Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u Aplysia
15 lipca 2012
Pokazujemy, jak zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wolnego wapnia i skuteczności synaptycznej mogą być jednocześnie monitorowane w preparatach ganglionowych Aplysia. Obrazujemy wewnątrzkomórkowy wapń za pomocą barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange oraz indukujemy i monitorujemy transmisję synaptyczną za pomocą ostrych (wewnątrzkomórkowych) elektrod.
że wewnątrzkomórkowy wapń jest ważną częścią kilku mechanizmów plastyczności synaptycznej. Koncepcje te można przetestować, monitorując jednocześnie zmiany w wapniu i zmiany w skuteczności synaptycznej. Tutaj pokazujemy, jak to się osiąga, łącząc obrazowanie wapnia z zapisem wewnątrzkomórkowym.
Nasze eksperymenty przeprowadzamy ze zwojem Aplysia Cahora. Preparat ten ma szereg zalet, takich jak duże zidentyfikowane neurony, niskie temperatury, które są naturalne dla apia, wolne sygnały i ułatwiają obrazowanie, ale ogólne techniki, które demonstrujemy, można łatwo przenieść do innych systemów. Cześć, nazywam się Colin Evans i pracuję w laboratorium Elizabeth Cropper na Wydziale Neurologii w Fishburgu oraz w Instytucie Mózgu Freedmana w Mount Sinai School of Medicine w Nowym Jorku.
Dzisiaj zamierzamy zademonstrować jednoczesne obrazowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej w zwoju policzkowym Aplysia cahora. Aby wykryć wapń wewnątrzkomórkowy, wstrzykniemy neuronowi presynaptycznemu z komórką IMP permeant calcium indicator barwnik wapń pomarańczowy. Preparat jest następnie przenoszony pod mikroskopem, a neurony pre i postsynaptyczne są nabijane ostrymi elektrodami.
Powtarzająca się stymulacja presynaptyczna powoduje wzmocnioną odpowiedź postsynaptyczną widoczną jako zwiększający się potencjał postsynaptyczny lub amplituda PSP. Pomiar sygnału fluorescencyjnego barwnika wskaźnikowego wapnia pozwoli nam wykryć jednoczesne zmiany w presynaptycznym wewnątrzkomórkowym wapniu. Aby rozpocząć znieczulenie dorosłego zwierzęcia ważącego około 150 gramów, wstrzykując 75 mililitrów izotonicznego roztworu chlorku magnezu, przypnij znieczulone zwierzę do naczynia pokrytego woskiem, a następnie za pomocą kleszczy i nożyczek wykonaj nacięcie w stopie zwierzęcia i odsłonić masę policzkową.
Zwój policzkowy leży po brzusznej stronie masy policzkowej i składa się z dwóch połączonych zwojów krwiennych. Zawiera kilkaset neuronów, które wraz z neuronami w innych zwojach mózgowych przyczyniają się do generowania i kontrolowania zachowań żywieniowych zwierzęcia. Ostrożnie uwolnij ganglion, przecinając wszystkie wygięte nerwy cienkimi nożyczkami i usuń go ze zwierzęcia.
Następnie przypnij uwolniony ganglion do podstawy naczynia pokrytego sil guard wypełnionego sztuczną wodą morską. Ganglion jest owinięty osłonką z tkanki łącznej, która musi zostać usunięta, aby odsłonić poszczególne neurony. Użyj kleszczy weryfikacyjnych, nożyczek do tęczówki i szczególnej ostrożności, aby odciąć tę osłonę.
Aby uniknąć uszkodzenia neuronów, ustabilizuj zwój pochewki za pomocą około 15-minutowych szpilek, ponieważ każdy ruch będzie problematyczny podczas obrazowania. Aby przygotować ostre elektrody do zapisu wewnątrzkomórkowego i wstrzyknięcia barwnika, należy pociągnąć rurkę kapilarną za pomocą ściągacza do mikroelektrod. Używamy cienkościennego szkła krzemianowego boa o średnicy zewnętrznej jednego milimetra.
Elektrody rejestrujące powinny mieć rezystancję około 10 mega po napełnieniu trzema molowymi octanem potasu, a więc odpowiednio dostosowujemy ściągacz, aby wypełnić elektrody D. Zanurz tylną część wyciągniętej elektrody w 10-milimolowym roztworze kapilarnego barwnika wapniowo-pomarańczowego wzdłuż szklanego włókna wewnątrz elektrody, aby wciągnąć barwnik do końcówki, a następnie wypełnij elektrodę 200-milimolowym chlorkiem potasu, aby zapewnić dobry kontakt elektryczny. Używamy specjalnie zbudowanego Bela, aby poprawić właściwości elektrody i obniżyć rezystancję elektrody rejestrującej do około pięciu mega.
Elektroda jest utrzymywana pod kątem 45 stopni w strumieniu zawiesiny tlenku glinu. Zmieszanie chlorku sodu z zawiesiną i podłączenie miernika ome umożliwia monitorowanie rezystancji elektrody. Podczas procesu ukosowania przenosimy naczynie zawierające oszukane zwoje klamry do urządzenia do elektrofizjologii i lokalizujemy interesujące nas neurony, nabijając je elektrodami i weryfikując ich tożsamość.
Aby przygotować neuron do obrazowania wapnia, najpierw wkładamy elektrodę wypełnioną barwnikiem do somy komórki i teoretycznie obciążamy barwnik elektroteoretycznie 30 minutami hiperpolaryzujących impulsów prądu o natężeniu 15 nanoamperów. Gdy pomarańczowy wapń D dostanie się do komórki, SOR nabierze bladoróżowego koloru. Następnie ostrożnie wycofujemy elektrody rejestrujące i pozostawiamy preparat na co najmniej 30 minut, aby barwnik mógł dyfundować do drobnych procesów neuronu.
Następnie przenieś naczynie z preparatem do mikroskopu fluorescencyjnego. Używamy 10-krotnej soczewki zanurzeniowej NA 0,3 w wodzie na pionowym mikroskopie stałopozycyjnym, który ustawia ostrość, poruszając soczewką, a nie stolikiem. Ułatwia to montaż manipulatorów.
Dla elektrod rejestrujących należy dobrać odpowiedni blok filtracyjny. Blok trzech filtrów SI zapewni prawidłowe filtry wzbudzenia i emisji dla pomarańczy wapniowej, dostosuje parametry kamery i intensywność oświetlenia za pomocą filtrów o neutralnej gęstości i przysłony pola. Więcej światła spowoduje mniej hałasu, ale może potencjalnie wybielić preparat.
Fajna kamera CCD może uchwycić pole o wymiarach 500 na 300 pikseli z szybkością około 30 klatek na sekundę i dobrym stosunkiem sygnału do szumu. Zminimalizuj oświetlenie neuronów fil, trzymając przesłonę źródła światła zamkniętą, gdy tylko jest to możliwe. W oprogramowaniu do obrazowania wybierz obszary zainteresowania lub R ois.
Obszary te określają, gdzie oprogramowanie będzie wykonywać pomiary intensywności. Na ogół obrazujemy pierwszorzędowe, drugorzędowe i trzeciorzędowe gałęzie neuronu presynaptycznego. Umieść dodatkowy zwrot z inwestycji obok neuronu difi, aby uzyskać wartość tła, która jest później odejmowana od wszystkich innych punktów danych.
Wewnątrzkomórkowe elektrody rejestrujące w neuronach przed- i postsynaptycznych służą do indukowania i monitorowania transmisji synaptycznej. Możesz zapewnić synchronizację między akwizycją danych elektrofizjologicznych i obrazowych, jeśli użyjesz sygnału wyzwalającego wyjścia klatki kamery do uruchomienia oprogramowania do akwizycji danych. Innym sposobem zapewnienia synchronizacji jest zamontowanie diody LED wewnątrz portu kamery.
Ta dioda LED włącza się na krótko na początku sesji nagraniowej i w ten sposób zapewnia znak synchronizacji. Podczas typowego eksperymentu wyzwala się potencjały czynnościowe w neuronach presynaptycznych poprzez wstrzyknięcie krótkich impulsów prądu. W tym przykładzie pokazujemy serię skoków i odpowiadające im wzrosty sygnału wapniowego, aby przetestować określone hipotezy.
Można manipulować sygnałem wapniowym i określać wpływ na przekaźnictwo synaptyczne. Na przykład leki takie jak chelator wapnia EGTA mogą być wstrzykiwane presynaptycznie lub stosowane przez system perfuzyjny. Dane są analizowane poprzez eksport ich z oprogramowania do obrazowania do pliku tekstowego, a następnie do oprogramowania, które zostało użyte do pozyskania danych elektrofizjologicznych, czyli w naszym przypadku jest to spike two firmy Cambridge Electronic Design.
Używamy niestandardowego skryptu do wykreślenia wartości intensywności ROI i odpowiadających im zmian potencjału błony, ilościowego określenia zmian w sygnale wapniowym, odejmując sygnał tła uzyskany z ROI tła i obliczając względną zmianę za pomocą pokazanego równania. F zero to fluorescencja tuż przed stymulacją, a F to fluorescencja podczas stymulacji. Poniżej przedstawiamy wyniki eksperymentu, w którym zobrazowaliśmy zmiany we fluorescencji wapnia w zidentyfikowanym neuronie B 21.
Obszar, który zobrazowaliśmy, jest wskazany w A, w B jeden, wywołaliśmy wybuch skoków w B 21, który wywołał potencjały postsynaptyczne w B 8 i zmianę sygnału wapniowego. B dwa pokazuje efekt wstrzyknięcia chelatora wapnia. Skoki EGTA w B 21 nie wywołują już powszechnego wzrostu fluorescencji wapnia, a amplituda potencjału postsynaptycznego jest zmniejszona.
Podsumowując, zademonstrowaliśmy techniki, które można wykorzystać do jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i oceny skuteczności transmisji synaptycznej. Techniki te wymagają jedynie skromnego sprzętu w porównaniu z większością funkcjonalnych obrazowania i są łatwe i szybkie do nauczenia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie pokazuje jednoczesne monitorowanie stężenia wolnego wapnia wewnątrzkomórkowego i skuteczności synaptycznej w preparacie gangliów Aplysia. Za pomocą Orange'a wapniowego do obrazowania i ostrych elektrod wewnątrzkomórkowych do transmisji synaptycznej, badania podkreślają związek między dynamiką wapnia a plastycznością synaptyczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Plastyczność synaptyczna
- Wizoryzacja wapnia
Tło
- Wapń wewnątrzkomórkowy odgrywa kluczową rolę w mechanizmach plastyczności synaptycznej.
- Jednoczesne monitorowanie wapnia i skuteczności synaptycznej może zapewnić wgląd w te mechanizmy.
- Preparat gangliów Aplysia oferuje zalety dla takich badań.
- Demonstrowane techniki można zaadaptować do innych systemów.
Cel badania
- Zbadanie roli wapnia wewnątrzkomórkowego w transmisji synaptycznej.
- Demonstracja metody jednoczesnego monitorowania wapnia i skuteczności synaptycznej.
- Wykorzystanie Aplysia jako organizmu modelowego do badań neuronauki.
Zastosowane metody
- Wizoryzacja wapnia z użyciem fluorescencyjnego barwnika Orange wapniowy.
- Rejestrowanie wewnątrzkomórkowe z ostrymi elektrodami do monitorowania transmisji synaptycznej.
- Eksperymenty przeprowadzone na ganglionie ślimaki Aplysia.
- Wykorzystanie dużych, zidentyfikowanych neuronów dla efektywnego obrazowania.
Główne wyniki
- Udane jednoczesne monitorowanie stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej.
- Wykazanie związku między dynamiką wapnia a transmisją synaptyczną.
- Podkreślenie zalet wykorzystania Aplysia do takich badań.
- Przedstawienie metodologii stosowanej w innych systemach biologicznych.
Wnioski
- Wapń wewnątrzkomórkowy jest integralnym elementem rozumienia plastyczności synaptycznej.
- Połączone techniki obrazowania i rejestracji są skuteczne w badaniach neuronauki.
- Aplysia służy jako cenny model do badania mechanizmów synaptycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding the mechanistic link between intracellular calcium dynamics and synaptic efficacy is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. This approach enables predictive confidence in pathway modulation by directly linking a key second messenger to functional synaptic output. The Aplysia ganglion model provides a disease-relevant system for probing conserved plasticity mechanisms with high signal-to-noise and experimental stability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether modulating intracellular calcium alters synaptic transmission in identified neurons.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of calcium flux and postsynaptic potential changes.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by establishing causal relationships between calcium signaling and synaptic efficacy.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with normal ion channel distribution and stable synaptic connections for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers ratiometric-free fluorescence intensity changes correlated with electrophysiological readouts for high-content analysis.
- Scalability: Uses long-wavelength dye Calcium Orange requiring no filter wheel, simplifying imaging setup and increasing throughput potential.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved synaptic plasticity mechanisms applicable to neuropsychiatric and neurodegenerative disorder targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism probing with preclinical validation through standardized calcium-synaptic readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how target modulation affects both calcium dynamics and functional synaptic output.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking target engagement (via calcium modulation) to functional phenotypic outcomes (synaptic efficacy), supporting lead identification and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about calcium-dependent signaling pathways in synaptic plasticity using direct perturbation and dual-readout measurement.
- Screening: Enables assay standardization through stable preparations, low phototoxicity dyes, and synchronized electrophysiology-imaging data collection.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (ΔF/F fluorescence and PSP amplitude) that allow comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by correlating intracellular calcium changes with synaptic efficacy in a disease-relevant invertebrate model of conserved neural mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing calcium-dependent synaptic mechanisms across multiple target classes and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in calcium-synapse relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dye loading, electrode preparation, and synchronization via LED trigger.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets implicated in synaptic dysfunction.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on dual-modality readouts of target engagement and functional effect.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intracellular sharp electrode recording and calcium imaging techniques.
- Depends on fluorescence microscopy capable of 30 fps imaging and electrophysiology rigs with LED synchronization.
- Necessitates cross-team standardization between imaging and electrophysiology teams for synchronized data acquisition.
- Involves adaptation considerations when transferring the Aplysia ganglion preparation to other model systems with different neuronal sizes or synaptic properties.
- Limited by the inability of Calcium Orange to provide absolute calcium concentrations due to non-ratiometric nature and dye diffusion variables.
