Name: Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj protokół mikrodysekcji mózgu myszy umożliwiający izolację anatomicznie i funkcjonalnie różnych regionów. Metoda zachowuje integralność molekularną tkanek do analiz transkryptomicznych w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pani Seshmalini Srinivasan, Panu Stephenowi Butlerowi i Pani Pameli Spellman za pomoc w eksperymentach oraz Pani Dana Youssef za redakcję rękopisu. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony USAMRDC. Fundacja Genewska przyczyniła się do tych prac i była wspierana przez fundusze z Dyrekcji III Obszaru Badawczego Medycyny Wojskowej i Operacyjnej za pośrednictwem Biura Badawczego Armii Stanów Zjednoczonych.
Zastrzeżenie:
Materiał został sprawdzony przez Walter Reed Army Institute of Research. Nie ma zastrzeżeń co do jego prezentacji i/lub publikacji. Opinie lub twierdzenia zawarte w niniejszym dokumencie są prywatnymi poglądami autora i nie mogą być interpretowane jako oficjalne lub odzwierciedlające prawdziwe poglądy Departamentu Armii lub Departamentu Obrony. Badania przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonym protokołem wykorzystania zwierząt w placówce akredytowanej przez AAALAC zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt oraz innymi federalnymi ustawami i przepisami dotyczącymi zwierząt i eksperymentów na zwierzętach oraz przestrzegają zasad określonych w Przewodniku opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, publikacja NRC, wydanie z 2011 r.

<ol><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Architecture+of+the+Mouse+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Architecture of the Mouse Nervous System.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li>
<li>Ackerman, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAckerman%2C+S+%22Major+Structures+and+Functions+of+the+Brain%22">Major Structures and Functions of the Brain</a>. 2, National Academies Press. US. (1992).</li>
<li>P, T. L. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aP%2C+TLS+%22StatPearls%22">StatPearls</a>. , StatPearls Publishing. (2019).</li>
<li>Paramvir, T. L. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParamvir%2C+TLS+%22StatPearls%22">StatPearls</a>. , StatPearls Publishing. (2019).</li>
<li>Javed, K., Reddy, V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaved%2C+K+%22Neuroanatomy%2C+Cerebral+Cortex%22">Neuroanatomy, Cerebral Cortex</a>. , Treasure Island. (2020).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neocortex%3A+a+perspective+from+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).</li>
<li>Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cortex+expansion+and+folding%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned.</a> The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).</li>
<li>Pessoa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+brain+networks+and+brain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+of+Life+Reviews%22%5BJournal%5D)">Understanding brain networks and brain organization.</a> Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).</li>
<li>Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+Brain+Complexity+Using+Single-cell+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).</li>
<li>Darmanis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+human+brain+transcriptome+diversity+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).</li>
<li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li>
<li>Winrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+anatomical+isolation+of+functional+sleep+circuits+exhibits+distinctive+regional+and+circadian+gene+transcriptional+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles.</a> Brain Research. 1271, 1-17 (2009).</li>
<li>Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Laser+Capture+Microscopy+Approach+for+the+Microdissection+of+Discrete+Mouse+Brain+Regions+for+Total+RNA+Isolation+and+Downstream+Next-Generation+Sequencing+and+Gene+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3125(2011).</li>
<li>Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+Frozen+Rodent+Brain+Regions+for+Downstream+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60474(2020).</li>
<li>Muhie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+transcriptome+profiles+in+mouse+model+simulating+features+of+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder.</a> Molecular Brain. 8, 14(2015).</li>
<li>Hammamieh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+repeated+exposures+to+conspecific+trained+aggressors+simulates+features+of+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder.</a> Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.+Compact+3rd+edn%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn</a>. , Elsevier Academic Press. (2008).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Coronal+Plates+and+Diagrams%22">The Coronal Plates and Diagrams</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Slotnick, B. M., Leonard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+atlas+of+the+albino+mouse+forebrain.+Rockville%2C+MD%2C+Alcohol%2C+Drug+Abuse+and+Mental+Health+Administration%2C+1975%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975.</a> Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).</li>
<li>Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCajal%2C+SR+%22Histologie+Du+Syst%C3%A8me+Nerveux+de+L%27homme+Et+Des+Vert%C3%A9br%C3%A9s.+Anglais%22">Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais</a>. , Oxford University Press. (1995).</li>
<li>Spijker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Rodent+Brain+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromethods%22%5BJournal%5D)">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li>
<li>Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+Frozen+Rodent+Brain+Regions+for+Downstream+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60474(2020).</li>
<li>Sultan, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Different+Areas+from+Mouse+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus.</a> Bio Protocols. 3 (21), (2013).</li>
<li>Chakraborty, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+and+stress+history+interplay+in+emergence+of+PTSD-like+features%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features.</a> Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-dissection+of+rat+brain+for+RNA+or+protein+extraction+from+specific+brain+region%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).</li>
<li>Rajmohan, V., Mohandas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limbic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The limbic system.</a> Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mózg ssaków jest złożonym narządem złożonym z szeregu morfologicznie odrębnych i funkcjonalnie unikalnych komórek o różnych sygnaturach molekularnych i wielu regionach, które pełnią wyspecjalizowane i dyskretne funkcje. Opisana tutaj procedura preparacji może mieć wiele celów w zależności od wymagań laboratorium. W naszym laboratorium oceniliśmy transkrypcję w wielu regionach mózgu pobranych od myszy narażonych na PTSD, takie jak stres16 . Chcielibyśmy dalej badać wpływ tła genetycznego szczepu<su...

Mózg, wraz z rdzeniem kręgowym i siatkówką, tworzy centralny układ nerwowy, który wykonuje złożone zachowania, kontrolowane przez wyspecjalizowane, precyzyjnie rozmieszczone i oddziałujące typy komórek w całym ciele1. Mózg jest złożonym narządem z miliardami połączonych ze sobą neuronów i gleju z precyzyjnymi obwodami pełniącymi wiele funkcji. Jest to struktura obustronna z dwoma odrębnymi płatami i różnymi składnikami komórkowymi2. Rdzeń kręgowy łączy mózg ze światem zewnętrznym i jest chroniony przez kości, opony mózgowe i płyn mózgowo-rdzeniowy oraz kieruje wiadomości do i z mózgu2,3,4. Powierzchnia mózgu, kora mózgowa, jest nierówna i ma wyraźne fałdy, zwane zakrętami, i rowki, zwane bruzdami, które dzielą mózg na funkcjonalne centra5. Kora mózgowa jest gładka u ssaków z małym mózgiem6,7. Ważne jest, aby scharakteryzować i zbadać architekturę ludzkiego mózgu, aby zrozumieć zaburzenia związane z różnymi regionami mózgu, a także jego obwodami funkcjonalnymi. Badania neurobiologiczne rozszerzyły się w ostatnich latach, a do badania struktury i funkcji mózgu stosuje się różne metody eksperymentalne. Postępy w dziedzinie biologii molekularnej i systemowej zapoczątkowały nową erę badania złożonych relacji między strukturami mózgu a funkcjonowaniem molekuł. Ponadto biologia molekularna, genetyka i epigenetyka szybko się rozwijają, co pozwala nam pogłębić naszą wiedzę na temat mechanizmów leżących u podstaw funkcjonowania systemów. Analizy te mogą być przeprowadzane w znacznie bardziej zlokalizowanych obszarach, aby pomóc w ukierunkowaniu badań i opracowywaniu skuteczniejszych terapii.
Mózg ssaków jest strukturalnie zdefiniowany w wyraźnie rozpoznawalne odrębne regiony; jednak funkcjonalne i molekularne zawiłości tych dyskretnych struktur nie są jeszcze jasno zrozumiane. Wielowymiarowy i wielowarstwowy charakter tkanki mózgowej sprawia, że krajobraz ten jest trudny do zbadania na poziomie funkcjonalnym. Ponadto fakt, że ta sama struktura pełni wiele funkcji i na odwrót, jeszcze bardziej komplikuje zrozumienie brain8. Istotne jest, aby podejście eksperymentalne przeprowadzone w celu strukturalnej i funkcjonalnej charakterystyki regionów mózgu wykorzystywało precyzyjne metodologie badawcze w celu osiągnięcia spójności w próbkowaniu w celu skorelowania architektury neuroanatomicznej z funkcją. Złożoność mózgu została niedawno wyjaśniona za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek9,10, takich jak zakręt skroniowy ludzkiego mózgu, który składa się z 75 różnych typów komórek11. Porównując te dane z tymi z analogicznego regionu mózgu myszy, badanie nie tylko ujawnia podobieństwa w ich architekturze i typach komórek, ale także przedstawia różnice. Aby rozwikłać skomplikowane mechanizmy, ważne jest zatem badanie różnych obszarów mózgu z pełną precyzją. Zachowane struktury i funkcje między mózgiem człowieka i myszy umożliwiają wykorzystanie myszy jako wstępnego substytutu do wyjaśnienia funkcji ludzkiego mózgu i wyników behawioralnych.
Wraz z postępem w biologii systemowej, uzyskiwanie informacji z odrębnych obszarów mózgu u gryzoni stało się kluczową procedurą w badaniach neurobiologicznych. Podczas gdy niektóre protokoły, takie jak mikrodysekcja przechwytywania laserowego12 mogą być drogie, protokoły mechaniczne są niedrogie i wykonywane przy użyciu powszechnie dostępnych narzędzi13,14. Użyliśmy wielu regionów mózgu do testów transkryptomicznych15 i opracowaliśmy praktyczną i szybką procedurę do preparowania interesujących nas obszarów mózgu myszy krok po kroku w krótkim czasie. Po wypreparowaniu próbki te można natychmiast przechowywać w niskich temperaturach, aby zachować kwasy nukleinowe i białka tych tkanek. Nasze podejście może być wykonane szybciej, co prowadzi do wysokiej wydajności i pozwala na mniejsze ryzyko pogorszenia stanu tkanek. To ostatecznie zwiększa szanse na generowanie wysokiej jakości, powtarzalnych eksperymentów z wykorzystaniem tkanek mózgowych.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki Brain Removal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deaver</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-6762</td><td>5,5" proste ostre/ostre</td></tr><tr><td>Nożyczki Deaver</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-6763</td><td>5,5" zakrzywione ostre/ostre</td></tr><tr><td>Delikatne nożyczki operacyjne</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-6703</td><td>4,75 "zakrzywione ostre/ostre</td></tr><tr><td>Delikatne nożyczki operacyjne</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-6702</td><td>4,75 "proste ostre/ostre</td></tr><tr><td>Lekkie nożyczki</td><td>operacyjne Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-6753</td><td>5" zakrzywiona Sharp/Sharp</td></tr><tr><td>Micro szpatułka, promień i stożkowe płaskie końce</td><td></td><td></td><td>lustrzane wykończenie ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne 6,5"</td> <td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6846</td><td>zakrzywione ostre/ostre</td></tr><tr><td>Kleszcze do tkanek</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-8160</td><td>4,5 "1X2 zęby 2mm szerokość końcówki</td></tr><tr><td>Rongeur (opcjonalnie)</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-8321 wiele stylów do wyboru</td><td>Lempert Rongeur 6,5" 2X8mm</td></tr><tr><td><mocny> Rozwarstwienie przysadki mózgowej</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>rękojeść skalpela</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-9843</td><td>Rękojeść skalpela #3 Solidna 4"</td></tr><tr><td>i ostrza</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-9801-11</td><td>Sterylne ostrza skalpela: # 11 Pudełko 100 40 mm</td></tr><tr><td>Super cienkie kleszcze Inox</td><td>Roboz Sklep chirurgiczny</td><td>RS-4955</td><td>rozmiar końcówki 0,025 X 0,005 mm</td></tr> <tr><td>< mocny> Dyssekcja mózgu< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wizjer powiększający</td><td>Penn Tool Col</td><td>40-178-6</td><td>2,2x Zewnętrzne i 3,3-krotne wewnętrzne powiększenie soczewki, Prostokątna lupa</td></tr><tr><td>Sekcja zimna płyta</td><td>Cellpath.com</td><td>JRI-0100-00A</td><td>Zimna płyta i podstawa góry lodowej</td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe, pełna krzywizna bardzo delikatna</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-5138</td><td>0,5 mm Końcówka 4 " (10 cm) długości</td></tr><tr><td>Lekkie nożyczki operacyjne</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-6753</td><td>5-calowy zakrzywiony ostry/ostry</td></tr><tr><td>uchwyt skalpela</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-9843 (powtórzone powyżej)</td><td>Rękojeść skalpela #3 Solidna 4</td></tr>" <tr><td>i ostrza (zwłaszcza #11)</td><td>Sklep chirurgiczny Roboz</td><td>RS-9801-11 (powtórzone powyżej)</td><td>Sterylne ostrza skalpela:#11 Pudełko 100 40mm</td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Amazon</td><td>MS-SQRD9-4</td><td>Dwustronna szpatułka kwadratowa i okrągła</td></tr><tr><td>szczypce do tkanek</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-8160 (powtórzone powyżej)</td> <td>4,5 "zęby 1X2</td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

Mózg jest centrum dowodzenia dla układu nerwowego ssaków i organem o ogromnej złożoności strukturalnej. Chroniony w czaszce mózg składa się z zewnętrznej powłoki istoty szarej nad półkulami zwanymi korą mózgową. Pod tą warstwą znajduje się wiele innych wyspecjalizowanych struktur, które są niezbędne dla wielu zjawisk ważnych dla istnienia. Pobieranie próbek określonych obszarów mózgu wymaga szybkich i precyzyjnych etapów sekcji. Rozumie się, że na poziomie mikroskopowym istnieje wiele podregionów, które prawdopodobnie przekraczają arbitralne granice regionalne, które narzucamy na potrzeby tej sekcji.
Modele mysie są rutynowo używane do badania funkcji ludzkiego mózgu i chorób. Zmiany we wzorcach ekspresji genów mogą być ograniczone do określonych obszarów mózgu ukierunkowanych na określony fenotyp w zależności od stanu chorobowego. Dlatego bardzo ważne jest zbadanie regulacji transkrypcji w odniesieniu do jej dobrze zdefiniowanej organizacji strukturalnej. Pełne zrozumienie mózgu wymaga zbadania odrębnych obszarów mózgu, zdefiniowania połączeń i zidentyfikowania kluczowych różnic w aktywności każdego z tych obszarów mózgu. Bardziej kompleksowe zrozumienie każdego z tych odrębnych regionów może utorować drogę dla nowych i ulepszonych metod leczenia w dziedzinie neuronauki. W tym artykule omawiamy krok po kroku metodologię analizy mózgu myszy na szesnaście odrębnych regionów. W tej procedurze skupiliśmy się na usunięciu mózgu samca myszy C57Bl / 6J (w wieku 6-8 tygodni) i sekcji na wiele regionów przy użyciu neuroanatomicznych punktów orientacyjnych w celu zidentyfikowania i pobrania próbek dyskretnych funkcjonalnie i behawioralnie istotnych obszarów mózgu. Prace te pomogą stworzyć solidne podstawy w dziedzinie neuronauki, prowadząc do bardziej ukierunkowanych podejść do głębszego zrozumienia funkcji mózgu.

Nasze zrozumienie złożonej struktury i funkcji mózgu szybko ewoluuje i ulega poprawie. Mózg składa się z wielu odrębnych obszarów, a stworzenie mapy molekularnej może pomóc nam lepiej zrozumieć sposób jego działania. W niniejszej pracy metodologicznej omówiliśmy dyssekcję mózgu myszy na wiele odrębnych obszarów (Tabela 1). W tym protokole struktury są identyfikowane na podstawie kluczowych punktów orientacyjnych; osiąga się to poprzez utrzymywanie tkanek w wilgotności za pomocą roztworu soli fizjologiczn...

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Badanie różnych obszarów mózgu jest krokiem w kierunku zrozumienia molekularnej i strukturalnej złożoności mózgu. Protokół ten opisuje systematyczną sekcję mózgu myszy w celu wyizolowania odrębnych regionów mózgu. W perspektywie anatomii mózgu jest to podejście odgórne, które można łatwo odtworzyć.Zalety tego protokołu są dwojakie. Po pierwsze, podejście to daje możliwość zrozumienia molekularnych podstaw małych, ale krytycznych obszarów mózgu. Po drugie, cały proces preparacji jest wystarczająco krótki, aby zapewnić zachowanie integralności molekularnej, co jest krytycznym warunkiem wstępnym testów wstecznych i molekularnych.Ta procedura wymaga praktyki i delikatnego obchodzenia się z nimi. Czas jest tutaj bardzo ważny dla utrzymania strukturalnych punktów orientacyjnych i można go osiągnąć dzięki odpowiedniemu szkoleniu i praktyce. Procedurę usuwania mózgu myszy zademonstruje Seid Muhie, chemik badawczy i bioinformatyk z naszego laboratorium.Kolejnym dowodem na to, jak przebiegprzebiega sekcja mózgu myszy, będzie James Meyerhoff, neurobiolog z naszego laboratorium. Na początek oczyść i usuń skórę, aby uzyskać dobry chwyt. Zacisnąć szczękę odciętej głowy hemostatem i użyć gazy, aby odbić skórę głowy w sposób rostralny.Włóż cienkie, zakrzywione nożyczki do otworu wielkiego, aby oddzielić przylegające opony. Następnie włóż nożyczki w otwór podstawy czaszki, gdzie przechodzi rdzeń kręgowy z ostrzem skierowanym pionowo, ale równolegle i dociskając do wewnętrznej powierzchni kości podstawy płytki, obracając ostrze o 45 stopni w lewą stronę, a następnie w prawą stronę. Usuń kość potyliczną w kości śródciemieniowej, aby odsłonić móżdżek.Przesuwaj nożyczki rostralnie wzdłuż środkowego szwu strzałkowego aż do bregmy i przetnij je, podnosząc do góry, aby uniknąć uszkodzenia kory mózgowej. Gdy kości ciemieniowe są podnoszone, zidentyfikuj i odetnij pozostałe przyczepy opon mózgowych. Wykonaj dwa równoległe nacięcia w płaszczyźnie strzałkowej i usuń fragmenty kości czołowej, unikając uszkodzenia powierzchni mózgu.Podczas przecinania przyczepów opon mózgowych i nerwów czaszkowych odwróć czaszkę, aby grawitacja pomogła w usunięciu mózgu do małego kubka wstępnie wypełnionego roztworem soli fizjologicznej. Utrzymuj pęcherz słuchowy w stanie nienaruszonym, aby anatomia przysadki była możliwa do zidentyfikowania. Wykonaj bardzo małe nacięcie przysadkowe po obu stronach w grzbiecie błoniastego namiotu, który utrzymuje przysadkę mózgową na swoim miejscu, i podnieś tylny płat przysadki za pomocą ultra cienkich kleszczy.Wykonaj strzałkowe cięcie między bocznymi brzegami przedniego płata przysadki w najbliższym nerwie trójdzielnym, a następnie wyjmij przedni płat przysadki. Skieruj źródło białego światła na tkankę. Umieść mózg na wstępnie schłodzonym bloku ze stali nierdzewnej i utrzymuj go w niskiej temperaturze, otaczając go lodem w lodowatym roztworze soli.Okresowo zwilżaj tkankę lodowatym roztworem soli, aby zachować struktury. Ustaw mózg tak, aby kora mózgowa była skierowana do góry. Za pomocą małych zakrzywionych kleszczy usuń móżdżek.Korzystając z podejścia grzbietowego, wsuń zamknięte ostrza małego zakrzywionego kleszcza pod ciało modzelowate i delikatnie rozłóż je, aby cofnąć korę nową obustronnie, aby zachować krytycznie wydatne punkty orientacyjne w linii środkowej. Ostatecznie strona do góry widoczne byłyby struktury takie jak skrzyżowanie wzrokowe, podwzgórze, opuszki węchowe, rdzeń przedłużony, przysadka mózgowa i mostek mostowy. Spróbuj oddzielić półkule.Odwróć brzuszne miejsce mózgu do góry i wykonaj środkowe cięcie strzałkowe, zaczynając od grzbietu między opuszkami węchowymi w półkulach mózgowych. Usuń rdzeń, a następnie delikatnie oddziel dwie półkule. Następnie wykonaj nacięcie koronalne na wewnętrznym brzegu stawów, aby uzyskać tylny mózg i oddzielić rdzeń na tylnym brzegu stawów.Odwróć tkankę mózgową, aby ostrożnie oddzielić dwie półkule mózgowe. Na tym etapie usuń opuszkę węchową. Wykonaj nacięcie koronalne jeden milimetr przed przodem ciała modzelowatego i usuń dodatkowe opuszki węchowe, a następnie oddziel przyśrodkową i boczną korę przedczołową.Częściowo przeciąć poziomo lub koronalnie przez poprzeczną część spoidła przedniego od linii środkowej poniżej rogu przedniego komory bocznej, aby uwolnić jądro przegrody grzbietowo i brzuszne prążkowie brzusznie. Usuń niewielką ilość kory z powierzchni bocznej, aby usunąć podatność jądra i guzek węchowy. Oddziel rostralną część ciała prążkowanego od leżącej nad nim kory za pomocą zakrzywionego skalpela wyciętego tuż na zewnątrz torebki zewnętrznej.Zidentyfikuj jądra przegrody lub przegrodę i odizoluj je od tej sekcji. Na tym etapie wykonaj zakrzywione cięcie, aby oddzielić podwzgórze. Zostanie to wykonane za pomocą częściowego cięcia koronalnego za ciałami sutkowymi, rozciągającego się tylko tak daleko na boki, jak bruzda podwzgórza.Następnie uwolnij przekrój podwzgórza za pomocą cięcia przystrzałkowego wzdłuż długości bruzdy podwzgórza. Evert komory bocznej, aby odsłonić dodatkowe połączenia wewnątrzlimbiczne w pozostałych elementach układu limbicznego. W wewnętrznej części kory wewnętrznej po otwarciu komory obserwuje się strukturę przypominającą wachlarz.Użyj struktury przypominającej wachlarz w korze śródwęchowej, aby zdefiniować marginesy w celu sekcji, a następnie zidentyfikuj i usuń ciało migdałowate, korę śródwęchową, tylną korę obręczy i hipokamp. Potwierdź identyfikację wzgórza poprzez wizualizację prążka rdzenia na jego powierzchni grzbietowej rozciągającej się w linii środkowej kory rostralnej. Całkowicie oddziel wzgórze od środkowej części mózgu za pomocą cięcia koronalnego.Protokół ten może być stosowany do natychmiastowego usunięcia mózgu z czaszki, a następnie sekcji. Wypreparowane tkanki mogą być zachowane i przetworzone później w zależności od wymagań badania. Wyekstrahowane RNA z wielu wypreparowanych tkanek można oznaczyć pod kątem ekspresji genów.Reprezentatywne wyniki uzyskano przy użyciu pobranych mózgów, które były przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez kilka miesięcy przed ekstrakcją RNA. Odrębne regiony mózgu wraz z danymi dotyczącymi masy ciała zebrano w ramach badanego modelu stresu społecznego PTSD narażonego na agresora lub agresora. Stężenia RNA i odczyty spektrofotometryczne są pokazane tutaj.Postępując zgodnie z tym protokołem, upewnij się, że tkanki są schłodzone przez cały czas, trzymając mózg na zamrożonym stalowym bloku i okresowo oblewając tkankę lodowatą solą fizjologiczną. Po pobraniu tkanek i ich natychmiastowym zamrożeniu można je później wykorzystać do testów, takich jak transkryptomika, metabolomika i proteomika.

microdissection-mouse-brain-into-functionally-anatomically-different

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Ten film pokazuje sieciowanie białek powierzchniowych neuronów za pomocą suberanu bis-sulfosuccinimidylu lub BS3. Izolowany i schłodzony mózg myszy jest poddawany sekcji koronalnej. Żądany region jest wyodrębniany z sekcji, mielony i traktowany BS3. BS3 sieciuje białka powierzchniowe, takie jak receptory GABA, pozostawiając białka wewnętrzne niezmienione. Reakcja jest wygaszana glicyną przed przetworzeniem próbek do dalszej analizy.

Sieciowanie neuronalnych białek powierzchniowych w mózgu myszy za pomocą chemicznego testu sieciowania

Ten film przedstawia szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący przygotowania zamrożonych skrawków tkanki mózgowej myszy do dalszych analiz.

Przetwarzanie mózgu myszy do dalszej analizy

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Ta procedura opisuje zbieranie dyskretnie zamrożonych obszarów mózgu w celu uzyskania wysokiej jakości białka i RNA przy użyciu tanich i powszechnie dostępnych narzędzi.

Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Różne regiony móżdżku są zaangażowane w różne procesy behawioralne, jednak leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne pozostają nieznane. W pracy opisano metodę powtarzalnego i szybkiego preparowania kory móżdżku półkul, przednich i tylnych obszarów robaka oraz głębokich jąder móżdżku w celu zbadania różnic molekularnych poprzez wyizolowanie RNA i zbadanie różnic w ekspresji genów.

Rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej

Sekcja kriogeniczna pozwala na świeże, zamrożone przygotowanie największej niszy neurogennej w mysim mózgu do głębokiej ilościowej analizy proteomu. Metoda jest precyzyjna, skuteczna i powoduje minimalne zaburzenia tkanek. Dlatego idealnie nadaje się do badania mikrośrodowiska molekularnego tej niszy, a także innych narządów, regionów i gatunków.

Kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu

Splot naczyniówkowy (CP), niedostatecznie zbadana tkanka w neurobiologii, odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje technikę mikrodysekcji w celu wyizolowania CP i zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania ogólnego obrazu jego struktury komórkowej.

Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy

Poznaj protokół mikrodysekcji mózgu myszy umożliwiający izolację anatomicznie i funkcjonalnie różnych regionów. Metoda zachowuje integralność molekularną tkanek do analiz transkryptomicznych w badaniach neurobiologicznych.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Przeglądaj więcej filmów