Name: Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej i ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek śródbłonka żyły pępowinowej i badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Technika umożliwia obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Pinie Colarusso oraz Live Cell Imaging Facility za pomoc w obrazowaniu i analizie obrazów; pani Lailey za pomoc techniczną; oraz oddziałowi 51 w szpitalu Foothills w Calgary, AB za dostarczenie ludzkich pępowin. Dr K.D. Patel jest naukowcem w ramach Alberta Innovates: Health Solutions. Praca ta była wspierana przez grant operacyjny z Canadian Institutes for Health Research oraz granty na sprzęt i infrastrukturę z Canadian Foundation for Innovation i Alberta Science and Research Authority.

1. Izolacja i hodowla ludzkich komórek śródbłonka naczyniowego
<ol>
 <li>Podczas pracy z ludzką krwią i tkankami należy stosować procedury bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2. Za pomocą nożyczek odetnij pępowinę od łożyska, a następnie dokładnie sprawdź pępowinę pod kątem zakrzepów krwi oraz uszkodzeń powstałych w wyniku zaciskania pępowiny podczas porodu. Wytnij i wyrzuć te fragmenty pępowiny.</li>
 <li>Przygotuj świeży roztwór kolagenazy o stężeniu 1 mg/ml, wlewając 50 ml ciepłego buforu do pępowiny do probówki zawierającej 50 mg kolagenazy.</li>
 <li>Załóż sterylne rękawiczki i w komorze z laminarnym przepływem powietrza otwórz autoklawowaną tacę z narzędziami zawierającą wysterylizowane kaniule tępe, zaciski do pępowiny, nożyczki, kurki trójdrożne oraz gazę.</li>
 <li>Zidentyfikuj dwie tętnice i jedną żyłę znajdujące się w pępowinie. Tętnice są mniejsze i mają tendencję do silnego skurczu, podczas gdy żyła jest duża i łatwa do kaniulacji. Aby wypłukać krew z żyły, delikatnie wprowadź do jednego końca żyły kaniulę z przymocowaną kurkiem dwudrożnym i załóż zacisk na kaniulę, aby mocno utrzymać ją w pozycji. Przelej bufor do pępowiny przez żyłę. Powtarzaj czynność, aż wypływ będzie przejrzysty, a następnie zacisznij koniec pępowiny.</li>
 <li>Wprowadź kolagenazę do żyły, zamknij kurek, umieść pępowinę w zlewce zawierającej ciepły bufor do pępowiny i inkubuj przez 10 minut. Po 10 minutach wyjmij pępowinę i delikatnie ją masuj, aby poluzować komórki śródbłonka z światła żyły. Zlej roztwór do probówki zawierającej pożywkę do komórek śródbłonka (ECM). Przepłucz dwukrotnie buforem do pępowiny, aby usunąć pozostałe komórki. Zlej roztwór do tej samej probówki.</li>
 <li>Wirować komórki przy 350 x g przez 10 minut, aby uzyskać osad komórek śródbłonka.</li>
 <li>Usuń nadsącz i dodaj 10 ml ECM do osadu. Delikatnie resuspenduj komórki w ECM, a następnie przenieś komórki do kolby T75 uprzednio pokrytej 0,2% żelatyną. Pokrywanie żelatyną powinno być przeprowadzone przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Hoduj komórki w 37 °C i 5% CO2.</li>
 <li>Następnego dnia delikatnie potrząśnij kolbą, aby odłączyć ewentualne erytrocyty, następnie usuń nadsącz i przemyj ciepłym zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS). Usuń HBSS i zasil komórki 10 ml ciepłego ECM. Obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że erytrocyty zostały usunięte. Oceń stopień konfluencji i morfologię komórek śródbłonka. Komórki śródbłonka na tym etapie powinny być wydłużone i nie wykazywać obecności wakuol.</li>
 <li>Kontynuuj wymianę pożywki co trzy dni, aż komórki osiągną konfluencję, a następnie podziel komórki, używając 0,08% roztworu trypsyny zawierającego 1mM EDTA. Wysiej komórki śródbłonka do odpowiednich naczyń uprzednio pokrytych 0,2% żelatyną. Komórki powinny osiągnąć konfluencję w ciągu 3-6 dni.</li>
 <li>Przy użyciu komór ibidi, pokryj każdą komorę 0,2% żelatyną. Usuń nadmiar żelatyny i fibronektyny, a następnie dodaj do komory 1,5 X 106/mL komórek śródbłonka zawieszonych w ECM. Wymieniaj pożywkę co drugi dzień aż do uzyskania konfluencji. Komórki powinny osiągnąć konfluencję w ciągu 2-3 dni, w zależności od pępowiny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie neutrofili
<ol>
 <li>Neutrofile wyizolowano z krwi obwodowej zdrowych ochotników za pomocą wirowania gęstościowego. Szczegółowy protokół wraz z demonstracją wizualną izolacji neutrofili znajduje się w poprzednim numerze tego czasopisma 6. Po izolacji należy zawiesić neutrofile w stężeniu 1x106/mL w buforze HBSS zawierającym 0,5% albuminy ludzkiej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komory Ibidi
<ol>
 <li>Hoduj komórki śródbłonka w komorze ibidi pokrytej żelatyną. Badaj je codziennie za pomocą mikroskopii fazokontrastowej, aż staną się ściśle konfluentne.</li>
 <li>Stymuluj komórki śródbłonka w celu zwiększenia ekspresji cząsteczek adhezji i aktywacji. Na potrzeby niniejszego protokołu komórki śródbłonka stymulowano rekombinowanym TNF-α w stężeniu 10 ng/mL przez cztery godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed przygotowaniem komory ibidi do obrazowania w warunkach przepływu.</li>
 <li>Przygotuj mikroskop oraz pompę strzykawkową zgodnie z opisem wizualnym przedstawionym przez Wiese i współpracowników 11, używając pustej komory ibidi.</li>
 <li>Kluczowe różnice między niniejszym protokołem a procedurą Wiese obejmują uprzednie napełnienie rurek w celu zapobiegania wystawieniu komórek śródbłonka na działanie powietrza, utrzymywanie buforu w temperaturze 37 °C za pomocą łaźni wodnej, stosowanie rurek PharMed, aby zapobiec utracie temperatury buforu, oraz używanie różnych obiektywów mikroskopu w zależności od tego, czy obrazowanie odbywa się w kontraście fazowym, czy fluorescencyjnym.</li>
 <li>Po skonfigurowaniu mikroskopu i napełnieniu rurek roztworem HBSS, zamknij wszystkie kurki i usuń pustą komorę ibidi.</li>
 <li>Podłącz do rurek komorę ibidi zawierającą stymulowane TNF-α komórki śródbłonka.</li>
</ol>
4. Rekrutacja i transmigracja neutrofili
<ol>
 <li>Zwizualizuj monowarstwę komórek śródbłonka pod mikroskopem, używając obiektywu z kontrastem fazowym 10x.</li>
 <li>Ustaw pompę strzykawkową na pobieranie i rozpocznij przepływ HBSS z pożądanym naprężeniem ścinającym (zazwyczaj od 0,5 do 2 dyn/cm2).</li>
 <li>Po stronie wlotowej przełącz przepływ z HBSS na izolowane neutrofile (1x106/mL), obracając trójdrożny kurek.</li>
 <li>Rozpocznij rejestrację za pomocą kamery CCD podłączonej do rejestratora DVD lub bezpośrednio do komputera. Uruchom stoper w momencie, gdy neutrofile wpłyną do komory. Perfunduj neutrofile przez cztery minuty. Do jednego eksperymentu wystarcza łącznie 3 mL zawiesiny neutrofili.</li>
 <li>Po czterech minutach przełącz przepływ z powrotem na HBSS, aby zapobiec przywieraniu nowych neutrofili. Jeśli wymagane są dane dotyczące całkowitego oddziaływania, toczenia się (rolling) i silnej adhezji, zarejestruj obrazy 6 losowych pól przez 10 sekund każde, używając obiektywu z kontrastem fazowym 10x pomiędzy 4. a 5. minutą.</li>
 <li>Przełącz na obiektyw 40x i zarejestruj pojedyncze pole widzenia między 5. a 10. minutą. W 10. minucie zarejestruj od 5 do 10 losowych pól widzenia.</li>
 <li>Zatrzymaj przepływ i przejdź do następnej komory.</li>
</ol>
5. Obrazowanie fluorescencyjne w warunkach przepływu z użyciem komory Ibidi
<ol>
 <li>Oznakuj komórki śródbłonka lub neutrofile wybraną sondą fluorescencyjną. Na przykład, do wizualizacji połączeń międzykomórkowych śródbłonka można zastosować przeciwciało anty-VE-cadherin sprzężone z Alexa-[547].</li>
 <li>Zamontuj komorę ibidi na mikroskopie z możliwością obrazowania w kontraście interferencyjnym (DIC) oraz fluorescencyjnym. Wykorzystujemy konfokalny mikroskop FluoView 1000 (Olympus) z komorą środowiskową. Ustaw ostrość, używając obiektywu przeznaczonego do pracy w DIC i fluorescencji.</li>
 <li>Rejestruj jednoczesne obrazy DIC i fluorescencyjne przy użyciu oprogramowania dostarczonego przez producenta, stosując przebieg czasowy opisany w sekcji 4.</li>
</ol>
6. Analiza rekrutacji neutrofilów
<ol>
 <li>Analiza komórek toczących się i oddziałujących została opisana przez Wiese et al11.</li>
 <li>Aby zmierzyć odsetek neutrofili toczących się po monowarstwie śródbłonka, należy policzyć liczbę neutrofili, które przemieściły się o więcej niż jedną średnicę komórki w czasie 5 sekund. Liczbę tę należy podzielić przez całkowitą liczbę leukocytów w polu widzenia, aby wyznaczyć procent komórek toczących się. Z kolei pozostałe komórki uznaje się za silnie przylegające.</li>
 <li>Prędkość toczenia się neutrofili mierzy się poprzez obliczenie dystansu, jaki neutrofil pokonał w określonym przedziale czasu, a następnie podzielenie go przez ten czas wyrażony w sekundach.</li>
 <li>Transmigrację określa się poprzez policzenie liczby neutrofili, które zmieniły kształt i migrowały pod monowarstwę10. Neutrofile te rozpoznaje się po tym, że zmieniają się z jasnych w kontrastowym obrazie fazowym, gdy znajdują się na powierzchni monowarstwy, na ciemne, gdy znajdują się pod nią10. Liczbę komórek, które uległy transmigracji, można wyrazić jako procent całkowitej liczby komórek w polu widzenia lub jako surową liczbę komórek transmigrowanych na jednostkę powierzchni. W tym systemie modelowym zazwyczaj 50% neutrofili ulega transmigracji po 10 minutach.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Niepobudzone komórki śródbłonka nie wspierają rekrutacji neutrofili. W przeciwieństwie do tego, stymulacja komórek śródbłonka za pomocą TNF-α prowadzi do toczenia się neutrofili, ich trwałej adhezji oraz transmigracji. Przykład tych danych przedstawiono na Rysunkach 1 i 2. Rysunek 1A przedstawia neutrofile wchodzące w interakcje z komórkami śródbłonka stymulowanymi TNF-α. Interakcje te można poddać kwantyfikacji, co pozwala określić całkowitą liczbę neutrofili oddziałujących z komórkami śródbłonka, a także liczbę neutrofili toczących się, trwale przyległych lub transmigrowanych (Rysunek 2). Transmigracja neutrofili może zachodzić w obrębie połączeń międzykomórkowych lub bezpośrednio przez komórki śródbłonka. Aby rozróżnić te dwa warianty, komórki śródbłonka znakuje się przeciwciałem anty-VE-kadheryna, a transmigrację ocenia się jako parakomórkową lub transkomórkową (Rysunek 1B i C). W tym modelu niemal cała transmigracja ma charakter parakomórkowy7.
<img alt="Analiza mikroskopowa, barwienie błony komórkowej w immunofluorescence, porównanie 3 paneli." src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Symultaniczne obrazowanie DIC i fluorescencyjne w warunkach przepływu z użyciem komory ibidi. (A) Obraz DIC świeżo wyizolowanych ludzkich neutrofili migrujących przez ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej. Żółta grot strzałki wskazuje adherentnego neutrofila; biała grot strzałki wskazuje neutrofila w trakcie transmigracji. (B) Złącza komórek śródbłonka zostały zabarwione przeciwciałem anty-VE-cadherin sprzężonym z Alexa-[547] i zobrazowane. (C) Nałożenie kanałów A i B wykazuje, że w tym modelu niemal cała transmigracja ma charakter parakomórkowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Wykresy słupkowe oddziaływań komórkowych pokazujące wpływ TNF na gęstość komórek, adhezję neutrofili oraz ich transmigrację." src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Komórki śródbłonka pozostawiono bez stymulacji lub stymulowano 10 ng/mL TNF-α. Po 4 godzinach zamontowano komorę przepływową z równoległymi płytkami i przeprowadzono perfuzję neutrofili przy wartości 1 dyn/cm2. (A) Oddziaływania neutrofili badano i mierzono przy użyciu oprogramowania ImageJ z NIH. Całkowitą liczbę oddziałujących komórek określono jako (B) toczące się, silnie przylegające lub (C) transmigrujące. Dane przedstawiają średnią + SEM z 3 do 5 eksperymentów. Różnica między grupą kontrolną a grupą z TNF na panelach A i C była istotna (p&lt;0.001).

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li>
<li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+rolling%2C+arrest%2C+and+transmigration+across+activated%2C+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b%2FCD18%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li>
<li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation%2C+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li>
<li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745(2008).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+leukocyte+transmigration%3A+cell+surface+interactions+and+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li>
<li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+under+shear+flow%3A+it%27s+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li>
<li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neutrophil+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li>
<li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).</li>
<li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li>
<li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Phys+-+Gastrointestinal+and+Liver+Phys%22%5BJournal%5D)">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li>
<li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li>
<li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mat.+Res%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Badacze rutynowo wykorzystują komórki śródbłonka z różnych łożysk naczyniowych do badania rekrutacji i transmigracji neutrofili. Przykłady obejmują, między innymi, komórki śródbłonka mikrońaczyniowego skóry12, komórki śródbłonka zatok wątrobowych13 oraz komórki śródbłonka z ludzkiej żyły pępowinowej10. Wśród nich HUVEC zyskały szeroką popularność ze względu na względną łatwość izolacji i dostępność. HUVEC stanowią potężny system modelowy in vitro, który naśladuje wiele procesów ś...

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza typu 1</td><td>Worthington</td><td>4197</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do pępowiny</td><td></td><td></td><td>Skład: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glukozy w 1mM buforze NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; o pH 7,4</td></tr><tr><td>Pożywka do komórek śródbłonka (ECM)</td><td></td><td></td><td>M199 z solami Eagle uzupełniona o 16% surowicy ludzkiej zawierającej 100 jednostek penicyliny, 100 &amp;mu;g streptomycyny i 0,3 mg L-glutaminy/ml</td></tr><tr><td>M199</td><td>GIBCO</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna Glutaminian (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Komory Ibidi</td><td>Ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Prepro Tech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>20% roztwór albuminy ludzkiej</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>800120050</td><td></td></tr><tr><td>HBSS bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; i Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>H2487-10X</td><td></td></tr><tr><td>HBSS z Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; i Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>H1387-10X</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrofile są najliczniejszym typem białych krwinek. Stanowią one kluczowy element wrodzonego układu odpornościowego1. Podczas ostrego stanu zapalnego neutrofile są pierwszymi komórkami zapalnymi migrującymi do miejsca uszkodzenia. Rekrutacja neutrofili do miejsca uszkodzenia jest procesem wieloetapowym, który obejmuje kolejno: rozszerzenie naczyń krwionośnych w celu zwiększenia przepływu krwi; zmiany strukturalne w naczyniach mikrokrwionośnych i ucieczkę białek osocza z krwiobiegu; toczenie, adhezję i transmigrację neutrofili przez endotelium; oraz gromadzenie się neutrofili w miejscu uszkodzenia2,3. Opracowano szeroki wachlarz metod in vivo i in vitro, które umożliwiają badanie tych procesów4. Niniejsza metoda koncentruje się na transmigracji neutrofili przez ludzkie komórki śródbłonka.
Jedną z popularnych metod badania procesów molekularnych zaangażowanych w transmigrację neutrofilów jest wykorzystanie neutrofilów ludzkich wchodzących w interakcję z pierwotnymi ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC)5. Izolacja neutrofilów została opisana wizualnie w innym opracowaniu6; dlatego niniejszy artykuł przedstawi metodę izolacji HUVEC. Po izolacji i namnożeniu do stanu konfluencji komórki śródbłonka są aktywowane, co prowadzi do upregulacji cząsteczek adhezyjnych i aktywacyjnych. Na przykład aktywacja komórek śródbłonka cytokinami takimi jak TNF-α skutkuje zwiększoną ekspresją E-selektyny i IL-87. E-selektyna pośredniczy w wychwytywaniu i toczeniu się neutrofilów, natomiast IL-8 pośredniczy w ich aktywacji i trwałej adhezji. Po adhezji neutrofile transmigrują. Transmigracja może zachodzić parakomórkowo (poprzez połączenia między komórkami śródbłonka) lub transkomórkowo (poprzez samą komórkę śródbłonka). W większości przypadków interakcje te zachodzą w warunkach przepływu występujących w naczyniach krwionośnych7,8.
Komora przepływu z równoległymi płytkami jest powszechnie stosowanym systemem, który naśladuje hydrodynamiczne naprężenia ścinające występujące in vivo i umożliwia badanie rekrutacji neutrofili w warunkach przepływu in vitro9,10. Istnieje kilka firm produkujących komory przepływu z równoległymi płytkami, a każda z nich ma swoje zalety i wady. Jeśli wymagane jest obrazowanie fluorescencyjne, należy zastosować szkło lub polimer o podobnych właściwościach optycznych. Komórki śródbłonka nie rosną dobrze na szkle.
Przedstawiamy prostą i szybką metodę obrazowania w kontraście fazowym, DIC oraz fluorescencyjnym procesu transmigracji neutrofili z wykorzystaniem niskowolumenowego szkiełka z kanałem ibidi, wykonanego z polimeru, który wspomaga szybką adhezję i wzrost ludzkich komórek śródbłonka oraz posiada właściwości optyczne porównywalne ze szkłem. W tej metodzie komórki śródbłonka były hodowane i stymulowane w mikroprzewodzie ibidi μslide. Neutrofile wprowadzano w warunkach przepływu, a następnie oceniano transmigrację. Fluorescencyjne obrazowanie połączeń umożliwiło w czasie rzeczywistym określenie zakresu transmigracji parakomórkowej w stosunku do transkomórkowej.

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Neutrofile są najliczniejszym typem białych krwinek. Stanowią one kluczowy element wrodzonego układu odpornościowego1. Podczas ostrego stanu zapalnego...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości ludzkich komórek śródbłonka i wykorzystanie ich do zbadania mechanizmów regulujących transmigrację neutrofili w warunkach przepływu przeciwprądowego. Jest to realizowane poprzez początkowe wyizolowanie i wysianie ludzkich komórek śródbłonka pępowiny. Drugim krokiem jest przeniesienie komórek do komór IBD.Następnie świeżo wyizolowane ludzkie neutrofile są naniesione na aktywowane komórki śródbłonka, co prowadzi do toczenia się neutrofili, ich silnej adhezji oraz transmigracji. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie transmigracji za pomocą mikroskopii wideo. W końcowej fazie można wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną i w świetle przechodzącym do oceny transmigracji neutrofili przez aktywowane komórki śródbłonka.Izolacja komórek śródbłonka jest łatwa do opisania, ale trudna do opanowania, częściowo dlatego, że kluczowe etapy wymagają wizualizacji pępowiny. Z tego powodu wizualna demonstracja tej metody jest krytyczna. Metoda ta pomoże nam zrozumieć kluczowe kwestie w dziedzinie stanu zapalnego, takie jak przebieg rekrutacji leukocytów w warunkach przepływu, a także pozwoli lepiej zrozumieć zachowanie komórek śródbłonka w warunkach przepływu.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat rekrutacji neutrofili podczas stanu zapalnego, można ją również zastosować do rzadkich populacji leukocytów, takich jak komórki NK oraz eozynofile. Procedurę tę, wraz z Ritu Sharmą, prezentuje Hong Jang, technik w moim laboratorium. Przynajmniej na godzinę przed procedurą należy przygotować i inkubować kolbę T 75 z żelatyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie rozpocznij procedurę izolacji komórek śródbłonka w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając nożyczek do odcięcia pępowiny z łożyska. Po założeniu sterylnych rękawiczek dokładnie obejrzyj pępowinę i odrzuć wszelkie fragmenty zawierające skrzepy krwi lub uszkodzone w wyniku zaciskania pępowiny podczas porodu. Następnie zidentyfikuj dwie tętnice i jedną żyłę znajdujące się w pępowinie.Następnie ostrożnie wprowadź kaniulę z przymocowanym do niej dwudrożnym kurkiem do jednego z końców żyły, a następnie załóż zacisk na kaniulę, aby mocno utrzymać ją w pozycji. Jednym z najtrudniejszych etapów procedury jest perfuzja pępowiny. Aby zapewnić powodzenie tej czynności, perfunduj pępowinę nadmiarem buforu i obserwuj przepływ, aż płyn stanie się przejrzysty.Przepłucz żyłę buforem do pępowiny, aż wypływ stanie się przejrzysty, a następnie zaklemuj koniec pępowiny. Podczas perfuzji zdarza się, że ujawnia się niewielki otwór powstały w wyniku pobrania krwi pępowinowej przez lekarzy. W takich sytuacjach można użyć kleszczyków hemostatycznych do zablokowania otworu, co pozwoli na kontynuowanie perfuzji w celu wyizolowania komórek śródbłonka.Kluczowe znaczenie ma precyzyjne określenie czasu obróbki kolagenazą. Zbyt krótki czas spowoduje niedostateczną liczbę zebranych komórek śródbłonka, natomiast zbyt długi może doprowadzić do zanieczyszczenia preparatu komórkami mięśni gładkich lub uszkodzenia komórek śródbłonka. Następnie należy przepłukać żyłę świeżo przygotowaną, ciepłą kolagenazą.Zamknąć kurek i inkubować pępowinę w zlewce zawierającej ciepły bufor do pępowiny. Po 10 minutach wyjąć i delikatnie masować pępowinę, aby odizolować komórki śródbłonka z światła żyły. Zlać roztwór do probówki zawierającej pięć mililitrów pożywki dla komórek śródbłonka lub ECM, płucząc pępowinę dwa razy buforem do pępowiny w celu usunięcia pozostałych komórek.Następnie wirować komórki przez 10 minut przy 50 ×g. W temperaturze pokojowej usunąć nadsącz, a następnie resuspendować osad. Komórki przenieść do kolby T 75 powlekanej żelatyną w 10 ml pożywki dla komórek śródbłonka i hodować komórki śródbłonka przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia delikatnie potrząsnąć kolbą, aby usunąć pozostałe erytrocyty.Następnie należy usunąć supernatant i wypłukać hodowlę komórek śródbłonka ciepłym HBSS. Po usunięciu HBSS komórki należy zasilić 10 mililitrami ciepłego ECM. Następnie należy zbadać komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że erytrocyty zostały usunięte, oraz ocenić stopień konfluencji i morfologię komórek śródbłonka.Należy kontynuować wymianę pożywki co trzy dni, aż komórki osiągną pełną konfluencję. W tym momencie należy przeprowadzić pasaż komórek, używając roztworu trypsyny i EDTA. Następnie odseparowane komórki należy zebrać i resuspendować w ECM.Na koniec pokryj żelatyną każdą studnię komory IBD. Usuń nadmiar żelatyny, a następnie do każdej studni komory dodaj 1,5 × 10⁶ na mililitr zawiesiny komórek śródbłonka. Rozpocznij od indukowania nadekspresji cząsteczek adhezyjnych i aktywacyjnych na powierzchni komórek poprzez inkubację komórek śródbłonka z odpowiednim stymulatorem w celu ich aktywacji.Wyizoluj neutrofile z krwi obwodowej zdrowych ochotników poprzez centryfugację gradientową zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą, a następnie zawieś komórki w stężeniu 1 × 10⁶ na ml w HBSS z dodatkiem albuminy ludzkiej. Po przygotowaniu mikroskopu podłącz komorę IBD zawierającą stymulowane komórki śródbłonka do przewodów mikroskopu. Wybierz obiektyw do kontrastu fazowego 10x, a następnie ustaw pompę strzykawkową na pobieranie i rozpocznij przepływ HBSS przy żądanym naprężeniu ścinającym.Krótkotrwale zatrzymaj przepływ, przekręcając trójdrożny kurek odcinający po stronie wylotowej do pozycji zamkniętej i przełączając linię wlotową z HBSS na izolowane neutrofile. Wznów przepływ, przekręcając kurek z powrotem do pozycji otwartej. Następnie rozpocznij rejestrację obrazu za pomocą kamery CCD podłączonej do rejestratora DVD.Uruchom stoper. Gdy po czterech minutach neutrofile wpłyną do komory, przełącz z powrotem na HBSS, aby zapobiec przywieraniu nowych neutrofili. Jeśli wymagane są dane dotyczące całkowitej liczby interakcji, toczenia oraz silnej adhezji, należy użyć obiektywu 10x w kontraście fazowym.Należy obrazować sześć losowych pól przez 10 sekund każde w przedziale między czwartą a piątą minutą. Następnie należy przełączyć na obiektyw 40 x i zarejestrować pojedyncze pole widzenia w interesującym czasie. Po perfuzji neutrofili w 10. minucie należy zebrać od pięciu do 10 losowych pól widzenia.Niestymulowane komórki śródbłonka nie wspierają rekrutacji neutrofilów. Dlatego na poniższych rycinach przedstawiono neutrofile wchodzące w interakcję ze stymulowanymi TNF alpha komórkami śródbłonka. Zwróć uwagę na neutrofil adherentny, wskazany żółtą grotą strzałki, oraz neutrofil w trakcie transmigracji, oznaczony białą grotą strzałki.Transmigracja neutrofili może zachodzić w szczelinach międzykomórkowych lub bezpośrednio przez komórki śródbłonka. Aby rozróżnić te dwa stany, komórki śródbłonka oznakowano przeciwciałem anty-VE coherent. Jak widać tutaj na czerwono, transmigrację ocenia się jako parakomórkową lub transkomórkową.W tym modelu niemal cała transmigracja ma charakter parakomórkowy, co obrazuje ta rycina przedstawiająca nałożenie dwóch poprzednich rysunków. Na pierwszym z trzech wykresów przeanalizowano i zmierzono interakcje neutrofili z wykorzystaniem oprogramowania Image J. Należy zauważyć, że znacznie więcej interakcji neutrofili z komórkami śródbłonka wystąpiło pomiędzy neutrofilami a komórkami śródbłonka aktywowanymi TNF alpha niż w przypadku kontrolnych, niepobudzonych komórek śródbłonka.Całkowitą liczbę oddziałujących komórek dalej charakteryzowano jako toczące się, silnie przylegające lub migrujące przez śródbłonek, analogicznie do poprzednich etapów. Znacząco większa transmigracja neutrofili wystąpiła w studniach zawierających aktywowane komórki śródbłonka po ich izolacji. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z biologią komórek śródbłonka po ich rozwoju można zastosować inne metody, takie jak western blotting, PCR w czasie rzeczywistym oraz pomiar oporu śródbłonka.Niniejsza metoda pomoże badaczom z zakresu stanu zapalnego i biologii naczyniowej zrozumieć, w jaki sposób zachodzi rekrutacja leukocytów w warunkach przepływu w ludzkim systemie modelowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej i wykorzystywać je do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu przy użyciu komory ity.

isolation-human-umbilical-vein-endothelial-cells-their-use-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej i ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Niniejszy protokół wideo przedstawia izolację i hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępekowej (HUVEC) z ludzkiej pępowiny. Po izolacji komórki te mogą być wykorzystywane w testach angiogenezy in vitro, takich jak zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego, zaprezentowany również przez laboratorium Hughesa.<br...

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Film demonstruje metodę badania wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów. W modelu komory z przepływem równoległym cytokiny prozapalne indukują ekspresję receptorów adhezyjnych przez komórki śródbłonka, ułatwiając rekrutację i migrację neutrofili. Wzajemne oddziaływanie między komórkami zrębu a komórkami śródbłonka zmniejsza rekrutację neutrofili do komórek śródbłonka.

Badanie przepływu in vitro wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów

Opisano metodę ilościowego oznaczania adhezji neutrofili. Ta metoda tworzy dynamiczne środowisko przepływu podobne do tego, które występuje w naczyniu krwionośnym. Pozwala to na badanie adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych (ligand) lub substratu komórek śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do środowiska in vivo z czystym stresem.

Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), przejściowej transfekcji znakowanych fluorescencyjnie markerów wzrostu mikrotubul, obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy dynamiki wzrostu mikrotubul międzyfazowych.

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Chociaż jest to trudne, izolacja komórek śródbłonka płuc jest niezbędna do badań nad zapaleniem płuc. Niniejszy protokół opisuje procedurę wysokowydajnej izolacji komórek śródbłonka makronaczyniowego i mikronaczyniowego o wysokiej czystości.

Izolacja i oczyszczanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego i makronaczyniowego z próbek pochodzących z płuc

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Poznaj metodę izolacji komórek śródbłonka żyły pępowinowej i badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Technika umożliwia obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek w czasie rzeczywistym.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej i ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Przeglądaj więcej filmów