Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u Aplysia

że wewnątrzkomórkowy wapń jest ważną częścią kilku mechanizmów plastyczności synaptycznej. Koncepcje te można przetestować, monitorując jednocześnie zmiany w wapniu i zmiany w skuteczności synaptycznej. Tutaj pokazujemy, jak to się osiąga, łącząc obrazowanie wapnia z zapisem wewnątrzkomórkowym.

Nasze eksperymenty przeprowadzamy ze zwojem Aplysia Cahora. Preparat ten ma szereg zalet, takich jak duże zidentyfikowane neurony, niskie temperatury, które są naturalne dla apia, wolne sygnały i ułatwiają obrazowanie, ale ogólne techniki, które demonstrujemy, można łatwo przenieść do innych systemów. Cześć, nazywam się Colin Evans i pracuję w laboratorium Elizabeth Cropper na Wydziale Neurologii w Fishburgu oraz w Instytucie Mózgu Freedmana w Mount Sinai School of Medicine w Nowym Jorku.

Dzisiaj zamierzamy zademonstrować jednoczesne obrazowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej w zwoju policzkowym Aplysia cahora. Aby wykryć wapń wewnątrzkomórkowy, wstrzykniemy neuronowi presynaptycznemu z komórką IMP permeant calcium indicator barwnik wapń pomarańczowy. Preparat jest następnie przenoszony pod mikroskopem, a neurony pre i postsynaptyczne są nabijane ostrymi elektrodami.

Powtarzająca się stymulacja presynaptyczna powoduje wzmocnioną odpowiedź postsynaptyczną widoczną jako zwiększający się potencjał postsynaptyczny lub amplituda PSP. Pomiar sygnału fluorescencyjnego barwnika wskaźnikowego wapnia pozwoli nam wykryć jednoczesne zmiany w presynaptycznym wewnątrzkomórkowym wapniu. Aby rozpocząć znieczulenie dorosłego zwierzęcia ważącego około 150 gramów, wstrzykując 75 mililitrów izotonicznego roztworu chlorku magnezu, przypnij znieczulone zwierzę do naczynia pokrytego woskiem, a następnie za pomocą kleszczy i nożyczek wykonaj nacięcie w stopie zwierzęcia i odsłonić masę policzkową.

Zwój policzkowy leży po brzusznej stronie masy policzkowej i składa się z dwóch połączonych zwojów krwiennych. Zawiera kilkaset neuronów, które wraz z neuronami w innych zwojach mózgowych przyczyniają się do generowania i kontrolowania zachowań żywieniowych zwierzęcia. Ostrożnie uwolnij ganglion, przecinając wszystkie wygięte nerwy cienkimi nożyczkami i usuń go ze zwierzęcia.

Następnie przypnij uwolniony ganglion do podstawy naczynia pokrytego sil guard wypełnionego sztuczną wodą morską. Ganglion jest owinięty osłonką z tkanki łącznej, która musi zostać usunięta, aby odsłonić poszczególne neurony. Użyj kleszczy weryfikacyjnych, nożyczek do tęczówki i szczególnej ostrożności, aby odciąć tę osłonę.

Aby uniknąć uszkodzenia neuronów, ustabilizuj zwój pochewki za pomocą około 15-minutowych szpilek, ponieważ każdy ruch będzie problematyczny podczas obrazowania. Aby przygotować ostre elektrody do zapisu wewnątrzkomórkowego i wstrzyknięcia barwnika, należy pociągnąć rurkę kapilarną za pomocą ściągacza do mikroelektrod. Używamy cienkościennego szkła krzemianowego boa o średnicy zewnętrznej jednego milimetra.

Elektrody rejestrujące powinny mieć rezystancję około 10 mega po napełnieniu trzema molowymi octanem potasu, a więc odpowiednio dostosowujemy ściągacz, aby wypełnić elektrody D. Zanurz tylną część wyciągniętej elektrody w 10-milimolowym roztworze kapilarnego barwnika wapniowo-pomarańczowego wzdłuż szklanego włókna wewnątrz elektrody, aby wciągnąć barwnik do końcówki, a następnie wypełnij elektrodę 200-milimolowym chlorkiem potasu, aby zapewnić dobry kontakt elektryczny. Używamy specjalnie zbudowanego Bela, aby poprawić właściwości elektrody i obniżyć rezystancję elektrody rejestrującej do około pięciu mega.

Elektroda jest utrzymywana pod kątem 45 stopni w strumieniu zawiesiny tlenku glinu. Zmieszanie chlorku sodu z zawiesiną i podłączenie miernika ome umożliwia monitorowanie rezystancji elektrody. Podczas procesu ukosowania przenosimy naczynie zawierające oszukane zwoje klamry do urządzenia do elektrofizjologii i lokalizujemy interesujące nas neurony, nabijając je elektrodami i weryfikując ich tożsamość.

Aby przygotować neuron do obrazowania wapnia, najpierw wkładamy elektrodę wypełnioną barwnikiem do somy komórki i teoretycznie obciążamy barwnik elektroteoretycznie 30 minutami hiperpolaryzujących impulsów prądu o natężeniu 15 nanoamperów. Gdy pomarańczowy wapń D dostanie się do komórki, SOR nabierze bladoróżowego koloru. Następnie ostrożnie wycofujemy elektrody rejestrujące i pozostawiamy preparat na co najmniej 30 minut, aby barwnik mógł dyfundować do drobnych procesów neuronu.

Następnie przenieś naczynie z preparatem do mikroskopu fluorescencyjnego. Używamy 10-krotnej soczewki zanurzeniowej NA 0,3 w wodzie na pionowym mikroskopie stałopozycyjnym, który ustawia ostrość, poruszając soczewką, a nie stolikiem. Ułatwia to montaż manipulatorów.

Dla elektrod rejestrujących należy dobrać odpowiedni blok filtracyjny. Blok trzech filtrów SI zapewni prawidłowe filtry wzbudzenia i emisji dla pomarańczy wapniowej, dostosuje parametry kamery i intensywność oświetlenia za pomocą filtrów o neutralnej gęstości i przysłony pola. Więcej światła spowoduje mniej hałasu, ale może potencjalnie wybielić preparat.

Fajna kamera CCD może uchwycić pole o wymiarach 500 na 300 pikseli z szybkością około 30 klatek na sekundę i dobrym stosunkiem sygnału do szumu. Zminimalizuj oświetlenie neuronów fil, trzymając przesłonę źródła światła zamkniętą, gdy tylko jest to możliwe. W oprogramowaniu do obrazowania wybierz obszary zainteresowania lub R ois.

Obszary te określają, gdzie oprogramowanie będzie wykonywać pomiary intensywności. Na ogół obrazujemy pierwszorzędowe, drugorzędowe i trzeciorzędowe gałęzie neuronu presynaptycznego. Umieść dodatkowy zwrot z inwestycji obok neuronu difi, aby uzyskać wartość tła, która jest później odejmowana od wszystkich innych punktów danych.

Wewnątrzkomórkowe elektrody rejestrujące w neuronach przed- i postsynaptycznych służą do indukowania i monitorowania transmisji synaptycznej. Możesz zapewnić synchronizację między akwizycją danych elektrofizjologicznych i obrazowych, jeśli użyjesz sygnału wyzwalającego wyjścia klatki kamery do uruchomienia oprogramowania do akwizycji danych. Innym sposobem zapewnienia synchronizacji jest zamontowanie diody LED wewnątrz portu kamery.

Ta dioda LED włącza się na krótko na początku sesji nagraniowej i w ten sposób zapewnia znak synchronizacji. Podczas typowego eksperymentu wyzwala się potencjały czynnościowe w neuronach presynaptycznych poprzez wstrzyknięcie krótkich impulsów prądu. W tym przykładzie pokazujemy serię skoków i odpowiadające im wzrosty sygnału wapniowego, aby przetestować określone hipotezy.

Można manipulować sygnałem wapniowym i określać wpływ na przekaźnictwo synaptyczne. Na przykład leki takie jak chelator wapnia EGTA mogą być wstrzykiwane presynaptycznie lub stosowane przez system perfuzyjny. Dane są analizowane poprzez eksport ich z oprogramowania do obrazowania do pliku tekstowego, a następnie do oprogramowania, które zostało użyte do pozyskania danych elektrofizjologicznych, czyli w naszym przypadku jest to spike two firmy Cambridge Electronic Design.

Używamy niestandardowego skryptu do wykreślenia wartości intensywności ROI i odpowiadających im zmian potencjału błony, ilościowego określenia zmian w sygnale wapniowym, odejmując sygnał tła uzyskany z ROI tła i obliczając względną zmianę za pomocą pokazanego równania. F zero to fluorescencja tuż przed stymulacją, a F to fluorescencja podczas stymulacji. Poniżej przedstawiamy wyniki eksperymentu, w którym zobrazowaliśmy zmiany we fluorescencji wapnia w zidentyfikowanym neuronie B 21.

Obszar, który zobrazowaliśmy, jest wskazany w A, w B jeden, wywołaliśmy wybuch skoków w B 21, który wywołał potencjały postsynaptyczne w B 8 i zmianę sygnału wapniowego. B dwa pokazuje efekt wstrzyknięcia chelatora wapnia. Skoki EGTA w B 21 nie wywołują już powszechnego wzrostu fluorescencji wapnia, a amplituda potencjału postsynaptycznego jest zmniejszona.

Podsumowując, zademonstrowaliśmy techniki, które można wykorzystać do jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i oceny skuteczności transmisji synaptycznej. Techniki te wymagają jedynie skromnego sprzętu w porównaniu z większością funkcjonalnych obrazowania i są łatwe i szybkie do nauczenia.