Opracowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie matrycy kompozytowej wykonanej z naturalnych biomateriałów, które można wykorzystać do dostarczania i różnicowania komórek macierzystych, aby pomóc w gojeniu się ran. Osiąga się to poprzez wyizolowanie najpierw komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej lub SC od badanego zwierzęcia. Następnie A SC są ładowane na wstępnie przygotowane mikrosfery chitozanu.

Następnie FIBRYLOWANY żel kolagenowy jest odlewany, a kulki A-S-C-C-S-M są nakładane warstwami na żel kolagenowy. Na koniec żel fibrynowy PEG wylewa się na żel kolagenowy A-S-C-C-S-M i dodaje pożywkę. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują dwukierunkową jednoczesną migrację A SC z kulki CSM zarówno do matryc kolagenowych, jak i fibrynowych PEG.

Dzięki tej procedurze jedno źródło komórek macierzystych może pobierać zróżnicowane wskazówki z mikrośrodowisk kolagenu i fibryny PEG i być stymulowane w różny sposób do produkcji czynników plejotropowych i tworzenia sieci struktur przednaczyniowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kompozyty jednomateriałowe lub bezkomórkowe substytuty skóry, jest to, że te inne produkty nie zajmują się aktywnie rewaskularyzacją produktu przez gospodarza. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że wyizolowany RAD A SE ma skłonność do różnicowania się w kierunku fenotypu naczyniowego, gdy jest hodowany w macierzy fibrynowej świni.

Ta obserwacja wywołała pomysł, że pojedyncze źródło komórek macierzystych może być wykorzystywane jednocześnie w systemie, który składa się z różnych biomateriałów. Po wyizolowaniu i wyhodowaniu komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej lub ASC, przygotowaniu mikrosfer chitozanu lub CSM i załadowaniu ASC do CSM, przygotuj glikol polietylenowy, hydrożel fibrynowy, rozpuszczając sukcynylo, glut derate modified peg w czterech mililitrach soli fizjologicznej buforowanej tris. Tuż przed eksperymentem użyj filtra 0,22 mikrona, aby wysterylizować roztwór.

W studzience hodowlanej składającej się z sześciodołkowej mieszanki płytkowej, 500 mikrolitrów bulionu fibrynogenu i 250 mikrolitrów bulionu PEG inkubuje się przez 20 minut w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zmieszać 250 mikrolitrów wcześniej przygotowanego A-S-C-C-S-M z pegylowanym roztworem fibrynogenu, natychmiast dodać jeden mililitr podstawowego roztworu trombiny i za pomocą pipety szybko tri raz lub dwa razy natychmiast umieścić mieszaninę żelu komórkowego na 12-dołkowej płytce i inkubować w komorze nawilżanej 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie przemyj powstałą fibrynę peg dwukrotnie HBSS i inkubuj z minimalną pożywką niezbędną alfa uzupełnioną 10% FBS w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy użyciu standardowych technik mikroskopii świetlnej przez okres 11 dni.

Obserwuj migrację komórek z CSM do mieszanki żelowej, A-S-C-C-S-M z kolagenem typu pierwszego wyekstrahowanym ze ścięgien ogona szczura przy użyciu dwóch normalnych wodorotlenków sodu. Dostosuj pH do 6,8 i migotaj. Dodaj fibrylowany kolagen, mieszaninę A-S-C-C-S-M do 12-dołkowej płytki i inkubuj w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po sprawdzeniu, czy migotanie zostało zakończone, inkubuj żele kolagenowe A-S-C-C-S-M przez okres do 11 dni w inkubatorze z 5% wilgotnością dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Obserwuj migrację komórek z CSM do żelu w ciągu 11 dni przy użyciu standardowych technik mikroskopowych w celu opracowania dwuwarstwowego konstruktu do badania właściwości migracyjnych i indukcji co pojedynczego źródła komórek macierzystych. Korzystanie z dwóch biorusztowań.

Przygotuj zarówno żele kolagenowe, jak i fibrynowe PEG z następującymi niewielkimi modyfikacjami, przygotuj jeden mililitr 7,5 miligrama na mililitr kolagenu. Następnie przenieś mieszaninę do sześciodołkowej wkładki do hodowli tkankowej i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po całkowitym migotaniu połóż na powierzchni kolagenu 200 mikrolitrów pięciu miligramów A-S-C-C-S-M w pożywce hodowlanej.

Po tym, jak mikrosfery osiądą na żelu, przygotuj żel fibrynowy PEG przy użyciu 250 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych. Następnie ułóż pegylowany roztwór trombiny fibrynogenu na warstwach kolagenu A-S-C-C-S-M. Po zakończeniu inkubuj konstrukty przez 30 minut w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla, aby osiągnąć pełną algię.

Na koniec umieść jeden mililitr pożywki w górnej komorze nad konstruktem i trzy mililitry pożywki w dolnej komorze. Charakterystyka SC osadzonego w tym rusztowaniu ujawniła, że CSM załadowany SC może być jednocześnie umieszczony pomiędzy warstwą kolagenu i fibryny peg i w różny sposób pobierać wskazówki z obu środowisk zewnątrzkomórkowych, aby rozwijać się w nowych warunkach. Jak wykazano tutaj, kolagen wspierał zdolność ASC do pozostawania komórkami macierzystymi, co wykazano w ich ekspresji stro one w kolorze zielonym, a także ich morfologii podobnej do fibroblastów.

W przeciwieństwie do tego, fibryna PEG indukowała ASC do różnicowania się w kierunku fenotypu jałowego, jak pokazuje pokazana tutaj ich morfologia przypominająca rurkę, wraz ze światłem i specyficzną dla komórek śródbłonka ekspresją czynnika von Willow Brandand, pokazanego tutaj na czerwono. Ponadto, jak wykazano tutaj, te obserwowane fenotypy wydawały się występować we wczesnym okresie hodowli i utrzymywały się przez 11 dni. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować komórki macierzyste pochodzące z tłuszczu szczura, załadować je na chito i mikrosfery oraz włączyć je do dwuwarstwowego hydrożelu przy użyciu biomateriałów zatwierdzonych przez FDA.

Nie zapominaj, że biomateriały i komórki, które są wykorzystywane w tym protokole, pochodzą od zwierząt i ludzi i mogą być bardzo niebezpieczne, jeśli są skażone patogenami od gospodarza. Podczas wykonywania tych procedur należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej i techniki aseptycznych hodowli komórkowych.