Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony
February 15th, 2021
Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.
Badanie różnych obszarów mózgu jest krokiem w kierunku zrozumienia molekularnej i strukturalnej złożoności mózgu. Protokół ten opisuje systematyczną sekcję mózgu myszy w celu wyizolowania odrębnych regionów mózgu. W perspektywie anatomii mózgu jest to podejście odgórne, które można łatwo odtworzyć.
Zalety tego protokołu są dwojakie. Po pierwsze, podejście to daje możliwość zrozumienia molekularnych podstaw małych, ale krytycznych obszarów mózgu. Po drugie, cały proces preparacji jest wystarczająco krótki, aby zapewnić zachowanie integralności molekularnej, co jest krytycznym warunkiem wstępnym testów wstecznych i molekularnych.
Ta procedura wymaga praktyki i delikatnego obchodzenia się z nimi. Czas jest tutaj bardzo ważny dla utrzymania strukturalnych punktów orientacyjnych i można go osiągnąć dzięki odpowiedniemu szkoleniu i praktyce. Procedurę usuwania mózgu myszy zademonstruje Seid Muhie, chemik badawczy i bioinformatyk z naszego laboratorium.
Kolejnym dowodem na to, jak przebiegprzebiega sekcja mózgu myszy, będzie James Meyerhoff, neurobiolog z naszego laboratorium. Na początek oczyść i usuń skórę, aby uzyskać dobry chwyt. Zacisnąć szczękę odciętej głowy hemostatem i użyć gazy, aby odbić skórę głowy w sposób rostralny.
Włóż cienkie, zakrzywione nożyczki do otworu wielkiego, aby oddzielić przylegające opony. Następnie włóż nożyczki w otwór podstawy czaszki, gdzie przechodzi rdzeń kręgowy z ostrzem skierowanym pionowo, ale równolegle i dociskając do wewnętrznej powierzchni kości podstawy płytki, obracając ostrze o 45 stopni w lewą stronę, a następnie w prawą stronę. Usuń kość potyliczną w kości śródciemieniowej, aby odsłonić móżdżek.
Przesuwaj nożyczki rostralnie wzdłuż środkowego szwu strzałkowego aż do bregmy i przetnij je, podnosząc do góry, aby uniknąć uszkodzenia kory mózgowej. Gdy kości ciemieniowe są podnoszone, zidentyfikuj i odetnij pozostałe przyczepy opon mózgowych. Wykonaj dwa równoległe nacięcia w płaszczyźnie strzałkowej i usuń fragmenty kości czołowej, unikając uszkodzenia powierzchni mózgu.
Podczas przecinania przyczepów opon mózgowych i nerwów czaszkowych odwróć czaszkę, aby grawitacja pomogła w usunięciu mózgu do małego kubka wstępnie wypełnionego roztworem soli fizjologicznej. Utrzymuj pęcherz słuchowy w stanie nienaruszonym, aby anatomia przysadki była możliwa do zidentyfikowania. Wykonaj bardzo małe nacięcie przysadkowe po obu stronach w grzbiecie błoniastego namiotu, który utrzymuje przysadkę mózgową na swoim miejscu, i podnieś tylny płat przysadki za pomocą ultra cienkich kleszczy.
Wykonaj strzałkowe cięcie między bocznymi brzegami przedniego płata przysadki w najbliższym nerwie trójdzielnym, a następnie wyjmij przedni płat przysadki. Skieruj źródło białego światła na tkankę. Umieść mózg na wstępnie schłodzonym bloku ze stali nierdzewnej i utrzymuj go w niskiej temperaturze, otaczając go lodem w lodowatym roztworze soli.
Okresowo zwilżaj tkankę lodowatym roztworem soli, aby zachować struktury. Ustaw mózg tak, aby kora mózgowa była skierowana do góry. Za pomocą małych zakrzywionych kleszczy usuń móżdżek.
Korzystając z podejścia grzbietowego, wsuń zamknięte ostrza małego zakrzywionego kleszcza pod ciało modzelowate i delikatnie rozłóż je, aby cofnąć korę nową obustronnie, aby zachować krytycznie wydatne punkty orientacyjne w linii środkowej. Ostatecznie strona do góry widoczne byłyby struktury takie jak skrzyżowanie wzrokowe, podwzgórze, opuszki węchowe, rdzeń przedłużony, przysadka mózgowa i mostek mostowy. Spróbuj oddzielić półkule.
Odwróć brzuszne miejsce mózgu do góry i wykonaj środkowe cięcie strzałkowe, zaczynając od grzbietu między opuszkami węchowymi w półkulach mózgowych. Usuń rdzeń, a następnie delikatnie oddziel dwie półkule. Następnie wykonaj nacięcie koronalne na wewnętrznym brzegu stawów, aby uzyskać tylny mózg i oddzielić rdzeń na tylnym brzegu stawów.
Odwróć tkankę mózgową, aby ostrożnie oddzielić dwie półkule mózgowe. Na tym etapie usuń opuszkę węchową. Wykonaj nacięcie koronalne jeden milimetr przed przodem ciała modzelowatego i usuń dodatkowe opuszki węchowe, a następnie oddziel przyśrodkową i boczną korę przedczołową.
Częściowo przeciąć poziomo lub koronalnie przez poprzeczną część spoidła przedniego od linii środkowej poniżej rogu przedniego komory bocznej, aby uwolnić jądro przegrody grzbietowo i brzuszne prążkowie brzusznie. Usuń niewielką ilość kory z powierzchni bocznej, aby usunąć podatność jądra i guzek węchowy. Oddziel rostralną część ciała prążkowanego od leżącej nad nim kory za pomocą zakrzywionego skalpela wyciętego tuż na zewnątrz torebki zewnętrznej.
Zidentyfikuj jądra przegrody lub przegrodę i odizoluj je od tej sekcji. Na tym etapie wykonaj zakrzywione cięcie, aby oddzielić podwzgórze. Zostanie to wykonane za pomocą częściowego cięcia koronalnego za ciałami sutkowymi, rozciągającego się tylko tak daleko na boki, jak bruzda podwzgórza.
Następnie uwolnij przekrój podwzgórza za pomocą cięcia przystrzałkowego wzdłuż długości bruzdy podwzgórza. Evert komory bocznej, aby odsłonić dodatkowe połączenia wewnątrzlimbiczne w pozostałych elementach układu limbicznego. W wewnętrznej części kory wewnętrznej po otwarciu komory obserwuje się strukturę przypominającą wachlarz.
Użyj struktury przypominającej wachlarz w korze śródwęchowej, aby zdefiniować marginesy w celu sekcji, a następnie zidentyfikuj i usuń ciało migdałowate, korę śródwęchową, tylną korę obręczy i hipokamp. Potwierdź identyfikację wzgórza poprzez wizualizację prążka rdzenia na jego powierzchni grzbietowej rozciągającej się w linii środkowej kory rostralnej. Całkowicie oddziel wzgórze od środkowej części mózgu za pomocą cięcia koronalnego.
Protokół ten może być stosowany do natychmiastowego usunięcia mózgu z czaszki, a następnie sekcji. Wypreparowane tkanki mogą być zachowane i przetworzone później w zależności od wymagań badania. Wyekstrahowane RNA z wielu wypreparowanych tkanek można oznaczyć pod kątem ekspresji genów.
Reprezentatywne wyniki uzyskano przy użyciu pobranych mózgów, które były przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez kilka miesięcy przed ekstrakcją RNA. Odrębne regiony mózgu wraz z danymi dotyczącymi masy ciała zebrano w ramach badanego modelu stresu społecznego PTSD narażonego na agresora lub agresora. Stężenia RNA i odczyty spektrofotometryczne są pokazane tutaj.
Postępując zgodnie z tym protokołem, upewnij się, że tkanki są schłodzone przez cały czas, trzymając mózg na zamrożonym stalowym bloku i okresowo oblewając tkankę lodowatą solą fizjologiczną. Po pobraniu tkanek i ich natychmiastowym zamrożeniu można je później wykorzystać do testów, takich jak transkryptomika, metabolomika i proteomika.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
W tym artykule przedstawiono praktyczny, krok po kroku protokół usuwania i dissectacji mózgu myszy w celu wyizolowania odrębnych obszarów mózgu. Metoda ta zapewnia integralność molekularną tkanek, co ułatwia wysokiej jakości analizę transkryptomiczną krytycznych obszarów mózgu. Protokół został zaprojektowany tak, aby był prosty i łatwy do odtworzenia w badaniach molekularnych w nauce o mózgu.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Nauka o mózgu
- Anatomia mózgu
- Analiza molekularna
Tło
- Zrozumienie molekularnej i strukturalnej złożoności mózgu jest niezbędne dla postępu w nauce o mózgu.
- Dissectacja odrębnych obszarów mózgu umożliwia ukierunkowane badania molekularne.
- Zachowanie integralności tkanek podczas dissectacji jest kluczowe dla dalszych analiz.
- Szkolenie i praktyka są niezbędne do prawidłowego wykonania dissectacji.
Cel Badania
- Dostarczenie wydajnego protokołu dissectacji mózgu myszy.
- Umożliwienie analizy molekularnej małych, ale krytycznych obszarów mózgu.
- Poprawa jakości danych transkryptomicznych uzyskanych z dissectowanych obszarów mózgu.
Wykorzystane Metody
- Protokół obejmuje systematyczne usuwanie mózgu myszy ze szkieletu, a następnie dissectację specyficznych obszarów.
- Kluczowe kroki obejmują ostrożne cięcie i obchodzenie się, aby zachować struktury i zmaksymalizować integralność molekularną.
- Dissectowane tkanki są przetwarzane w celu ekstrakcji RNA i mogą być analizowane pod kątem ekspresji genów.
Główne Wyniki
- Protokół zapewnia szybką i precyzyjną dissectację obszarów mózgu myszy przy zachowaniu integralności molekularnej.
- Umożliwia ekstrakcję RNA do dalszych analiz transkryptomicznych, wzmacniając analizę molekularną.
- Ułatwia identyfikację i izolację struktur mózgu krytycznych dla dalszych badań.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza szczegółowej metodologii dissectacji mózgu myszy, która ma kluczowe znaczenie dla badań nad neuronauka molekularną.
- Zachowana tkanka może być wykorzystywana w badaniach transkryptomicznych, aby pogłębić zrozumienie funkcji mózgu.
- Implikacje rozciągają się na lepsze zrozumienie mechanizmów neuronalnych i potencjalne zastosowania w zrozumieniu chorób.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Precise anatomical dissection of mouse brain regions enables targeted molecular analysis critical for neuroscience target validation. This protocol supports phenotypic screening and mechanistic de-risking by isolating functionally relevant structures for downstream assays. Maintaining tissue integrity ensures reliable transcriptomic data for preclinical model development and biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through region-specific gene expression analysis.
- Operational Value: Provides anatomically defined samples for validating target engagement in disease-relevant systems.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular changes to specific brain structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for standardized assay development in neuropharmacology.
- Operational Value: Ensures reproducibility and quantitative outputs essential for screening campaign consistency.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple target classes and compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving region-specific molecular profiles.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions via consistent tissue preparation across studies.
- Translational Biomarker Alignment: Supports identification of region-specific biomarkers correlating with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization by enabling region-resolved molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via anatomically precise tissue isolation.
- Screening: Delivers assay-ready samples with preserved molecular integrity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative RNA expression readouts that facilitate cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through preserved structural and molecular context.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized dissection capability applicable across multiple neuroscience projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in brain region-specific studies.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability for multi-site neuroscience research programs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions through better target validation and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on region-specific molecular data from validated preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and microsurgical techniques for precise landmark identification.
- Dependent on instrumentation including fine curved scissors, forceps, and cooled dissection surfaces.
- Necessitates cross-team standardization of dissection protocols to ensure inter-laboratory reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different mouse strains or developmental stages.
- Limited by tissue degradation risks if dissection timing or temperature control is not maintained per protocol.
