Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka z ludzkiej krwi pępowinowej. Metoda ta opisuje izolację śródbłonkowych komórek progenitorowych z krwi pępowinowej w celu ich potencjalnego wykorzystania jako komórek autologicznych do inżynierii tkankowej przeszczepów naczyniowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedurę izolacji można przeprowadzić w specjalistycznych podłożach bez konieczności sortowania aminokwasów.

Izolowane komórki progenitorowe śródbłonka mogą być wykorzystane do badania neowaskularyzacji, a doniesienia sugerują również, że komórki te mogą być wykorzystywane jako biomarkery do identyfikacji pacjentów z ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych. Przed rozpoczęciem procedury izolacji należy wstępnie pokryć sześć płytek dwoma mililitrami świeżo przygotowanego ogona szczura po jednym roztworze kolagenu na dołek. Utrzymuj płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez co najmniej godzinę.

Następnie rozcieńczyć około 25 mililitrów krwi pępowinowej HBSS w stężeniu jeden do jednego. Następnie dodaj 20 mililitrów odczynnika o gradiencie gęstości do 50-mililitrowej stożkowej probówki i ostrożnie dozuj 20 mililitrów rozcieńczonej krwi pępowinowej w dół ścianki probówki, aby nałożyć krew na podłoże. Oddziel komórki przez odwirowanie, a następnie ostrożnie usuń warstwę plazmy.

Za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 18 zbierz komórkę jednojądrzastą zawierającą płaszcz kożucha do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. I dodaj równą objętość śródbłonka podłoża podstawnego do komórek. Umyj komórki przez odwirowanie i poddaj lizie czerwone krwinki w powstałym podniebieniu za pomocą pięciu mililitrów roztworu chlorku amonu na lodzie.

Po pięciu do 10 minutach z okazjonalnym potrząsaniem, zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś biały granulek w świeżym śródbłonkowym pożywce wzrostowej. Po policzeniu odessać kolagen z każdej studzienki z sześciodołkowej płytki i umyć studzienki trzy razy w PBS. Zasiać komórki jednojądrzaste w stężeniu od jednego razy 10 do siódmego na dwa mililitry pożywki na studzienkę.

I włóż płytkę z powrotem do inkubatora na 24 godziny. Następnego dnia spłucz komórki świeżą pożywką wzrostową śródbłonka. Następnie zastąp płukanie trzema mililitrami świeżej pożywki do wzrostu śródbłonka i włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.

Korzystając z mikroskopu jasnego pola, uzyskuj codzienne obrazy komórek, aby monitorować postęp kolonii komórek śródbłonka, oznaczając płytki, na których powstają kolonie, aby śledzić ich wzrost. Gdy kolonie komórek śródbłonka osiągną rozmiar około trzech milimetrów, pokryj kolbę hodowlaną T25 świeżym kolagenem ze szczurzego ogona przez co najmniej godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie zbierz komórki ze 150 mikrolitrami 0,05% trypsyny-EDTA na dołek w inkubatorze do hodowli komórkowych przez dwie do trzech minut.

Delikatnie postukaj w płytkę, aby usunąć przyczepione komórki. Kiedy komórki zaczną się odłączać, natychmiast dodaj dwa mililitry świeżej pożywki do wzrostu śródbłonka i wciągnij komórki do pojedynczej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce wzrostowej śródbłonka.

Po zliczeniu wysiewać komórki w kolbie pokrytej kolagenem w proporcji od pięciu do 10 do piątej komórki w trzech mililitrach pożywki o gęstości kolby i oznaczyć kolbę jako pasażową pierwszą. Następnie zwróć kolbę do inkubatora, ponownie wysiewając komórki, gdy kolonia osiągnie 90% konfluencji. Po wysianiu na płytki traktowane kolagenem, pierwszy wzrost kolonii obserwuje się zwykle między piątym a dziewiątym dniem.

Kolonie nadal rosną i uzyskują morfologię komórek w kształcie wrzeciona we wczesnych stadiach hodowli, która później rozwija się do morfologii przypominającej bruk. Całkowita liczba komórek pobranych przy każdym pasażu wzrasta w bezpośredniej korelacji z całkowitą liczbą dni w hodowli. Analiza Western blot ujawnia wczesną ekspresję CD 31 i CD 34 przez hodowane komórki śródbłonka, która wydaje się zmniejszać wraz z późniejszym pasażowaniem.

Ekspresja drugiego receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych utrzymuje się jednak w czasie, choć na nieco niższym poziomie ekspresji niż obserwowany po pierwszym pasażu. Warto zauważyć, że śródbłonkowe komórki progenitorowe nie są dodatnie dla mezenchymalnego markera komórkowego alfa aktyny mięśni gładkich, w przeciwieństwie na przykład do lizatów komórek śródmiąższowych zastawkowych, które można włączyć jako kontrolę pozytywną. Cała procedura izolacji może zostać zakończona w czasie krótszym niż pięć godzin, w zależności od uzyskanej jednostki krwi pępowinowej.

Po wyizolowaniu i wysianiu komórek jednojądrzastych w śródbłonkowym pożywce wzrostowej, zwykle potrzeba od pięciu do dziewięciu dni, aby kolonie EPC pojawiły się w kulturze. Proponowana metoda izolacji wykorzystuje specjalistyczne podłoża do hodowli śródbłonkowych komórek progenitorowych i unika się stosowania cytometru przepływowego, jeśli chodzi o wymóg posiadania markerów śródbłonka. Metoda ta zapewnia również skuteczny protokół uzyskiwania dużych ilości komórek progenitorowych śródbłonka w krótkim czasie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować komórki progenitorowe śródbłonka z ludzkich jednostek krwi pępowinowej. Nie zapominaj, że ludzka krew pępowinowa może być niebezpieczna i należy przestrzegać prawidłowej utylizacji krwi odpadowej i produktów hodowli komórkowych.