Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej i ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości ludzkich komórek śródbłonka i wykorzystanie ich do zbadania mechanizmów regulujących migrację trans neutrofili, warunki niedopełnienia. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie i posiew ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej. Drugim krokiem jest podzielenie komórek na komory IBD.

Następnie świeżo wyizolowane ludzkie neutrofile są obficie rozlewane po aktywowanych komórkach śródbłonka, co powoduje mocne przyleganie neutrofili i transmigrację. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie transmigracji za pomocą mikroskopii wideo. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna i mikroskopia jasnego pola mogą być wykorzystane do oceny migracji neutrofili przez aktywowane komórki śródbłonka.

Izolacja komórek śródbłonka jest łatwa do opisania, ale trudna do nauczenia się po części dlatego, że kluczowe kroki wymagają wizualizacji pępowiny. Z tego powodu wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Ta metoda pomoże nam zrozumieć kluczowe pytania w dziedzinie zapalenia, takie jak to, jak rekrutacja leukocytów przebiega w warunkach przepływu i jak zachowuje się komórka śródbłonka w warunkach przepływu. Rozumieć.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w rekrutację neutrofili podczas stanu zapalnego. Może być również stosowany do rzadkich populacji leukocytów, takich jak komórki NK i eozynofile. Demonstruje tę procedurę wraz z Ritu Sharma Hong Jang, technik w moim laboratorium Co najmniej godzinę przed zabiegiem preco, a następnie inkubuje kolbę T 75 z żelatyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie rozpocznij procedurę izolacji komórek śródbłonka w okapie z przepływem laminarnym, używając nożyczek do przecięcia pępowiny z łożyska. Po zmianie rękawiczek w sterylne należy dokładnie obejrzeć pępowinę i wyrzucić wszelkie części, które zawierają skrzepy krwi lub są uszkodzone w wyniku zaciśnięcia pępowiny podczas porodu. Następnie zidentyfikuj dwie tętnice i pojedynczą żyłę obecną w rdzeniu.

Następnie delikatnie włóż kaniulę z przymocowanym do niej dwukierunkowym kurkiem zatrzymującym do jednego końca żyły, a następnie umieść zacisk wokół kaniuli, aby mocno ją przytrzymać. Jedną z najtrudniejszych części zabiegu jest perfuzja pępowiny. Aby upewnić się, że zostanie to zrobione pomyślnie, przepłucz przewód nadmiarem buforu i obserwuj przepływ, aż będzie czysty.

Spulchnij żyłę buforem sznurka, aż przepływ będzie czysty, a następnie zaciśnij koniec sznurka. Czasami podczas perfuzji ujawnia się mały otwór, ponieważ lekarze usunęli krew pępowinową z pępowiny. W takich sytuacjach hemostatyki mogą być użyte do zablokowania otworu, a perfuzja może być kontynuowana podczas izolowania komórek śródbłonka.

Niezwykle ważne jest, aby dokładnie określić czas zabiegu kolagenazy. Zbyt mało czasu i zbyt mało komórek śródbłonka będzie pobieranych zbyt długo i może dojść do zanieczyszczenia komórek mięśni gładkich lub uszkodzenia komórek śródbłonka. Następnie perfend do żyły należy użyć świeżo przygotowanej ciepłej kolagenazy.

Zamknąć kurek odcinający i inkubować przewód w zlewce zawierającej ciepły bufor przewodowy. Po 10 minutach wyjmij, a następnie delikatnie masuj pępowinę, aby rozluźnić komórki śródbłonka ze światła żyły. Odcedź roztwór do probówki zawierającej pięć mililitrów pożywki z komórkami śródbłonka lub ECM, dwukrotnie przepłukując pępowinę buforem pępowiny, aby usunąć wszelkie pozostałe komórki.

Teraz wiruj komórki przez 10 minut w temperaturze trzykrotnej 50 razy G.At temperaturze pokojowej, usuń supernatant, a następnie ponownie zawieś osad. W 10 mililitrach pożywki z komórkami śródbłonka przenieś komórki do kolby T 75 pokrytej żelatyną i hodowli, komórki śródbłonka przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Następnego dnia delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby usunąć wszelkie czerwone krwinki.

Następnie usuń supernatant i przemyj hodowlę komórek śródbłonka ciepłym HBSS. Po wyjęciu HBSS nakarm komórki 10 mililitrami ciepłego ECM. Następnie zbadaj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że czerwone krwinki zostały usunięte i ocenić stopień zbiegu i morfologii komórek śródbłonka.

Kontynuuj zmianę pożywki co trzy dni, aż komórki osiągną współpłynność. W tym momencie podziel komórki za pomocą roztworu trypsyny i EDTA. Następnie zbierz oderwane komórki i ponownie zawieś je w ECM.

Na koniec pokryj każdą studzienkę komory IBD żelatyną. Usuń nadmiar żelatyny, a następnie dodaj 1,5 razy 10 do sześciu na mililitr zawiesiny komórek śródbłonka do każdej studzienki komory. Zacznij od wywołania regulacji w górę adhezji i aktywacji ekspresji powierzchni komórki cząsteczki poprzez inkubację komórek śródbłonka z odpowiednim stymulantem, podczas gdy komórki śródbłonka są aktywowane.

Wyizolować neutrofile z krwi obwodowej zdrowych ochotników przez wirowanie gęstości, jak wcześniej opublikowano, a następnie zawiesić komórki w stężeniu od jednego razy 10 do 6 na mililitr w HBSS plus albumina ludzka. Po ustawieniu mikroskopu należy przymocować komorę IBD zawierającą stymulowane komórki śródbłonka do rurki mikroskopu. Wybierz obiektyw z kontrastem 10 x fazowym, a następnie ustaw pompę strzykawkową tak, aby wycofała się i rozpoczęła przepływ HBSS przy żądanym naprężeniu ścinającym.

Na krótko zatrzymaj przepływ, przekręcając trójdrogowy kurek odcinający po stronie wylotowej do pozycji wyłączonej i przełączając przewód dolotowy z HBSS na izolowane neutrofile. Ponownie uruchomić przepływ, przekręcając kurek odcinający z powrotem do pozycji włączonej. Następnie rozpocznij nagrywanie za pomocą kamery CCD podłączonej do nagrywarki DVD.

Uruchom minutnik. Gdy neutrofile dostaną się do komory po czterech minutach, przełącz się z powrotem na HBSS, aby zapobiec przyłączaniu się nowych neutrofili. Jeśli pożądane są dane dotyczące całkowitego walcowania interakcji i twardej adhezji, należy użyć 10-krotnego kontrastu fazowego.

Cel polega na zobrazowaniu sześciu losowych pól przez 10 sekund każde między minutą czwartą a piątą. Na koniec przełącz się na obiektyw 40x i utrwal pojedyncze pole widzenia w interesującym Cię momencie. Po perfuzji neutrofili po 10 minutach zbierz od pięciu do 10 losowych pól widzenia.

Niestymulowane komórki śródbłonka nie wspierają rekrutacji neutrofili. Dlatego poniższe rysunki pokazują neutrofile oddziałujące z komórkami śródbłonka stymulowanymi TNF alfa. Zwróć uwagę na przylegające neutrofile oznaczone żółtym grotem strzałki i migrujący neutrofile trans oznaczone białym grotem strzałki.

Transmigracja neutrofili może zachodzić na połączeniach komórkowych lub przez same komórki śródbłonka. Aby odróżnić te dwa stany, komórki śródbłonka zostały oznaczone koherentnym przeciwciałem anty VE. Jak widać tutaj na czerwono, transmigracja jest oceniana jako występująca parakomórkowo lub transkomórkowo.

W tym modelu praktycznie cała transmigracja jest parakomórkowa, jak pokazano na tym rysunku przedstawiającym nakładkę poprzednich dwóch wykresów. Na tym pierwszym z trzech wykresów zbadano i zmierzono oddziaływania neutrofili za pomocą oprogramowania do obrazowania J. Należy zauważyć, że znacznie więcej interakcji komórek śródbłonka neutrofili wystąpiło między neutrofilami a komórkami śródbłonka aktywowanymi TNF alfa niż w przypadku kontrolnych niestymulowanych komórek śródbłonka.

Całkowite oddziałujące komórki zostały następnie scharakteryzowane jako toczące się lub mocno przylegające lub migrujące trans, jak wcześniej. Znacznie większa transmigracja neutrofili nastąpiła w studzienkach zawierających aktywowane komórki śródbłonka po wyizolowaniu komórek śródbłonka. Inne metody, takie jak western blot, PCR w czasie rzeczywistym i oporność śródbłonka, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z biologią komórek śródbłonka po opracowaniu.

Metoda ta pomoże naukowcom zajmującym się stanem zapalnym i biologią naczyń krwionośnych zrozumieć, w jaki sposób rekrutacja leukocytów odbywa się w warunkach przepływu w ludzkim systemie modelowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej i wykorzystać je do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu za pomocą komory ity.