Name: Badania kliniczne i usunięcie rdzenia kręgowego w mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Poznaj ocenę kliniczną i behawioralną myszego modelu ALS z wykorzystaniem testów rotarod i hanging wire oraz technikę preparatyki rdzenia kręgowego do analizy immunohistochemicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LT otrzymał wsparcie grantowe z programu Forschungsförderungsprogramm Uniwersytetu Medycznego w Getyndze. PL i MB otrzymali wsparcie z Centrum Badań nad Fizjologią Molekularną Mózgu (CMPB) DFG w Getyndze. Autorzy dziękują dr Larsowi Tatenhorstowi za pomoc w realizacji nagrań wideo oraz Birgit Liebau za pomoc w montażu audio i wideo.

Zwierzęta zakupiono w Jackson Laboratory (# 002726) 1. Poddano je ocenie klinicznej oraz testowi funkcji motorycznych (test rotarod) i sile mięśniowej (test zwisania na drucie). Wszystkie te badania, a także późniejsze uśmiercenie zwierząt w celu przygotowania rdzenia kręgowego, zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi prawidłowego przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach. 
1. Wynik kliniczny 
Oprócz oceny masy ciała, myszy są badane pod kątem objawów deficytów motorycznych przy użyciu następującego 4-stopniowego systemu punktacji 2: 
4 punkty: norma (brak oznak dysfunkcji ruchowej)
3 punkty: drżenia kończyn tylnych są widoczne podczas zawieszenia za ogon
2 punkty: występują nieprawidłowości w chodzie
1 punkt: ciągnięcie co najmniej jednej kończyny tylnej
0 punktów: symetryczny paraliż, niezdolność do utrzymania równowagi lub utrata 20% maksymalnej masy ciała; w takim przypadku zwierzęta są natychmiast uśmiercane, a eksperyment zostaje zakończony
2. Testy funkcji motorycznych i siły mięśniowej
Zawieszenie drutu
Test ten jest stosowany do oceny siły mięśniowej 3, 4. Wszystkie zwierzęta przechodzą ten test co najmniej jeden lub dwa dni po teście rotarod. Każda mysz jest umieszczana na wykonanej na zamówienie drucianej pokrywie z odstępami 0,8 cm i ostrożnie obracana do góry nogami, 60 cm nad dnem wyłożonym słomą. Po trzech kolejnych sesjach treningowych trwających co najmniej 180 s mierzy się czas do spadnięcia. Każdej myszy przysługuje do trzech prób utrzymania się na odwróconej pokrywie przez maksymalnie 180 s, a rejestrowany jest najdłuższy czas.
Test Rotarod
Aparat rotarod (Ugo Basile, Comerio, Włochy) został wykorzystany do pomiaru koordynacji ruchowej, równowagi oraz zdolności uczenia się motorycznego 3, 4. Dobry wynik wymaga wysokiego stopnia koordynacji sensoryczno-motorycznej. Urządzenie należy umieścić w spokojnym środowisku, wolnym od zakłóceń, aby uniknąć bodźców rozpraszających dla badanego zwierzęcia. Aparat składa się z kontrolowanego komputerowo, napędzanego silnikiem obracającego się wrzeciona oraz pięciu torów dla pięciu myszy. Upadki myszy są wykrywane automatycznie poprzez nacisk na plastikową płytkę znajdującą się na dole. Po trzykrotnym treningu przez co najmniej 180 s przy stałej prędkości 15 r.p.m. mierzy się czas, przez który zwierzę jest w stanie utrzymać się na obracającym się pręcie. Każde zwierzę przechodzi trzy próby, a rejestrowany jest najdłuższy czas utrzymania się bez upadku. Czas 180 s wybrano jako czas odcięcia (cut-off time), ponieważ większość istotnych różnic w koordynacji ruchowej jest wykrywana w tym przedziale czasowym.
3. Przygotowanie rdzenia kręgowego
<ol class="lalpha">
 <li> Zwierzęta są uśmiercane poprzez insuflację CO2 zgodnie z lokalnymi wytycznymi, a następnie niezwłocznie poddawane perfuzji transkardialnej roztworem PBS, a następnie 4% roztworem paraformaldehydu. </li>
 <li> W celu przygotowania rdzenia kręgowego uśmierzonej myszy, zwierzę umieszcza się na stole operacyjnym, a cztery kończyny unieruchamia się po bokach, aby odsłonić stronę grzbietową myszy. </li>
 <li> Krótkie przemycie 70% roztworem etanolu oczyszcza miejsce sekcji i wygładza okrycie włosowe. </li>
 <li> Następnie skórę nacinamy ostrym skalpelem w linii pośrodkowej. Aby ułatwić cięcie, skórę rozciąga się na obie strony. Jeśli przygotowywane są mięśnie kończyn, należy naciąć również skórę nad nimi. </li>
 <li> Po zakończeniu nacięcia skóry, odciąga się ją pęsetą, aby odsłonić leżącą pod nią powięź powierzchowną ciała. </li>
 <li> Mięśnie szyi oraz więzadło karkowe muszą zostać usunięte i starannie przygotowane. Należy uważać, aby nie naciąć tkanek zbyt głęboko i nie uszkodzić rdzenia kręgowego. W celu lepszego odsłonięcia kręgosłupa można również usunąć mięśnie obręczy barkowej. </li>
 <li> Następnie z całego kręgosłupa usuwa się mięśnie przykręgowe. </li>
 <li> Aby otworzyć kanał kręgowy, należy wykonać kilka laminektomii. Należy rozpocząć od górnej części czaszkowej w obrębie stawu atlanto-potylicznego. </li>
 <li> Najłatwiej jest zwolnić unieruchomienie dwóch górnych kończyn i nadmiernie rozciągnąć szyję, aby móc sprawniej przeprowadzić laminektomię pierwszych kręgów. Są one odsuwane bez dotykania odsłoniętego rdzenia kręgowego szyjnego. </li>
 <li> Kolejne kręgi usuwa się, najpierw przecinając łuki kręgowe po obu stronach nożyczkami kątowymi, a następnie pociągając za wyrostki kolczyste. Pozostałe boczne części kręgów powinny zostać usunięte, aby ułatwić późniejsze całkowite wyjęcie rdzenia kręgowego. </li>
 <li> Punktem orientacyjnym w obrębie lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego jest zgrubienie, które występuje również w odcinku szyjnym. </li>
 <li> Po zakończeniu laminektomii całego rdzenia kręgowego, należy upewnić się, że przecięto wszystkie korzenie przednie i uwolniono rdzeń kręgowy z opony twardej opon mózgowo-rdzeniowych. </li>
 <li> Następnie rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym przecina się kranialnie i rozpoczyna jego usuwanie. </li>
 <li> Na koniec rdzeń kręgowy przecina się również w dystalnej części ogona końskiego, aby całkowicie go uwolnić. </li>
 <li> Ostatecznie rdzeń kręgowy umieszcza się na noc w roztworze postfixującym (np. 4% paraformaldehyd), po czym można go dalej przetwarzać. Zazwyczaj wykonujemy kriosieki rdzenia kręgowego w celu przygotowania go do analizy immunohistologicznej. 
   </li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Tematem niniejszego artykułu wideo jest technika przygotowania rdzenia kręgowego. Jest ona niezbędnym warunkiem wstępnym do późniejszego krojenia tkanek, a w konsekwencji do analizy immunohistologicznej przekrojów rdzenia kręgowego. Jako przykład końcowego rezultatu zaprezentowano analizę immunohistochemiczną obszaru rogu przedniego rdzenia kręgowego odcinka lędźwiowego myszy typu dzikiego (wt) oraz myszy z transgenezem SOD G93A (tg). Neurony ruchowe można zidentyfikować za pomocą pierwotnego przeciwciała anty-ChAT i następującego po nim znakowania fluorescencyjnego wtórnym przeciwciałem Cy3. Dodatkowo wykonano barwienie przeciwjądrowe DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol) (Rycina 1).
<img src="/files/ftp_upload/3936/3936fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna tkanek rogu przedniego ukazująca porównanie barwień ChAT i DAPI." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Fluorescencyjne mikrofotografie obrazujące immunodetekcję motoneuronów z użyciem przeciwciała anty-ChAT (czerwony) oraz kontrastowe barwienie jąder komórkowych DAPI (niebieski) w rogu przednim lędźwiowego rdzenia kręgowego myszy typu dzikiego (wt) (po lewej) oraz myszy transgenicznej (tg) SOD G93A (po prawej) w wieku 130 dni. Pasek skali: 40 μm.
Ponieważ analiza immunohistochemiczna myszy SOD G93A nie jest głównym przedmiotem niniejszego artykułu, prosimy o zapoznanie się z oryginalną publikacją, w której scharakteryzowano te myszy transgeniczne, oraz z nowszymi pracami badającymi podejścia terapeutyczne 1, 5, 6. W przypadku konieczności rozróżnienia efektów terapeutycznych na poziomie immunohistologicznym należy zastosować jasno zdefiniowane algorytmy oceny ilościowej przy wsparciu oprogramowania stereologicznego (na przykład patrz 7).

<ol><li>Gurney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2C+Zn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).</li>
<li>Weydt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+disease+onset+and+progression+in+the+SOD1+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS.</a> Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).</li>
<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+strategies+for+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping strategies for mutant mice.</a> Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).</li>
<li>Miana-Mena, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+methods+to+characterize+the+G93A+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph.+Lateral+Scler.+Other+Motor+Neuron+Disord%22%5BJournal%5D)">Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS.</a> Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).</li>
<li>Zhong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+therapy+slows+ALS-like+disease+in+mice+by+transcriptionally+inhibiting+SOD1+in+motor+neurons+and+microglia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells.</a> J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).</li>
<li>Pitzer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-colony+stimulating+factor+improves+outcome+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).</li>
<li>Gowing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+proliferating+microglia+does+not+affect+motor+neuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+caused+by+mutant+superoxide+dismutase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase.</a> J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).</li>
<li>Scott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interpretation+of+studies+in+the+standard+murine+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">interpretation of studies in the standard murine model of ALS.</a> Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).</li>
<li>Turner, B. J., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenics%2C+toxicity+and+therapeutics+in+rodent+models+of+mutant+SOD1-mediated+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS.</a> Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).</li>
<li>Corse, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+testing+of+neuroprotective+neurotrophic+factors+in+a+model+of+chronic+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration.</a> Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).</li>
<li>Knippenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+behavioural+tests+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).</li>
<li>Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+disease+models+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular disease models and analysis.</a> Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).</li>
<li>Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-symptomatic+detection+of+chronic+motor+deficits+and+genotype+prediction+in+congenic+B6.SOD1%28G93A%29+ALS+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model.</a> Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).</li>
<li>Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+preclinical+animal+research+in+ALS%2FMND%3A+A+consensus+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting.</a> Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).</li>
<li>Boillee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+and+progression+in+inherited+ALS+determined+by+motor+neurons+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia.</a> Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Genetyczny model mysi SOD1 (G93A) jest cennym modelem zwierzęcym do badania przebiegu choroby z progresywną utratą motoneuronów, porównywalnej z ludzkim stwardnieniem zanikowym bocznym 8. W modelu tym oceniono szereg różnych schematów terapeutycznych, które stanowią podstawę do późniejszych badań w ramach klinicznych prób z udziałem ludzi 8-10. Aby móc wykryć istotne różnice w badaniu eksperymentalnym nad leczeniem u tych myszy, niezwykle ważne jest włączenie co najmniej 24 myszy z tych samych miotó...

<table><tbody><tr><td>Rota-Rod dla myszy</td><td>Ugo Basile</td><td># 47600</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie z wiszącym drutem</td><td>Wykonanie własne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół operacyjny, lampa operacyjna, rękawiczki ochronne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#8220;Iris&amp;#8221; nożyczki, zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Cohan-Vannas, proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikropinceta</td><td>Hammacher, Solingen, Niemcy</td><td>HWC 111-10</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel &amp;#8220;pr&amp;#228;zisa plus&amp;#8221;</td><td>Dahlhausen, K&amp;#246;ln, Niemcy</td><td>11.000.00.510, FIG 10</td><td></td></tr></tbody></table>

badania kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia zanikowego bocznego (als)

Clinical Testing and Spinal Cord Removal in a Mouse Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) to śmiertelna choroba neurodegeneracyjna prowadząca do postępującej degeneracji neuronów ruchowych. Szczyt zachorowań przypada na około 60. rok życia w przypadku postaci sporadycznej i około 50. rok życia w przypadku postaci rodzinnej. Ze względu na postępujący przebieg choroby 50% pacjentów umiera w ciągu 30 miesięcy od wystąpienia pierwszych objawów. W celu oceny nowych opcji terapeutycznych dla tej choroby opracowano genetyczne modele mysie ALS w oparciu o ludzkie mutacje rodzinne w genie SOD, takie jak mutacja SOD1 (G93A). Najważniejszymi aspektami, które należy ocenić w tym modelu, są całkowite przeżycie, przebieg kliniczny oraz funkcja motoryczna. W niniejszej pracy przedstawiamy ocenę kliniczną, demonstrujemy przeprowadzenie dwóch behawioralnych testów motorycznych i dostarczamy ilościowe systemy punktacji dla wszystkich parametrów. Ponieważ dogłębna analiza mysiego modelu ALS zazwyczaj wymaga badania immunohistochemicznego rdzenia kręgowego, szczegółowo prezentujemy jego przygotowanie z zastosowaniem metody laminektomii grzbietowej. Przedstawione zostały przykładowe wyniki histologiczne. Kompleksowe zastosowanie opisanych metod badawczych w studiach nad mysim modelem ALS umożliwi badaczom wiarygodne testowanie przyszłych opcji terapeutycznych, co może stanowić podstawę do późniejszych badań klinicznych z udziałem ludzi.

Model mysi stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) poddano badaniu klinicznemu i behawioralnemu. Jako warunek wstępny dla towarzyszącej analizy immunohistologicznej szczegółowo przedstawiono przygotowanie rdzenia kręgowego.

Badania kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) jest śmiertelną chorobą neurodegeneracyjną prowadzącą do postępującej degeneracji motoneuronów. Szczyt zachorowań przypada na około 60...

Witajcie, nazywam się Lar Turner. Jestem pracownikiem posydoktorskim w Katedrze Neurologii na Uniwersytecie w Ingham w Niemczech. Cześć, nazywam się Lin Gunda.Jestem studentem medycyny i w tym laboratorium przygotowuję swoją pracę dyplomową. Dzisiaj zaprezentujemy testy kliniczne modelu SODG 93, modelu stwardnienia bocznego zanikowego u myszy. Ponadto zademonstrujemy test funkcji motorycznych za pomocą tak zwanego rotarod oraz dodatkowy test funkcji motorycznych z wykorzystaniem chwytania drutu, aby następnie przeprowadzić analizę immunologiczną.Po testach funkcjonalnych myszy a s koniecznym zabiegiem jest usunięcie rdzenia kręgowego, nerwu STIC oraz mięśnia brzuchatego łydki. Chcemy szczegółowo przedstawić te procedury chirurgiczne, a na koniec zaprezentować przykładowe wyniki immunologiczne. Zanim jednak przejdziemy do nich, zacznijmy od testów klinicznych.Jest to swobodnie poruszający się dziki typ MOE, który nie wykazuje żadnych objawów klinicznych, takich jak drżenia mięśniowe czy niedowłady w naszym systemie klasyfikacji klinicznej. Odpowiadałoby to ocenie czwartej. Jest to transgeniczny MOE z ALS.We wczesnym stadium choroby występuje u niej silne drżenie prawej kończyny tylnej, co klasyfikuje ją jako wynik trzy E w skali SCORE. Silne nieprawidłowości w chodzie klasyfikują to zwierzę jako wynik dwa. Przeciąganie co najmniej jednej kończyny tylnej jest klasyfikowane jako kliniczny wynik jeden. W teście zawieszenia na drucie ocenia się ogólną siłę mięśniową kończyn. Każdą mysz umieszcza się na specjalnie wykonanym drucie i ostrożnie odwraca do góry nogami nad podłożem pokrytym słomą.Po przeprowadzeniu treningu trzykrotnie w odstępach co najmniej 180 sekund zmierzono czas do upadku. Każdej myszy dano maksymalnie trzy próby utrzymania się na odwróconej pokrywce przez maksymalnie 180 sekund i zarejestrowano najdłuższy czas. W porównaniu do myszy typu białego drutu po prawej stronie, transgeniczna mysz z blaszkami po lewej jest bardzo słaba i spada z pokrywki przed osiągnięciem wartości maksymalnej.Aparat Rotor rod służy do pomiaru koordynacji ruchowej, równowagi i zdolności uczenia się motorycznego. Dobry wynik wymaga wysokiego stopnia koordynacji sensoryczno-motorycznej. Urządzenie składa się z sterowanego komputerowo, napędzanego silnikiem obrotowego wrzeciona oraz pięciu torów dla pięciu myszy.Błędy myszy są wykrywane automatycznie poprzez nacisk na dolną plastikową płytę. Po trzech kolejnych treningach trwających co najmniej 180 s przy stałej prędkości 15 obrotów na minutę, mierzony jest czas, przez który zwierzę jest w stanie utrzymać się na obracającym się rotatorze. Każde zwierzę przechodzi trzy próby, a zapisywany jest najdłuższy czas utrzymania się bez upadku.Zdrowa mysz typu dzikiego po lewej stronie bez trudności przebiega na rotarodzie. W przeciwieństwie do niej, transgeniczna mysz αs mo po prawej stronie ma poważne problemy z samym utrzymaniem się na rotarodzie i po chwili ześlizguje się, co widać z perspektywy tyłu. Widoczne są poważne trudności w biegu lewej myszy retre.W porównaniu ze zdrową myszą wire tap, zwierzę to nie nadąża za prędkością rotarodu i nie jest w stanie odpychać się w górę kończynami HIN. W celu przeprowadzenia analizy immunochemicznej rdzenia kręgowego zwierzęta muszą zostać uśpione. Bardzo ważne jest, aby zawsze ściśle przestrzegać lokalnych wytycznych dotyczących prawidłowego przeprowadzania doświadczeń na zwierzętach.W tym kontekście, w tym bardzo uproszczonym przeglądzie kręgosłupa i otaczających go tkanek, przedstawiono główne struktury anatomiczne. Zwierzę zostanie ułożone na stronie brzusznej, a następnie przystąpimy do preparowania mięśni z worka grzbietowego. Po usunięciu tkanki mięśniowej uzyskamy dostęp do kręgosłupa, w którym znajduje się rdzeń kręgowy.Po uśmierceniu zwierzęcia i przeprowadzeniu perfuzji roztworem zawierającym paraformaldehyd, można usunąć rdzeń kręgowy. Zwierzę umieszcza się na stole operacyjnym, a kończyny unieruchamia się po bokach w celu odsłonięcia grzbietowej strony myszy. Zwierzę zostaje zwilżone, aby wygładzić okrycie włosowe i ułatwić następujące nacięcie skóry.W tym celu należy użyć ostrego skalpela. Należy starannie rozciągnąć skórę na obie strony. Aby ułatwić cięcie, należy przygotować mięsień kończyny.Należy również naciąć skórę. Po wykonaniu nacięcia skóry jest ona delikatnie odsuwana na bok. Po usunięciu mięśni kończyny oraz nerwu kulszowego za pomocą pęsety, przechodzimy do odsłonięcia rdzenia kręgowego, a zwierzę umieszczamy na nowym stole operacyjnym.W tym momencie można łatwo zidentyfikować czaszkę, szyję, mięśnie oraz kręgosłup. Po zidentyfikowaniu wszystkich tych struktur można przejść do kolejnego kroku. Należy usunąć mięśnie szyi oraz więzadło karkowe.Należy uważać, aby nie naciąć tkanek zbyt głęboko i nie uszkodzić kręgosłupa. W kolejnym kroku mięśnie przykręgosłupowe są całkowicie usuwane w celu odsłonięcia kręgosłupa. Aby uzyskać dostęp do kolumny kręgosłupa, konieczne jest wykonanie kilku ektomii.Zaczynamy od odcinka szyjnego kręgosłupa, w tym od stawu atlanto-potylicznego. Aby przeprowadzić laminektomię, musimy przeciąć łuk kręgowy, by móc usunąć wszystkie wyrostki kręgowe z trzonu kręgu. Jak wyjaśniono wcześniej, laminektomia rozpoczyna się od przecięcia łuków kręgowych.Następnie można odsunąć błonę. Ponownie należy uważać, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego, ponieważ do usunięcia pozostaje jeszcze wiele łuków kręgowych. Bardzo pomocne jest zastosowanie nożyczek kątowych i nacinanie kilku łuków kręgowych z obu stron jednocześnie.Następnie pociągnij za wyrostki grzbietowe, aby całkowicie usunąć łuki kręgosłupa i zbliżenie. Widać, że nożyczki muszą zostać ostrożnie wprowadzone najbardziej bocznie, po bokach kanału kręgowego. Pozostałe części boczne kręgosłupa należy usunąć, aby ułatwić późniejsze całkowite wyjęcie rdzenia kręgowego.Anatomicznymi punktami orientacyjnymi rdzenia kręgowego są tzw. poszerzenia szyjne i lędźwiowe. Po zakończeniu ektomii całego rdzenia kręgowego należy upewnić się, że przecięto wszystkie korzenie brzuszne rdzenia kręgowego i uwolniono go z twardej opony opon mózgowych. Następnie przecina się szyjny odcinek rdzenia kręgowego.Następnie powrócono do usuwania w kierunku czaszki. Rdzeń kręgowy należy dotykać bardzo ostrożnie, aby nie uszkodzić tej tkanki, ponieważ mogłoby to spowodować poważne ograniczenia podczas późniejszej analizy immunochemicznej. Usuwanie rdzenia kręgowego kontynuowano na poziomie piersiowym, a następnie przejście do części lędźwiowej.Następnie wykonuje się kolejne cięcie, tym razem z boku ogona konia. Teraz możemy go całkowicie uwolnić. Tutaj widać rdzeń kręgowy umieszczony bezpośrednio obok jego pierwotnego położenia w kolumnie RAL.Ostatecznie próbkę umieszcza się w roztworze Paraform Hyde do postfiksacji. Jako klasyczny przykład analizy immunohistochemicznej rdzenia kręgowego można zastosować przeciwciało rozpoznające cholinową acetylotransferazę w celu identyfikacji neuronów ruchowych w przednim rogu rdzenia kręgowego. Tutaj widoczna jest duża liczba neuronów ruchowych u zdrowego zwierzęcia typu dzikiego.W przeciwieństwie do tego, u transgenicznego zwierzęcia z ALS w stadium końcowym obserwuje się znacznie mniejszą liczbę neuronów ruchowych w rogu przednim. Oglądając ten artykuł wideo, powinni Państwo zapoznać się z podstawowym badaniem klinicznym SODG 93, modelu mysiego stwardnienia bocznego zanikowego.Zaprezentowano dwa testy behawioralne funkcji motorycznych: test rotora oraz test zwisania na drucie. Umożliwiają one rzetelną ocenę podstawowych funkcji motorycznych. Są one łatwe do przeprowadzenia, czułe w wykrywaniu deficytów motorycznych i efektywne czasowo.Główną częścią tego filmu jest demonstracja techniki preparowania rdzenia kręgowego. Metoda ta może oczywiście zostać zastosowana w każdym innym modelu choroby myszy i stanowi kluczowy etap dla późniejszej analizy immunochemicznej patologii choroby w rdzeniu kręgowym. Dziękujemy za oglądanie.Mamy nadzieję, że ten artykuł wideo okaże się pomocny w Państwa przyszłych eksperymentach.

clinical-testing-spinal-cord-removal-mouse-model-for-amyotrophic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Badanie kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia bocznego rdzenia kręgowego (ALS)

Transplantacja prekursorów neuronalnych jest obiecującą strategią ochrony i/lub zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych szyjnych neuronów ruchowych nerwu przeponowego w przypadku urazów rdzenia kręgowego (SCI) oraz w przebiegu stwardnienia bocznego zanikowego (ALS), będącego chorobą neuronów ruchowych. Przedstawiamy protokół dostarczania komórek do przedniego rogu szyjnego rdzenia kręgowego w gryzoniach w modelach ALS i SCI.

Wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Źródło:Pourshafie, N., et al. Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).W tym filmie mysz z rdzeniowym i opuszkowym zanikiem mięśni lub dotknięta SBMA przechodzi wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanych wektorów AAV (wektorów związanych z adeno) przenoszących plazmid kodujący terapeutyczne mikroRNA. Wektor wytwarza mikroRNA, które wiąże się ze zmutowanym...

Wstrzykiwanie rekombinowanych wektorów związanych z adenowirusem w mysim modelu rdzeniowego i opuszkowego zaniku mięśni

Ten protokół wideo opisuje czułą, niezawodną i szybką metodę oceny deficytów nerwowo-mięśniowych w transgenicznym mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego.

Szybki fenotypowy system punktacji neurologicznej do oceny postępu choroby w mysim modelu SOD1-G93A ALS

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Opisane tutaj jest etapowe, behawioralne podejście przesiewowe, które może być użyte do badania przesiewowego pod kątem związków wykazujących skuteczność in vivo na poznawcze i funkcjonalne zachowania motoryczne w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Metody te są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych związków pod kątem aktywności w zadaniach pamięci krótkotrwałej i roboczej.

Ocena spontanicznej przemiany, rozpoznawania nowych obiektów i zaciskania kończyn w transgenicznych mysich modelach β amyloidu i neuropatologii tau

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Ten protokół opisuje, jak stworzyć precyzyjną laminektomię do indukcji stabilnego uszkodzenia rdzenia kręgowego typu transsection w modelu mysim, z minimalnymi szkodami ubocznymi dla badań nad uszkodzeniem rdzenia kręgowego.

Indukcja całkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego typu transsection u myszy

Prezentujemy tutaj nowatorskie zautomatyzowane urządzenie do leczenia urazów rdzenia kręgowego dla myszy, które może dokładnie tworzyć modele urazów rdzenia kręgowego w różnym stopniu.

Zautomatyzowany impaktor do modelu kontuzyjnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy

Obecny protokół opisuje rozwój powtarzalnego mysiego modelu glejaka rdzenia kręgowego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych do przestrzeni międzykręgowej, oferując bardziej efektywne i mniej inwazyjne podejście do badań i rozwoju terapeutycznego.

Chirurgiczny przeszczep komórek nowotworowych do rdzenia kręgowego myszy

Atakie rdzeniowo-móżdżkowe poliglutaminowe są spowodowane ekspansjami CAG prowadzącymi do tworzenia białek predysponowanych do agregacji. Ten protokół opisuje produkcję wektorów, stereotaksyczne wprowadzenie oraz analizę inkluzji i utraty markerów neuronowych, zapewniając kontrolowaną platformę do badania mechanizmów i oceny ukierunkowanych terapii chorób neurodegeneracyjnych.

Choroba zwojów wzrokowych wywołana wirusem lentywirusowym jako prekliniczny model poliglutaminowyej rdzeniowo-móżdżkowej ataksji

Niniejszy artykuł opisuje metody podawania wewnątrz OUN dla terapii ukierunkowanych na OUN u dorosłych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem precyzji protokołu i umożliwienia powtarzanych wstrzykiwań. Zawiera wyniki badania walidacyjnego, w którym oligonukleotydy antysensowne zmniejszały ekspresję mutantnego SOD1 u modelowych myszy SOD1-ALS, co potwierdza przydatność tego podejścia w przedklinicznych badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Intrathekalne wstrzykiwanie SOD1-ASO do lędźwia w celu precyzyjnego celowania i predykcyjnej skuteczności ośrodkowej układu nerwowego (CNS) u ludzkich myszy SOD1-G93A ALS

Poznaj ocenę kliniczną i behawioralną myszego modelu ALS z wykorzystaniem testów rotarod i hanging wire oraz technikę preparatyki rdzenia kręgowego do analizy immunohistochemicznej.

Badania kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)

Przeglądaj więcej filmów