Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości ludzkich komórek śródbłonka i wykorzystanie ich do zbadania mechanizmów regulujących transmigrację neutrofili w warunkach przepływu podwarstwowego. Cel ten osiąga się poprzez uprzednią izolację i wysiewanie ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej, a następnie przesianie komórek do komór IBD.

Następnie świeżo wyizolowane ludzkie neutrofile są naniesione na aktywowane komórki śródbłonka, co prowadzi do toczenia się neutrofili, ich silnej adhezji i transmigracji. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie transmigracji za pomocą mikroskopii wideo. W końcowej analizie można wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną i światła przechodzącego do oceny transmigracji neutrofili przez aktywowane komórki śródbłonka.

Izolacja komórek śródbłonka jest łatwa do opisania, lecz trudna do opanowania, częściowo dlatego, że kluczowe etapy wymagają wizualizacji pępowiny. Z tego powodu wizualna demonstracja tej metody jest krytyczna. Metoda ta pomoże nam zrozumieć kluczowe kwestie w dziedzinie zapalenia, takie jak przebieg rekrutacji leukocytów w warunkach przepływu, a także pozwoli lepiej zrozumieć zachowanie komórek śródbłonka w warunkach przepływu.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat rekrutacji neutrofili podczas stanu zapalnego, może być ona również zastosowana do rzadkich populacji leukocytów, takich jak komórki NK i eozynofile. Procedurę tę demonstruje wraz z Ritu Sharmą Hong Jang, technik w moim laboratorium. Na co najmniej godzinę przed procedurą należy podgrzać i inkubować kolbę T 75 z żelatyną w temperaturze 37°C.

Następnie rozpocznij procedurę izolacji komórek śródbłonka w komorze z laminarnym przepływem powietrza, odcinając nożyczkami pępowinę z łożyska. Po założeniu sterylnych rękawiczek dokładnie obejrzyj pępowinę i odrzuć fragmenty zawierające skrzepy krwi lub uszkodzone w wyniku zaciskania pępowiny podczas porodu. Następnie zidentyfikuj dwie tętnice oraz jedną żyłę znajdujące się w pępowinie.

Następnie ostrożnie wprowadź kaniulę z przymocowanym dwukierunkowym kurkiem do jednego końca żyły, a następnie załóż zacisk na kaniulę, aby mocno utrzymać ją w pozycji. Jednym z najtrudniejszych etapów procedury jest perfuzja pępowiny. Aby zapewnić powodzenie tego procesu, przepłucz pępowinę nadmiarem buforu i obserwuj przepływ, aż płyn stanie się przejrzysty.

Przepłucz żyłę buforem do pępowiny, aż przepływ stanie się przejrzysty, a następnie zaklemuj koniec pępowiny. Podczas perfuzji sporadycznie mogą ujawnić się małe otwory powstałe w wyniku pobrania krwi pępowinowej przez lekarzy. W takich sytuacjach można użyć kleszczyków hemostatycznych do zablokowania otworu, co pozwoli na kontynuowanie perfuzji i izolację komórek śródbłonka.

Kluczowe znaczenie ma precyzyjne określenie czasu traktowania kolagenazą. Zbyt krótki czas spowoduje niedostateczny odzysk komórek śródbłonka, natomiast zbyt długi może doprowadzić do zanieczyszczenia preparatu komórkami mięśni gładkich lub do uszkodzenia komórek śródbłonka. Następnie należy przepłukać żyłę świeżo przygotowaną, ciepłą kolagenazą.

Zamknij kurek i inkubuj pępowinę w zlewce zawierającej ciepły bufor do pępowiny. Po 10 minutach wyjmij pępowinę, a następnie delikatnie ją masuj, aby odłączyć komórki śródbłonka od światła żyły. Zlej roztwór do probówki zawierającej pięć mililitrów pożywki do komórek śródbłonka lub ECM, przepłukując pępowinę dwa razy buforem do pępowiny, aby usunąć wszystkie pozostałe komórki.

Następnie odwiruj komórki przez 10 minut przy 50 ×g. W temperaturze pokojowej usuń supernatant, a następnie zresuspenduj osad. W 10 ml pożywki dla komórek śródbłonka przenieś komórki do kolby T 75 powlekanej żelatyną i inkubuj komórki śródbłonka przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia delikatnie potrząśnij kolbą, aby usunąć pozostałe erytrocyty.

Następnie należy usunąć nadsącz i przemyć hodowlę komórek śródbłonka ciepłym HBSS. Po usunięciu HBSS komórki należy zasilić 10 mililitrami ciepłego ECM. Następnie należy zbadać komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że erytrocyty zostały usunięte, oraz ocenić stopień konfluencji i morfologię komórek śródbłonka.

Kontynuuj wymianę pożywki co trzy dni, aż komórki osiągną pełną konfluencję. W tym momencie podziel komórki, używając roztworu trypsyny i EDTA. Następnie zbierz odlepione komórki i zawieś je ponownie w ECM.

Na koniec pokryj każdą studienkę komory IBD żelatyną. Usuń nadmiar żelatyny, a następnie do każdej studienki komory dodaj 1,5 × 10⁶ komórek zawiesiny komórek śródbłonka na mililitr. Rozpocznij proces indukowania nadekspresji cząsteczek adhezji i aktywacji na powierzchni komórek poprzez inkubację komórek śródbłonka z odpowiednim stymulatorem w celu ich aktywacji.

Wyizoluj neutrofile z krwi obwodowej zdrowych ochotników poprzez centryfugowanie gradientowe zgodnie z wcześniej opisaną procedurą, a następnie zawieś komórki w stężeniu 1 × 10⁶/ml w roztworze HBSS z dodatkiem albuminy ludzkiej. Po przygotowaniu mikroskopu podłącz komorę IBD zawierającą stymulowane komórki śródbłonka do przewodów mikroskopu. Wybierz obiektyw do kontrastu fazowego 10x, a następnie ustaw pompę strzykawkową na pobieranie i rozpocznij przepływ HBSS przy pożądanym naprężeniu ścinającym.

Krótko zatrzymaj przepływ, przekręcając trójdrożny kurek odcinający po stronie wylotowej do pozycji zamkniętej i przełączając linię wlotową z HBSS na izolowane neutrofile. Ponownie uruchom przepływ, przekręcając kurek z powrotem do pozycji otwartej. Następnie rozpocznij rejestrację za pomocą kamery CCD podłączonej do rejestratora DVD.

Uruchom stoper. Gdy po czterech minutach neutrofile dostaną się do komory, przełącz ponownie na HBSS, aby zapobiec przyleganiu nowych neutrofili. Jeśli wymagane są dane dotyczące całkowitej liczby interakcji, toczenia oraz adhezji silnej, użyj obiektywu z kontrastem fazowym 10x.

Obiektyw do obrazowania sześciu losowych pól przez 10 sekund każde między czwartą a piątą minutą. Następnie należy przełączyć na obiektyw 40 x i zarejestrować pojedyncze pole widzenia w interesującym czasie. Po perfuzji neutrofili w 10. minucie należy zebrać od pięciu do 10 losowych pól widzenia.

Niepobudzone komórki śródbłonka nie wspomagają rekrutacji neutrofili. W związku z tym na poniższych rysunkach przedstawiono neutrofile oddziałujące z komórkami śródbłonka stymulowanymi TNF alpha. Należy zwrócić uwagę na neutrofil przylegający, wskazany żółtą strzałką, oraz neutrofil migrujący przez śródbłonek, oznaczony białą strzałką.

Transmigracja neutrofilów może zachodzić w obrębie połączeń międzykomórkowych lub bezpośrednio przez komórki śródbłonka. Aby odróżnić te dwa stany, komórki śródbłonka znakowano przeciwciałem anty-VE-cadherin. Jak widać tutaj na czerwono, transmigrację ocenia się jako przebiegającą parakomórkowo lub transkomórkowo.

W tym modelu niemal cała transmigracja ma charakter parakomórkowy, co obrazuje poniższa rycina będąca nałożeniem dwóch poprzednich rysunków. Na pierwszym z trzech wykresów zbadano i zmierzono oddziaływania neutrofili przy użyciu oprogramowania Image J. Należy zauważyć, że znacznie więcej oddziaływań neutrofili z komórkami śródbłonka wystąpiło pomiędzy neutrofilami a aktywowanymi TNF alpha komórkami śródbłonka niż w przypadku kontrolnych, niepobudzonych komórek śródbłonka.

Całkowitą liczbę oddziałujących komórek dodatkowo scharakteryzowano jako toczące się, silnie przylegające lub transmigrujące, zgodnie z wcześniejszym opisem. Znacząco większą transmigrację neutrofili zaobserwowano w studzienkach zawierających aktywowane komórki śródbłonka po ich izolacji. Inne metody, takie jak western blotting, real-time PCR oraz pomiar oporu śródbłonka, mogą zostać zastosowane w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące biologii komórek śródbłonka po ich wykształceniu.

Niniejsza metoda pomoże badaczom z dziedziny stanów zapalnych i biologii naczyniowej zrozumieieć, w jaki sposób zachodzi rekrutacja leukocytów w warunkach przepływu w ludzkim modelu systemowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak izolować ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej i wykorzystywać je do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu przy użyciu komory ity.