Badania kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)

Witajcie, nazywam się Lar Turner. Jestem pracownikiem postdoktorskim w Katedrze Neurologii na Uniwersytecie w Ingham w Niemczech. Cześć, nazywam się Lin Gunda.

Jestem studentem medycyny i w tym laboratorium przygotowuję pracę dyplomową. Dzisiaj zaprezentujemy testy kliniczne modelu SODG 93, modelu stwardnienia bocznego zanikowego u myszy. Ponadto zademonstrujemy test funkcji motorycznych z wykorzystaniem tak zwanego testu rotora, a dodatkowo kolejny test funkcji motorycznych z wykorzystaniem chwytu drutu, aby przeprowadzić analizę immunologiczną.

Po testach funkcjonalnych myszy a s niezbędnym krokiem jest usunięcie rdzenia kręgowego, nerwu STIC oraz mięśnia brzuchatego łydki. Chcemy szczegółowo zaprezentować te procedury chirurgiczne, a na koniec przedstawić przykładowe wyniki badań immunologicznych. Zatem zacznijmy najpierw od testów klinicznych.

Jest to swobodnie poruszająca się mysz typu dzikiego (MOE), która nie wykazuje żadnych objawów klinicznych, takich jak drżenie mięśni czy porażenia w naszym systemie klasyfikacji klinicznej. Byłby to wynik cztery. Jest to transgeniczna mysz ALS.

We wczesnym stadium choroby zwierzę wykazuje silne drżenie prawej kończyny tylnej, co klasyfikuje je jako wynik SCORE 3E. Ciężkie nieprawidłowości w chodzie klasyfikują to zwierzę jako wynik 2. Powlekanie przynajmniej jedną kończyną tylną jest klasyfikowane jako kliniczny wynik 1. W teście zawieszenia na drucie ocenia się ogólną siłę mięśniową kończyn. Każdą mysz umieszcza się na specjalnie wykonanym drucie i ostrożnie obraca do góry nogami nad podłożem pokrytym słomą.

Po trzykrotnym treningu, z którego każda sesja trwała co najmniej 180 s, zmierzono czas do upadku. Każdej myszy zapewniono do trzech prób utrzymania się na odwróconej pokrywce przez maksymalnie 180 s i zarejestrowano najdłuższy czas. W porównaniu do myszy typu dzikiego (white wire type) po prawej stronie, transgeniczna mysz z blaszkami po lewej stronie jest bardzo słaba i spada z pokrywki przed osiągnięciem wartości maksymalnej.

Aparat Rotarod służy do pomiaru koordynacji ruchowej, równowagi oraz zdolności do uczenia się motorycznego. Dobry wynik wymaga wysokiego stopnia sensoryczno-motorycznej koordynacji. Urządzenie składa się z kontrolowanego komputerowo, napędzanego silnikiem obracającego się wrzeciona oraz pięciu torów dla pięciu myszy.

Błędy myszy są wykrywane automatycznie poprzez nacisk na dolną plastikową płytę. Po trzykrotnym treningu trwającym co najmniej 180 s przy stałej prędkości 15 obrotów na minutę, mierzy się czas, przez który zwierzę jest w stanie utrzymać się na obracającym się rotarodzie. Każde zwierzę przechodzi trzy próby, a rejestrowany jest najdłuższy czas utrzymania się bez upadku.

Zdrowa mysz typu dzikiego po lewej stronie bez trudności biegnie na rotarodzie. W przeciwieństwie do niej, transgeniczna mysz a s mo po prawej stronie ma poważne problemy z utrzymaniem się na rotarodzie i po chwili ześlizguje się z niego, co widać z perspektywy tyłu. Widoczne są poważne trudności w bieganiu lewej myszy retre.

W porównaniu ze zdrową myszą wire tap, nie jest ona w stanie nadążyć za prędkością rotarodu i nie potrafi odpychać się w górę kończynami HIN. W celu przeprowadzenia analizy immunochemicznej rdzenia kręgowego zwierzęta muszą zostać uśpione. Bardzo ważne jest, aby zawsze ściśle przestrzegać lokalnych wytycznych dotyczących prawidłowego przeprowadzania doświadczeń na zwierzętach.

W tym kontekście, w tym bardzo uproszczonym przeglądzie kręgosłupa i otaczających go tkanek, przedstawiono główne struktury anatomiczne. Zwierzę zostanie ułożone na stronie brzusznej, a następnie przystąpimy do preparowania mięśni z worka grzbietowego. Po usunięciu tkanki mięśniowej uzyskamy dostęp do kręgosłupa, w którym znajduje się rdzeń kręgowy.

Po uśmierceniu zwierzęcia i przeprowadzeniu perfuzji roztworem zawierającym paraformaldehyd można usunąć rdzeń kręgowy. Zwierzę umieszcza się na stole operacyjnym, a kończyny unieruchamia się po bokach, aby odsłonić tylną część ciała myszy. Zwierzę zostaje zwilżone w celu wygładzenia okrywy włosowej i ułatwienia następującego nacięcia skóry.

W tym celu należy użyć ostrego skalpela. Należy uważać, aby rozciągnąć skórę na obie strony. W celu ułatwienia cięcia należy przygotować mięsień nogi.

Należy również naciąć skórę. Po wykonaniu nacięcia skórę delikatnie odsuwa się na bok. Za pomocą pęsety usuwamy mięśnie kończyny oraz nerw kulszowy, a następnie przechodzimy do odsłonięcia rdzenia kręgowego, kładąc zwierzę na nowym stole operacyjnym.

Obecnie można łatwo zidentyfikować czaszkę, szyję, mięśnie oraz kolumnę kręgosłupa. Po zidentyfikowaniu wszystkich tych struktur można przejść do kolejnego etapu. Należy usunąć mięśnie szyi oraz więzadło nuchalne.

Należy uważać, aby nie wykonać zbyt głębokiego nacięcia i nie uszkodzić kręgosłupa. W następnym kroku mięśnie przykręgowe zostaną całkowicie usunięte, aby odsłonić kręgosłup. Aby uzyskać dostęp do kolumny kręgowej, konieczne jest wykonanie kilku ektomii.

Zaczynamy od części szyjnej kręgosłupa, w tym stawu atlanto-potylicznego. Aby przeprowadzić laminektomię, należy przeciąć łuk kręgowy, co umożliwi usunięcie wszystkich wyrostków kręgowych z trzonu kręgu. Jak wyjaśniono wcześniej, laminektomia rozpoczyna się od przecięcia łuków kręgowych.

Następnie można odsunąć laminę. Ponownie należy uważać, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego, ponieważ do usunięcia pozostało jeszcze wiele łuków kręgowych. Bardzo pomocne jest zastosowanie nożyczek kątowych i nacinanie kilku łuków kręgowych po obu stronach jednocześnie.

Następnie pociągnij za wyrostki grzbietowe, aby całkowicie usunąć blaty łukowe kręgów oraz zbliżenie. Widać, że nożyczki muszą zostać ostrożnie wprowadzone najbardziej bocznie, przy ścianie kanału kręgowego. Pozostałe boczne części kręgosłupa muszą zostać usunięte, aby ułatwić późniejsze całkowite wyjęcie rdzenia kręgowego.

Punktami orientacyjnymi rdzenia kręgowego są tak zwane zgrubienia szyjne i lędźwiowe. Po zakończeniu wycięcia całego rdzenia kręgowego należy upewnić się, że przecięto również wszystkie korzenie przednie rdzenia kręgowego i oddzielono go od oponie twardej opon mózgowo-rdzeniowych. Następnie przecina się szyjny odcinek rdzenia kręgowego.

Proces usuwania rdzenia rozpoczyna się ponownie w kierunku czaszkowym. Rdzeń kręgowy należy dotykać bardzo ostrożnie, aby nie uszkodzić tej tkanki, ponieważ mogłoby to spowodować poważne ograniczenia w późniejszej analizie immunochemicznej. Usuwanie rdzenia kręgowego kontynuuje się na poziomie piersiowym, a następnie przechodzi do części lędźwiowej.

Następnie wykonuje się ponowne cięcie, tym razem po stronie ogona końskiego. Teraz możemy go całkowicie uwolnić. Tutaj widoczny jest rdzeń kręgowy umieszczony bezpośrednio obok jego pierwotnego położenia w kolumnie RAL.

Ostatecznie próbkę umieszcza się w roztworze Paraform Hyde do utrwalania. Jako klasyczny przykład immunohistochemicznej analizy rdzenia kręgowego można zastosować przeciwciało rozpoznające cholinową acetylotransferazę w celu zidentyfikowania neuronów ruchowych w rogu przednim rdzenia kręgowego. Tutaj widoczna jest duża liczba neuronów ruchowych u zdrowego zwierzęcia typu dzikiego.

W przeciwieństwie do tego, zwierzę transgeniczne LS w stadium końcowym wykazuje znacznie mniejszą liczbę neuronów ruchowych w rogu przednim. Oglądając ten artykuł wideo, powinni Państwo zapoznać się z podstawowym badaniem klinicznym modelu mysiego stwardnienia bocznego zanikowego SODG 93.

Zaprezentowano dwa testy zachowania ruchowego: test rotora oraz test zwisania z drutu. Pozwalają one na skuteczną ocenę podstawowych funkcji motorycznych. Są one łatwe w wykonaniu, wykazują wysoką czułość w wykrywaniu deficytów ruchowych i są efektywne pod względem czasowym.

Główną częścią tego filmu jest demonstracja techniki przygotowania rdzenia kręgowego. Metodę tę można oczywiście zastosować do każdego innego modelu choroby myszy; stanowi ona niezbędny etap dla późniejszej analizy immunochemicznej patologii choroby w rdzeniu kręgowym. Dziękujemy za uwagę.

Mamy nadzieję, że ten artykuł wideo okaże się pomocny w Państwa przyszłych eksperymentach.