Name: Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u Aplysia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego wapnia i skuteczności synaptycznej u Aplysia. Wykorzystuje się tu obrazowanie wapnia z barwnikiem Calcium Orange oraz wewnątrzkomórkowe rejestracje elektrodami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant PHS (MH51393). Część wykorzystanych przez nas Aplysia została udostępniona przez National Resource for Aplysia na Uniwersytecie w Miami w ramach grantu RR10294 z National Center for Research Resources, NIH.

1. Przygotowanie
<ol>
 <li>Znieczul zwierzę, wstrzykując 75-100 ml izotonicznego roztworu chlorku magnezu. Aplysia wykorzystywane do obrazowania mają zazwyczaj masę 150-200 g i są pozyskiwane z firmy Marinus Scientific.</li>
 <li>Przytwierdź znieczulone zwierzę do naczynia pokrytego woskiem. W tym celu dobrze sprawdzają się igły strzykawkowe; techniki sterylne nie są wymagane. Używając kleszczy chirurgicznych i standardowych nożyczek, wykonaj nacięcie w stopie zwierzęcia i odsłoń masę bukkalną. Zlokalizuj zwoj bukkalny. Za pomocą nożyczek sprężynowych i precyzyjnych pęset ostrożnie uwolnij zwoj, przecinając wszystkie nerwy bukkalne.</li>
 <li>Wyjmij zwoj i umieść go w naczyniu powleczonym Sylgardem zawierającym sztuczną wodę morską. Przez nerwy bukkalne przebij zwoj kilkoma szpilkami entomologicznymi, aby go ustabilizować. Usuń osłonkę zwoju bukkalnego za pomocą ultraprecezyjnej pęsety i nożyczek sprężynowych, aby odsłonić neurony do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Następnie ponownie przymocuj zwoj, używając około 15 drobnych szpilek entomologicznych (minutien). Zwoj musi być mocno unieruchomiony, ponieważ jakikolwiek ruch będzie utrudniał obrazowanie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie elektrod
<ol>
 <li>Wytwarzaj elektrody, wykorzystując szklane kapilary z włóknem (np. WPI TW100F-4) oraz wyciągacz. Ustawienia urządzenia należy dobrać indywidualnie, aby uzyskać elektrody o wymaganej rezystancji. Po napełnieniu 3 M KAc (octan potasu) rezystancja naszych elektrod wynosi zazwyczaj około 10 MOhms w przypadku elektrod ściętych lub około 5 MOhms, jeśli pominięto etap ścięcia końcówki.</li>
 <li>Napełnij jeden zestaw elektrod roztworem zawierającym 3 M KAc/30 mM KCl, używając strzykawki i igły microfil. Elektrody te będą wykorzystywane do elektrofizjologii.</li>
 <li>Napełnij drugi zestaw elektrod barwnikiem wskaźnikiem wapnia, zanurzając tylny koniec elektrody w barwniku, uprzednio rozpuszczonym w ok. 40 μl wody destylowanej na 500 μg barwnika. Po napełnieniu końcówki elektrody, wypełnij ok. 1/4 cala tylnego końca elektrody roztworem 200 mM KCl, aby zapewnić dobry kontakt elektryczny.</li>
 <li>Zaleca się ścięcie końcówek elektrod, ponieważ ułatwia to wstrzykiwanie barwnika i zmniejsza uszkodzenia powodowane przez wielokrotne penetracje błony. Używamy specjalistycznego urządzenia do ścięcia, które generuje strumień zawiesiny wody zasolonej i proszku tlenku glinu. Elektrodę montuje się w uchwycie, a jej końcówka wchodzi w strumień pod kątem 45°. Rezystancja elektrody jest stale monitorowana, a proces ścięcia kończy się, gdy rezystancja osiągnie około 5 MOhm dla elektrod napełnionych KAc. Elektrody napełnione barwnikiem są ścięte przez taki sam czas i zazwyczaj mają rezystancję 15-20 MOhm.</li>
</ol>
3. Obciążanie barwnikiem wskaźnikowym wapnia
<ol>
 <li>Umieść preparat na zestawie do elektrofizjologii i zlokalizuj wizualnie interesujący Cię neuron presynaptyczny. Wiele z naszych eksperymentów przeprowadzono z wykorzystaniem zidentyfikowanego neuronu sensorycznego biorącego udział w karmieniu, B21 5, 6. Stosunkowo stała pozycja, rozmiar (~100 μm) i wydłużony kształt somy B21 ułatwiają jego lokalizację.</li>
 <li>Wbij elektrodę zawierającą barwnik wskaźnikowy wapnia w interesujący Cię neuron. Tożsamość B21 można zweryfikować, wbijając elektrodę w neuron postsynaptyczny B8. Depolaryzacja B21 prądem ~8 nA wywoła potencjały czynnościowe i spowoduje ułatwienie PSP w B8 7. </li>
 <li>Wstrzyknij barwnik do interesującego Cię neuronu presynaptycznego, podając impulsy hiperpolaryzujące (zazwyczaj -15 nA, 1 Hz, cykl pracy 75%) przez około 30 minut. Jeśli załadowanie barwnika przebiegnie pomyślnie, soma neuronu nabierze bladoróżowego koloru. Usuń elektrodę z barwnikiem, powoli wycofując ją z neuronu. </li>
 <li>Pozostaw preparaty na około 30 minut, aby barwnik mógł dyfundować do cienkich wypustek, które tworzą kontakty synaptyczne z neuronami następnymi. </li>
</ol>
4. Obrazowanie wapnia i rejestracja elektrofizjologiczna
<ol>
 <li>Umieść preparat na mikroskopie obrazującym. Szalkę z preparatem mocuje się na platformie chłodzącej za pomocą kawałków uszczelniającego sznura Permagum, który w przeciwieństwie do gliny pozostaje lepki po namoczeniu. Mikroskop ze stałym stolikiem ustawia ostrość poprzez przesuwanie obiektywu. Stolik pozostaje nieruchomy, co umożliwia zamocowanie manipulatorów z magnesami. Ponieważ przy dużym powiększeniu problemem stają się wibracje (zwłaszcza ruchy boczne), cały układ obrazujący powinien zostać umieszczony na platformie izolującej od wibracji. </li>
 <li>Wprowadź elektrody zawierające standardowy roztwór elektrolitu do neuronów presynaptycznych i postsynaptycznych.</li>
 <li>Wybierz blok filtrów odpowiedni do obrazowania Calcium Orange (pobudzenie 549 nm, emisja 576 nm) 8 i dostrój kamerę. Większość naukowych kamer CCD pozwala badaczowi na wybór podzbioru odczytywanych komórek CCD. Dodatkowo komórki mogą być łączone (binning). Wybór mniejszego podzbioru zwiększa szybkość, natomiast binning zwiększa czułość. Te dwa ustawienia, wraz z czasem naświetlania, określają częstotliwość klatek, czyli liczbę obrazów, jakie można pozyskać w ciągu sekundy. Odpowiednie ustawienia pozwolą na obrazowanie obszaru 580 x 350 μm2 przy rozdzielczości 500 x 300 pikseli (przy użyciu obiektywu 10x i adaptera kamery 0,5x). Dodaj filtry neutralnoprzepuszczalne do toru światła, aby dostosować intensywność oświetlenia do minimalnej wartości zapewniającej poprawną ekspozycję przy czasie naświetlania &lt;25 ms. Ustawienia te powinny skutkować częstotliwością klatek około 30 Hz – co w przypadku Aplysia jest wystarczająco szybkie, aby obrazować zmiany poziomu wapnia wywołane pojedynczym kolcem. Na koniec przymknij przysłonę pola, aby oświetlony był tylko obrazowany obszar. </li>
 <li>W oprogramowaniu do obrazowania zaznacz obszary neuronów, które chcesz zmierzyć. W oprogramowaniu Elements AR wykonuje się to w sekcji „Time Measurement”, wyznaczając obszary zainteresowania (ROI). B21 jest neuronem bipolarnym, a wcześniejsze prace wykazały, że jego wypustka boczna kontaktuje się z badanym neuronem postsynaptycznym 9. Zazwyczaj obrazujemy gałęzie pierwotne, wtórne i trzeciorzędne wypustki bocznej, umieszczając ROI nad każdą częścią neuronu. Dodatkowo mierzy się ROI obok neuronu wypełnionego barwnikiem, aby uzyskać wartość tła, która jest później odejmowana od wszystkich pozostałych punktów danych.</li>
 <li>Skonfiguruj system akwizycji elektrofizjologicznej (w tych eksperymentach Spike II), aby oczekiwał sygnału wyzwalającego dostarczanego przez sygnał „frame readout” kamery. Rozpocznij akwizycję obrazu (Elements AR); program Spike II automatycznie rozpocznie rejestrację w momencie, gdy kamera wykona pierwszą klatkę. Można również wykorzystać wyjście TTL modułu Power 1401 do krótkotrwałego włączenia diody LED zamontowanej w porcie kamery mikroskopu. Dostarczy to sygnału do późniejszej synchronizacji danych obrazowych i elektrofizjologicznych. </li>
 <li>Stymuluj neuron presynaptyczny, wstrzykując serię krótkich depolaryzujących impulsów prądowych z pożądaną częstotliwością. Ważne jest monitorowanie każdego impulsu (np. za pomocą oscyloskopu wyzwalanego stymulacją), aby określić, czy potencjał czynnościowy został pomyślnie wygenerowany. Chociaż Calcium Orange jest bardzo fotostabilny w porównaniu z innymi barwnikami, warto przeprowadzić próbę kontrolną bez stymulacji, aby sprawdzić stopień wybielania barwnika.</li>
 <li>W eksperymentach, w których manipuluje się wewnątrzkomórkowym stężeniem wapnia, do neuronu presynaptycznego wprowadza się lek, taki jak EGTA, a następnie powtarza się opisane powyżej kroki stymulacji i akwizycji danych.</li>
</ol>
5. Analiza reprezentatywnych danych
<ol>
 <li>Eksportuj dane obrazowania (listę zmierzonych wartości intensywności dla każdego ROI), zapisując je w pliku tekstowym. Następnie za pomocą niestandardowego skryptu w Spike II można zaimportować ten plik tekstowy. Skrypt ten normalizuje również wartości względem powierzchni poszczególnych sond oraz odejmuje wartość sondy tła. Punkty danych są następnie naniesione obok danych elektrofizjologicznych jako kanał „virtual RealWave”. Do precyzyjnego wyrównania punktów danych obrazowania, z wykorzystaniem sygnału LED jako referencji, służy funkcja „channel process / time shift” w programie Spike II.</li>
 <li>Aby uzyskać wartości jako procentową zmianę, przeanalizuj dane obrazowania, obliczając względną zmianę fluorescencji jako dF/Fo= (F-Fo)/ Fo. Fo oznacza poziom fluorescencji tuż przed stymulacją, a F fluorescencję podczas stymulacji.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Schemat sieci neuronalnej, zwoj jamowy, połączenie B21-B8, potencjał czynnościowy, analiza sygnału ΔF." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ogólny schemat eksperymentu. Eksperymenty są prowadzone na preparacie zwoju Aplysia. Zmiany stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego są obrazowane za pomocą barwnika fluorescencyjnego, który jest wprowadzany do neuronu presynaptycznego metodą jontoforezy. Następnie neurony presynaptyczne i postsynaptyczne są nakłuwane ostrymi elektrodami, aby umożliwić indukcję i monitorowanie transmisji synaptycznej.
<img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Analiza aktywności neuronalnej; obraz z mikroskopii konfokalnej, intensywność fluorescencji, wykres amplitudy PSP." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obrazowanie wapnia i rejestracja wewnątrzkomórkowa z zidentyfikowanych neuronów w zwoju gębowym Aplysia. (A) Zdjęcie obrazowanej gałęzi bocznej neuronu B21. Ramka wskazuje mierzony obszar zainteresowania (ROI). (B1) Stymulacja wewnątrzkomórkowa B21 wywołuje potencjały czynnościowe (dolny ślad) i ułatwiające potencjały postsynaptyczne (PSP) w postsynaptycznym neuronie naśladowczym B8 (środkowy ślad), co powoduje, że on również generuje potencjały czynnościowe. Wzrosty fluorescencji wapnia presynaptycznego przedstawiono na górnym śladzie. (B2) Wpływ presynaptycznego EGTA na ułatwienie homosynaptyczne. EGTA wstrzyknięto wewnątrzkomórkowo do B21 około 15 minut przed stymulacją wewnątrzkomórkową. Przyjmuje się, że EGTA jest wolno działającym chelatorem wapnia, który w niskich stężeniach nie działa wystarczająco szybko, aby zahamować transmisję synaptyczną. Zauważalny jest spadek rozległego sygnału wapnia oraz odpowiadający mu spadek amplitudy PSP. (C) Amplituda PSP koreluje z presynaptycznym sygnałem wapnia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.

<ol><li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li>
<li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators%3A+Calcium+green%2C+calcium+orange+and+calcium+crimson%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophysical+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li>
<li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators%3A+rapid+transient+response+to+flash+photolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li>
<li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2%2B+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li>
<li>Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li>
<li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22The+Handbook%22">The Handbook</a>. , 10th edition, Invitrogen. (2005).</li>
<li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li>
<li>Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldberg%2C+JH+%22Imaging+in+Neuroscience+and+Development%22">Imaging in Neuroscience and Development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Prezentujemy techniki, które mogą być wykorzystane do jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia oraz oceny skuteczności transmisji synaptycznej. Techniki te są przydatne w określaniu mechanizmów pośredniczących w różnych formach plastyczności krótkotrwałej.
Obrazowanie jest przeprowadzane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i kamery CCD. Wymagania sprzętowe są stosunkowo niewielkie w porównaniu do większości układów do obrazowania funkcjonalnego. Technika ta jest pro...

<table><tbody><tr><td>Calcium Orange</td><td>Invitrogen</td><td>C-3013</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw buforów do kalibracji wapnia</td><td>Invitrogen</td><td>C-3008MP</td><td>Przydatne do testowania czułości i zakresu dynamicznego sygnału</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Prosimy o podanie tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Wykorzystane odczynniki.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>pionowy mikroskop fluorescencyjny FN-1</td><td>Nikon Instruments</td><td>z użyciem stolika Narishige ITS-FN1</td><td></td></tr><tr><td>Manipulatory NMN-21</td><td>Narishige</td><td>zamocowany na stoliku za pomocą magnesów</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; kamera CCD</td><td>Fotometria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elementy NIS AR</td><td>Nikon Instruments</td><td>użyliśmy wersji 3.22</td><td></td></tr><tr><td>obiektyw Plan Fluor 10X/0.3w</td><td>Nikon Instruments</td><td>ten obiektyw immersyjny posiada bardzo dużą odległość roboczą wynoszącą 3,5 mm</td><td></td></tr><tr><td>lampy metalohalogenowej X-Cite 120 PC</td><td>EXFO</td><td>stosowany do obrazowania fluorescencyjnego</td><td></td></tr><tr><td>lampa halogenowa LS-DWL</td><td>Sumica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zestaw filtrów ET-CY3</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik A/C Power 1401</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>próbkowanie odbywało się z częstotliwością 3 kHz</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Spike II</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>użyliśmy wersji 7.07</td><td></td></tr><tr><td>wzmacniacz SEC-10 LX</td><td>elektronika NPI</td><td>stosowane z przedwzmacniaczem głowicowym 10X</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz model 410</td><td>precyzja Brownlee</td><td>wykorzystywane do wzmacniania i filtrowania sygnału</td><td></td></tr><tr><td>WS-4</td><td>technologia minus k</td><td>izolacja wibracyjna w obrazowaniu</td><td></td></tr><tr><td>platforma chłodząca</td><td>wykonany na zamówienie</td><td>mosiężna płyta, przez którą pompowana jest lodowata woda ze zmienną prędkością przepływu</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przetłumaczenia materiałów z języka angielskiego na polski, zachowując rygorystyczne standardy terminologii akademickiej, dokładność protokołów badawczych oraz naturalny styl publikacji naukowych.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Wykorzystany sprzęt.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Sugeruje się, że zmiany poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego pośredniczą w indukcji wielu istotnych form plastyczności synaptycznej (np. facylitacji homosynaptycznej) 1. Hipotezy te można zweryfikować poprzez jednoczesne monitorowanie zmian stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego oraz zmian skuteczności synaptycznej. Demonstrujemy, w jaki sposób można to osiągnąć, łącząc obrazowanie wapnia z technikami rejestracji wewnątrzkomórkowej. Nasze eksperymenty są prowadzone w zwoju gębowym mięczaka Aplysia californica. Preparat ten posiada szereg zalet eksperymentalnych: zwoje można łatwo wyizolować z Aplysia, a w badaniach wykorzystuje się dojrzałe neurony, które tworzą prawidłowe połączenia synaptyczne i charakteryzują się typowym rozkładem kanałów jonowych. Ze względu na niski metabolizm zwierzęcia oraz stosunkowo niskie temperatury (14-16 °C), które są naturalne dla Aplysia, preparaty pozostają stabilne przez długi czas.
Aby wykryć zmiany w wewnątrzkomórkowym wolnym wapniu, zastosujemy wersję Calcium Orange 2 nieprzenikającą przez błony komórkowe, którą można łatwo wprowadzić do neuronu drogą iontoforezy. Gdy ten barwnik fluorescencyjny o długiej fali wiąże się z wapniem, intensywność fluorescencji wzrasta. Calcium Orange charakteryzuje się szybką kinetyką 3 i, w przeciwieństwie do barwników ratiometrycznych (np. Fura 2), nie wymaga koła filtrowego do obrazowania. Jest on dość fotostabilny i mniej fototoksyczny niż inne barwniki (np. fluo-3) 2,4. Podobnie jak wszystkie barwniki nieratiometryczne, Calcium Orange wskazuje względne zmiany stężenia wapnia. Jednak ze względu na brak możliwości uwzględnienia zmian stężenia barwnika wynikających z jego wprowadzania i dyfuzji, nie można go skalibrować w celu wyznaczenia bezwzględnych stężeń wapnia.
Do obrazowania neuronów wykorzystano pionowy mikroskop złożony ze stałym stolikiem oraz kamerę CCD zdolną do rejestracji około 30 klatek na sekundę. W przypadku Aplysia taka rozdzielczość czasowa jest w pełni wystarczająca, aby wykryć zmianę wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia wywołaną nawet pojedynczym potencjałem czynnościowym. Jednocześnie stosuje się mikroelektrody do indukowania i rejestrowania transmisji synaptycznej w zidentyfikowanych neuronach presynaptycznych i postsynaptycznych. Po zakończeniu każdej próby specjalny skrypt łączy dane z elektrofizjologii i obrazowania. Aby zapewnić odpowiednią synchronizację, wykorzystujemy impuls świetlny z diody LED zamontowanej w porcie kamery mikroskopu. Manipulacja poziomami wapnia presynaptycznego (np. poprzez wstrzyknięcie wewnątrzkomórkowego EGTA) pozwala nam testować konkretne hipotezy dotyczące roli wapnia wewnątrzkomórkowego w mediowaniu różnych form plastyczności.

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Sugerowano, że zmiany stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia pośredniczą w indukcji szeregu istotnych form plastyczności synaptycznej (np. ...

Wewnątrzkomórkowy wapń uznaje się za istotny element wielu mechanizmów plastyczności synaptycznej. Hipotezy te można zweryfikować poprzez jednoczesne monitorowanie zmian poziomu wapnia oraz zmian w skuteczności synaptycznej. W niniejszym materiale demonstrujemy, w jaki sposób można to osiągnąć, łącząc obrazowanie wapnia z rejestracją wewnątrzkomórkową.Nasze eksperymenty są przeprowadzane na zwoju mięczaka Aplysia Cahora. Preparat ten posiada szereg zalet, takich jak duże, zidentyfikowane neurony, niskie temperatury naturalne dla apia oraz wolne sygnały ułatwiające obrazowanie, jednak zaprezentowane przez nas ogólne techniki można z łatwością przenieść na inne systemy. Witam, nazywam się Colin Evans i pracuję w laboratorium Elizabeth Cropper w Departamencie Neuronauki Fishburg oraz w Instytucie Mózgu Freedman w Mount Sinai School of Medicine w Nowym Jorku.Dzisiaj zaprezentujemy jednoczesne obrazowanie zmian w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia oraz skuteczności synaptycznej w zwoju jamnym mięczaka Aplysia cahora. W celu wykrycia wapnia wewnątrzkomórkowego, w neuron presynaptyczny wstrzykniemy barwnik wskaźnikowy wapnia, calcium orange, który przenika przez błony komórkowe. Następnie preparat zostanie przeniesiony pod mikroskop, a neurony presynaptyczne i postsynaptyczne zostaną przebite ostrymi elektrodami.Powtarzająca się stymulacja presynaptyczna prowadzi do wzmocnienia odpowiedzi postsynaptycznej, widocznej jako wzrost potencjału postsynaptycznego lub amplitudy PSP. Pomiar sygnału fluorescencyjnego barwnika wskaźnikowego wapnia pozwoli nam wykryć jednoczesne zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w terminalu presynaptycznym. Aby rozpocząć, należy znieczulić dorosłe zwierzę o masie około 150 g, wstrzykując 75 ml izotonicznego roztworu chlorku magnezu, przytwierdzić znieczulone zwierzę do naczynia pokrytego woskiem, a następnie za pomocą pęsety chirurgicznej i nożyczek wykonać nacięcie w stopie zwierzęcia i odsłonić masę policzkową.Zwoje przełykowe znajdują się po stronie brzusznej masy przełykowej i składają się z dwóch połączonych półzwojów. Zawierają one kilkaset neuronów, które wraz z neuronami w innych zwojach przyczyniają się do generowania i kontrolowania zachowań pokarmowych zwierzęcia. Ostrożnie uwolnij zwoje, przecinając wszystkie nerwy przełykowe za pomocą cienkich nożyczek, a następnie usuń je ze zwierzęcia.Następnie przypnij uwolniony zwoj do dna naczynia z powłoką sil-guard wypełnionego sztuczną wodą morską. Zwoj jest owinięty osłoną z tkanki łącznej, którą należy usunąć, aby odsłonić poszczególne neurony. Używając pęsety precyzyjnej, nożyc irydowych i zachowując szczególną ostrożność, odetnij tę osłonę.Aby uniknąć uszkodzenia neuronów, należy ustabilizować zwoje pozaczaszkowe za pomocą szpilek w odstępach około 15 minut, ponieważ jakikolwiek ruch będzie problematyczny podczas obrazowania. W celu przygotowania ostrych elektrod do rejestracji wewnątrzkomórkowej i wstrzykiwania barwnika, należy wyciągnąć rurki kapilary za pomocą mikro-wyciągarki elektrod. Stosujemy cienkościenne włókna szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1 mm.Elektrody rejestrujące powinny mieć oporność około 10 MΩ po napełnieniu 3 M octanu potasu, dlatego odpowiednio ustawiamy wyciągacz do przygotowania elektrod D. Zanurz tył wyciągniętej elektrody w 10 mM roztworze barwnika Calcium Orange; działanie kapilarne wzdłuż szklanego włókna wewnątrz elektrody wciągnie barwnik do czubka, a następnie wypełnij elektrodę od tyłu 200 mM chlorkiem potasu, aby zapewnić dobry kontakt elektryczny. Używamy specjalnie zbudowanego urządzenia do polerowania (bleach), aby poprawić właściwości elektrody i obniżyć oporność elektrody rejestrującej do około 5 MΩ.Elektrodę utrzymuje się pod kątem 45 stopni w strumieniu zawiesiny tlenku glinu. Dodanie chlorku sodu do zawiesiny i podłączenie omometru umożliwia monitorowanie rezystancji elektrody. Podczas procesu skosowania przenosimy naczynie zawierające zwichnięte zwoje buckle na stanowisko do elektrofizjologii i lokalizujemy interesujące nas neurony, nakłuwając je elektrodami i weryfikując ich tożsamość.Aby przygotować neuron do obrazowania wapnia, najpierw wprowadzamy wypełnioną barwnikiem elektrodę do somy komórki i wprowadzamy barwnik drogą elektroforetyczną, stosując 30-minutowe impulsy prądu hiperpolaryzującego o natężeniu 15 nano amp. W miarę jak D calcium orange wnika do komórki, soma nabierze bladego różowego koloru. Następnie ostrożnie wycofujemy elektrody rejestrujące i pozostawiamy preparat na co najmniej 30 minut, aby barwnik mógł zdyfundować do cienkich wypustek neuronu.Następnie przenieś szalkę z preparatem pod mikroskop fluorescencyjny. Używamy obiektywu z zanurzeniem w wodzie o powiększeniu 10x i NA 0,3 w mikroskopie z pionową platformą stałą, w którym ostrzenie odbywa się poprzez przesuwanie obiektywu, a nie stolika. Ułatwia to montaż manipulatorów.Dla elektrod rejestrujących należy wybrać odpowiedni blok filtrów. Blok trzech filtrów SI zapewni prawidłowe filtry wzbudzenia i emisji dla barwnika calcium orange; należy dostosować parametry kamery oraz natężenie oświetlenia za pomocą filtrów neutralnych i przysłony pola. Zwiększenie ilości światła pozwoli zredukować szum, ale może potencjalnie doprowadzić do wybielenia preparatu.Kamera CCD CoolSnap może rejestrować pole widzenia o rozmiarach 500 na 300 pikseli przy częstotliwości klatek wynoszącej około 30 klatek na sekundę oraz z dobrym stosunkiem sygnału do szumu. Należy zminimalizować oświetlenie neuronów fil, utrzymując migawkę źródeł światła w pozycji zamkniętej, gdy tylko jest to możliwe. W oprogramowaniu do obrazowania należy zaznaczyć obszary zainteresowania (ROI).Obszary te określają miejsca, w których oprogramowanie będzie wykonywać pomiary intensywności. Zazwyczaj obrazujemy gałęzie pierwotne, wtórne i trzeciorzędne neuronu presynaptycznego. Umieść dodatkowy ROI obok neuronu difi, aby uzyskać wartość tła, która zostanie później odjęta od wszystkich pozostałych punktów danych.Do indukowania i monitorowania przekaźnictwa synaptycznego stosuje się elektrody do rejestracji wewnątrzkomórkowej w neuronach presynaptycznych i postsynaptycznych. Synchronizację między akwizycją danych elektrofizjologicznych a obrazowaniem można zapewnić, wykorzystując sygnał wyzwalający klatki (frame out trigger) kamery do uruchomienia oprogramowania do akwizycji danych. Innym sposobem zapewnienia synchronizacji jest zamontowanie diody LED w porcie kamery.Ta dioda LED jest włączana na krótko na początku sesji rejestracji, co zapewnia znacznik synchronizacji. Podczas typowego eksperymentu wywołuje się potencjały czynnościowe w neuronie presynaptycznym poprzez wstrzyknięcie krótkich impulsów prądowych. W tym przykładzie przedstawiamy serię impulsów (burst) oraz odpowiadające im wzrosty sygnału wapniowego w celu przetestowania konkretnych hipotez.Sygnał wapniowy może być manipulowany w celu określenia jego wpływu na przekaźnictwo synaptyczne. Na przykład leki, takie jak chelator wapnia EGTA, mogą być wstrzykiwane presynaptycznie lub podawane za pomocą systemu perfuzji. Dane analizuje się poprzez eksport z oprogramowania do obrazowania do pliku tekstowego, a następnie do oprogramowania wykorzystywanego do pozyskiwania danych elektrofizjologicznych, którym w naszym przypadku jest spike2 firmy Cambridge Electronic Design.Używamy napisanego na zamówienie skryptu do wykresowania wartości intensywności ROI i odpowiadających im zmian potencjału błony oraz do ilościowego określenia zmian w sygnale wapniowym poprzez odjęcie sygnału tła uzyskanego z ROI tła i obliczenie względnej zmiany za pomocą przedstawionego równania. F zero to fluorescencja bezpośrednio przed stymulacją, a F to fluorescencja podczas stymulacji. Poniżej przedstawiamy wyniki eksperymentu, w którym obrazowano zmiany fluorescencji wapnia w zidentyfikowanym neuronie B 21.Obszar, który obrazowano, wskazano w A; w B 1 wywołaliśmy serię impulsów (spikes) w B 21, co wywołało potencjały postsynaptyczne w B 8 oraz zmianę sygnału wapniowego. B 2 przedstawia efekt wstrzyknięcia chelatora wapnia EGTA; impulsy w B 21 nie wywołują już rozległych wzrostów fluorescencji wapnia, a amplituda potencjału postsynaptycznego ulega zmniejszeniu.Podsumowując, zaprezentowaliśmy techniki, które można wykorzystać do jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia oraz oceny skuteczności przekaźnictwa synaptycznego. Techniki te wymagają jedynie skromnego wyposażenia w porównaniu do większości metod obrazowania funkcjonalnego, a ich opanowanie jest łatwe i szybkie.

monitoring-changes-intracellular-calcium-concentration-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Monitorowanie zmian w stężeniu wapnia wewnątrzkomórkowego i skuteczności synaptycznej w mięczakach Aplysia

Pierwotne kultury neuronów czuciowo-ruchowych Aplysia stanowią modelowe przygotowanie do badania powstawania synaps i plastyczności synaps in vitro.  Film ten przedstawia identyfikację i mikrodysekcję neuronów czuciowych i ruchowych z Aplysia ganglia, a także metody tworzenia i utrzymywania neuronów czuciowo-ruchowych w hodowli.

Przygotowanie kultur czuciowo-ruchowych komórek neuronalnych Aplysia

Opisano technikę implantacji czterech elektrod in vivo w celu monitorowania neuromięśniowej kontroli zachowania żerowania u Aplysia californica.

Wytwarzanie i implantacja elektrod u Aplysia californica do wielokanałowych rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej u nienaruszonych zwierząt w swobodnym zachowaniu

Doświadczenia te prezentują prosty sposób, dzięki któremu studenci mogą zdobyć doświadczenie w badaniu struktury mięśni, odpowiedzi synaptycznych oraz wpływu gradientów jonowych i przepuszczalności na potencjały błonowe. Przedstawiono również obwód sensoryczny-OUN-motoryczny-mięśniowy, aby pokazać metodę testowania wpływu związków chemicznych na obwód neuronalny.

Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raka rzecznego: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Poznaj metodę jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego wapnia i skuteczności synaptycznej u Aplysia. Wykorzystuje się tu obrazowanie wapnia z barwnikiem Calcium Orange oraz wewnątrzkomórkowe rejestracje elektrodami.

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Przeglądaj więcej filmów