otrzymany osad zawiesić ponownie w świeżej pożywce do wzrostu komórek śródbłonka.Po przeliczeniu, wysiej komórki do kolby pokrytej kolagenem z gęstością 5 × 10⁵ komórek w 3 ml medium na kolbę i oznacz kolbę jako pasaż pierwszy. Następnie umieść kolbę w inkubatorze, dokonując ponownego wysiewu komórek za każdym razem, gdy kolonia osiągnie 90% konfluencji. Po wysianiu na płytki traktowane kolagenem, pierwszy wzrost kolonii obserwuje się zazwyczaj między piątym a dziewiątym dniem.Kolonie nadal rosną i w wczesnych etapach hodowli nabywają wrzecionowatej morfologii komórek, która z czasem przekształca się w morfologię przypominającą brukowanie. Całkowita liczba komórek pozyskiwanych przy każdym pasażu wzrasta w bezpośredniej korelacji z całkowitą liczbą dni hodowli. Analiza Western blot wykazuje wczesną ekspresję CD 31 i CD 34 przez hodowane komórki śródbłonka, która wydaje się zmniejszać wraz z kolejnymi pasażami.Ekspresja receptora dwa dla czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego jest jednak utrzymywana w czasie, choć na nieco niższym poziomie niż ten zaobserwowany po pierwszym pasażu. Warto zauważyć, że komórki progenitorowe śródbłonka nie wykazują dodatniego wyniku w kierunku markera komórek mezenchymalnych alfa-aktyny mięśni gładkich, w przeciwieństwie na przykład do lizatów komórek śródmiąższowych zastawek, które mogą zostać wykorzystane jako kontrola dodatnia. Cała procedura izolacji może zostać zakończona w czasie krótszym niż pięć godzin, w zależności od uzyskanej jednostki krwi pępowinowej.Po wyizolowaniu i wysianiu komórek mononuklearnych w podłożu do wzrostu komórek śródbłonka, kolonie EPC pojawiają się zazwyczaj w hodowli po upływie od pięciu do dziewięciu dni. Proponowana metoda izolacji wykorzystuje specjalistyczne podłoża do hodowli komórek progenitorowych śródbłonka i eliminuje konieczność zastosowania cytometrii przepływowej w celu weryfikacji markerów śródbłonka. Metoda ta zapewnia również wydajny protokół pozwalający na uzyskanie dużej liczby komórek progenitorowych śródbłonka w krótkim czasie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak izolować komórki progenitorowe śródbłonka z jednostek krwi pępowinowej człowieka. Należy pamiętać, że krew pępowinowa człowieka może być niebezpieczna i należy przestrzegać zasad właściutego usuwania odpadów z krwi oraz produktów hodowli komórkowych.

isolation-endothelial-progenitor-cells-from-human-umbilical-cord

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół wideo przedstawia izolację i hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępekowej (HUVEC) z ludzkiej pępowiny. Po izolacji komórki te mogą być wykorzystywane w testach angiogenezy in vitro, takich jak zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego, zaprezentowany również przez laboratorium Hughesa.<br...

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Komórki endotelialne tworzące kolonie (ECFCs) to krążące komórki endotelialne o silnym potencjale proliferacyjnym klonalnym, które wykazują wrodzone in vivo zdolność do tworzenia naczyń. Fenotypowa i funkcjonalna charakterystyka komórek śródbłonka wyhodowanych z krwi pępowinowej jest istotna dla ich identyfikacji i izolacji bona fide ECFCy do potencjalnych zastosowań klinicznych w naprawie uszkodzonych tkanek.

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Tutaj opisujemy protokół izolacji podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej.  Wystarczająca ilość i jakość kwasów nukleinowych może zostać wyekstrahowana z komórek i wykorzystana w kolejnych testach z wykorzystaniem DNA lub RNA.

Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Ten protokół pozwala na wiarygodne generowanie i charakteryzowanie komórek śródbłonka (BOEC) z małej objętości dorosłej krwi obwodowej. BOEC mogą być stosowane jako substytut komórek śródbłonka od pacjentów z zaburzeniami naczyniowymi oraz jako substrat do wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie i hodowla komórek śródbłonka przerostu krwi z ludzkiej krwi obwodowej

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) są kluczowe w neowaskularyzacji niedokrwionych tkanek. Metoda ta opisuje izolację ludzkich EPC z krwi obwodowej, a także identyfikację ich potencjału migracyjnego w próbkach surowicy pacjentów kardiochirurgicznych.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej

Tutaj opisujemy ekspansję ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej leczonej kombinacją koktajlu cytokin i VPA. Metoda ta prowadzi do znacznego stopnia ekspansji ex vivo prymitywnych HSC do zastosowań klinicznych lub laboratoryjnych.

Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Naucz się izolować śródbłonkowe komórki progenitorowe z ludzkiej krwi pępowinowej w specjalistycznym medium bez sortowania. Ta metoda umożliwia badanie neowaskularyzacji i inżynierię tkankową naczyń.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Przeglądaj więcej filmów