Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [^Ca2+]_i i tlenku azotu

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia komórkom śródbłonka wzrost pod fizjologicznie istotnym przepływem ścinającym oraz zmierzenie wywołanych przez agonistów zmian w produkcji wapnia i tlenku azotu. Wiadomość ta może przyczynić się do rozwoju badań nad mikronaczyniami w przyszłości poprzez walidację modelu mikronaczyń in vitro i wypełnienie luk między badaniami in vivo i in vitro. Głównymi zaletami tej techniki jest wszechstronna konstrukcja mikrokanalików naśladujących różne naczynia krwionośne i poprawiające środowisko hodowli komórkowej, które jest bliższe in vivo niż warunkowe statyczne do oryginalnych kultur.

Procedury zademonstrują Sulei i Xiang, obaj z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem użyj standardowej fotolitografii, aby stworzyć główną formę i miękkiej litografii, aby wytworzyć urządzenia mikrokanałowe PDMS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować urządzenia mikrokanałowe, najpierw przykryj wlot i wylot cienkim kawałkiem PDMS i umieść urządzenie w szalce Petriego z mokrą chusteczką.

Następnie owiń naczynie Parafilmem i sterylizuj urządzenie pod światłem UV przez co najmniej trzy godziny. Następnym krokiem jest zastosowanie fibronektyny. Najpierw umieść kroplę od 30 do 50 mikrolitrów PBS na wlocie.

Stwórz podciśnienie na wylocie, aby przepłukać urządzenie. Następnie umieść kroplę 100 mikrogramów na mililitr fibronektyny na wlocie. Stwórz podciśnienie na wylocie, aby załadować roztwór fibronektyny.

Następnie zakryj wlot i wylot. Ponownie owiń naczynie Parafilmem i inkubuj urządzenie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia trzykrotnie ręcznie przepłucz urządzenie PBS.

Następnie załaduj je 30 do 50 mikrolitrami pożywki do hodowli komórkowych i rozgrzej urządzenie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut. Zacznij od zmieszania HUVEC z pożywką hodowlaną HUVEC z ośmioprocentowym dekstranem w ilości od dwóch do czterech milionów komórek na mililitr. Dekstran jest potrzebny do zwiększenia lepkości, a tym samym poprawy wysiewu komórek.

Następnie umieść od 10 do 20 mikrolitrów komórek nad wlotem i wprowadź je za pomocą grawitacji lub za pomocą działania kapilarnego ze szklanej pipety Pasteura na wylocie. Następnie inkubuj urządzenie przez 15 do 20 minut. Następnie sprawdź stan wysiewu pod mikroskopem.

W razie potrzeby załaduj więcej komórek, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek. Po załadowaniu wystarczającej liczby komórek delikatnie przepłucz urządzenie normalną, ciepłą pożywką do hodowli komórek, aby usunąć dekstran. Następnie hoduj urządzenie bez perfuzji pożywki przez sześć godzin.

Następnie skonfiguruj połączenia przewodów do długotrwałej perfuzji. Przyklej urządzenie do szalki Petriego, a następnie podłącz rurkę wlotową do strzykawki z igłą. Włóż rurkę zarówno do wlotu, jak i wylotu urządzenia.

Podłącz rurkę wylotową do pojemnika na odpady. Teraz umieść naczynie i pojemnik na odpady w inkubatorze. Podłączyć strzykawkę z długą rurką wlotową do zewnętrznej pompy perfuzyjnej, która przechodzi przez drzwi inkubatora.

Następnie ustaw szybkość perfuzji zgodnie z projektem eksperymentalnym. Przy dobrze kontrolowanej perfuzji hodowla w sieci mikronaczyń może być utrzymywana do dwóch tygodni. W związku z tym można go rozszerzyć na długoterminowe badania naśladujące środowisko komórkowe i hemodynamiczne dotyczące różnych stanów fizjologicznych i patologicznych.

Aby rozpocząć barwienie immunologiczne, takie jak znakowanie VE-kadheryny, najpierw utrwal komórki poprzez perfuzję z dwuprocentowym paraformaldehydem przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po serii perfuzji w celu zablokowania, przepuszczalności i barwienia przeciwciałami, utrzymuj urządzenie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż komórki zostaną zobrazowane. Aby zobrazować stężenie wapnia w komórkach, należy perfuzjować urządzenie 10 miligramami na mililitr albuminy w roztworze Ringera przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie należy wykonać fuzję urządzenia za pomocą pięciu mikromolowych Fluo-4 AM przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przepłucz światło związane z Fluo-4 AM albuminą Ringers przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie uruchom system konfokalny do międzykomórkowego obrazowania poziomu wapnia za pomocą Fluo-4 AM. Uzyskaj obrazy mikronaczyń wypełnionych Fluo-4.

Zbieraj obrazy linii bazowej przez 10 minut. Następnie należy perfekować urządzenie w sposób ciągły 10 mikromolowym ATP i rejestrować zmiany intensywności fluorescencji przez 20 minut. Aby zobrazować produkcję tlenku azotu w komórkach, należy perfuzjować urządzenie albuminą Ringers przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie perfuzjuj komórki 5 mikromolowymi DAF-2 DA przez około 35 do 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie skonfiguruj system obrazowania fluorescencyjnego, aby zmierzyć produkcję tlenku azotu indukowaną ATP. Rejestruj linię bazową przez 5 minut, a następnie perfuzuj urządzenie 10 mikromolowym ATP i zbieraj obrazy przez 30 minut w odstępach jednominutowych.

W przypadku pomiaru tlenku azotu w ogniwie ważne jest, aby zrozumieć, że adapter odłączania dla profilu intensywności reprezentuje skumulowaną produkcję tlenku azotu w czasie, a nie stężenie tlenku azotu. Ręcznie wybierz region zainteresowań z zebranych obrazów na poziomie poszczególnych komórek. Każdy ROI obejmuje obszar komórki jednej osoby, który można wskazać za pomocą konturu floresense.

Określ ilościowo wywołane ATP zmiany w śródbłonku wapnia i tlenku azotu. Obliczając zmiany intensywności fluoresense Fluo-4, pomniejszonej o tło tkankowe. Określ ilościowo szybkość produkcji podtlenku azotu, przeprowadzając pierwszą różnicową konwersję intensywności floresense DAF-2 w czasie.

Wzorzec mikrokanałów w urządzeniu ma trzypoziomową sieć rozgałęzioną. Przeprowadzono symulację numeryczną 3D w celu oszacowania rozkładu naprężeń ścinających przy natężeniu przepływu 0,35 mikrolitra na minutę. Komórki śródbłonka wchodziły do sieci zgodnie z opisem.

Następnie znakowano F-aktynę i jądra. Podobnie wybarwiono również kadherynę VE. Wyniki były podobne do ekspresji kadheryny VE w nienaruszonej żyłce.

Następnie zbadano indukowany ATP wzrost wewnątrzkomórkowej produkcji wapnia i tlenku azotu. Poziom wapnia badano za pomocą Fluo-4 AM, jak opisano w sekcji protokołu. Produkcję tlenku azotu monitorowano za pomocą DAF-2 DA, jak opisano w rozdziale protokołu.

Wyniki były porównywalne z wynikami uzyskanymi w przypadku indywidualnie perfundowanych nienaruszonych żyłek. Zaawansowany był łatwy i ściśle kontrolowany w warunkach biologicznych i dynamicznym środowisku płynów, co nie byłoby możliwe przy użyciu konwencjonalnych technik mikroumiejętności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyprodukować urządzenie i wykonać pomiary tlenku wapnia i azotu.

Po tym technika utorowała drogę naukowcom, nie tylko do zbadania leżących u podstaw indukcji agonistycznych, ale także do otwarcia szerszych zastosowań dla badań biomedycznych.