Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [^Ca2+]_i i tlenku azotu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia wzrost komórek śródbłonka w warunkach fizjologicznie istotnego przepływu ścinającego oraz pomiar zmian w produkcji wapnia i tlenku azotu indukowanych przez agonistę. Metoda ta może pomóc w rozwoju przyszłych badań nad mikronaczyniami poprzez walidację modelu mikronaczynia in vitro oraz wypełnienie luk między badaniami in vivo a in vitro. Głównymi zaletami tej techniki są wszechstronna konstrukcja mikrokanałów naśladująca różne typy naczyń krwionośnych oraz poprawa środowiska hodowli komórkowej, które jest bliższe warunkom in vivo niż statyczne warunki stosowane w tradycyjnych hodowlach.

Procedur demonstracją zajmą się Sulei i Xiang, członkowie mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem należy zastosować standardową fotolitografię w celu wykonania formy matki oraz litografię miękką do wytworzenia urządzeń z mikrokanałami PDMS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować urządzenia z mikrokanałami, należy najpierw przykryć wlot i wylot cienkim kawałkiem PDMS, a następnie umieścić urządzenie w szalce Petriego z mokrą chusteczką.

Następnie owiń naczynie folią Parafilm i wysterylizuj urządzenie pod światłem UV przez co najmniej trzy godziny. Kolejnym krokiem jest naniesienie fibronektyny. Najpierw nanieś kroplę od 30 do 50 µL PBS w miejscu wlotu.

Stwórz podciśnienie na wylocie, aby przepłukać urządzenie. Następnie nanieś kroplę fibronektyny o stężeniu 100 µg/mL na wlot. Stwórz podciśnienie na wylocie, aby wprowadzić roztwór fibronektyny.

Następnie zakryj wlot i wylot. Ponownie owiń szalkę folią Parafilm i inkubuj urządzenie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia trzykrotnie wypłucz urządzenie ręcznie za pomocą PBS.

Następnie należy napełnić urządzenie od 30 do 50 µL pożywki do hodowli komórek i ogrzać je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut. W pierwszej kolejności należy zmieszać komórki HUVEC z pożywką do hodowli HUVEC zawierającą 8% Dextranu w stężeniu od dwóch do czterech milionów komórek na ml. Dextran jest niezbędny do zwiększenia lepkości, co poprawia wysiew komórek.

Następnie nanieś od 10 do 20 µL zawiesiny komórek nad wlot i wprowadź je do urządzenia, wykorzystując grawitację lub działanie kapilarne za pomocą szklanej pipety Pasteura przy wylocie. Następnie inkubuj urządzenie przez 15 do 20 minut. Potem sprawdź status wysiewu pod mikroskopem.

W razie potrzeby należy załadować więcej komórek, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórkową. Po załadowaniu odpowiedniej liczby komórek należy delikatnie przepłukać urządzenie zwykłą, ciepłą pożywką do hodowli komórkowej, aby usunąć dekstran. Następnie urządzenie należy inkubować bez perfuzji pożywki przez sześć godzin.

Następnie przygotuj połączenia drenów do długoterminowej perfuzji. Przymocuj urządzenie taśmą do szalki Petriego, a następnie podłącz drena dopływowy do strzykawki z igłą. Włóż dreny zarówno do wlotu, jak i wylotu urządzenia.

Podłącz rurkę odpływową do pojemnika na odpady. Następnie umieść szalkę i pojemnik na odpady w inkubatorze. Podłącz strzykawkę z długą rurką doprowadzającą do zewnętrznej pompy perfuzyjnej, która przechodzi przez drzwi inkubatora.

Następnie ustaw prędkość perfuzji zgodnie z planem eksperymentalnym. Przy dobrze kontrolowanej perfuzji hodowla w sieci mikronaczyniowej może być utrzymywana do dwóch tygodni. Dzięki temu można ją wykorzystać w badaniach długoterminowych, naśladujących środowisko komórkowe i hemodynamiczne w różnych stanach fizjologicznych oraz patologicznych.

Aby rozpocząć immunobarwienie, np. znakowanie VE-cadherin, najpierw utrwalone komórki poprzez perfuzję dwuprocentowym paraformaldehydem przez 30 minut w temperaturze 4°C. Po serii perfuzji w celu blokowania, permeabilizacji i barwienia przeciwciałami, urządzenie należy przechowywać w temperaturze 4°C do momentu obrazowania komórek. Aby zobrazować stężenie wapnia w komórkach, przepłucz urządzenie roztworem Ringera z dodatkiem 10 mg/mL albuminy przez 15 minut w temperaturze 37°C.

Następnie przemywaj urządzenie pięciomikromolarnym Fluo-4 AM przez 40 minut w temperaturze 37 °C. Potem wypłucz związany z lumenem Fluo-4 AM roztworem albumin Ringers przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Następnie uruchom system konfokalny do obrazowania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia z użyciem Fluo-4 AM. Pozyskaj obrazy mikro naczyń załadowanych Fluo-4.

Zbieraj obrazy bazowe przez 10 minut. Następnie perfunduj urządzenie w sposób ciągły 10 µM ATP i rejestruj zmiany intensywności fluorescencji przez 20 minut. Aby obrazować produkcję tlenku azotu w komórkach, perfunduj urządzenie roztworem Ringer-albuminy przez 15 minut w temperaturze 37 °C.

Następnie perfunduj komórki 5 µM DAF-2 DA przez około 35 do 40 minut w temperaturze 37 °C. Dalej, skonfiguruj system obrazowania fluorescencyjnego, aby zmierzyć indukowaną przez ATP produkcję tlenku azotu. Zapisz poziom bazowy przez 5 minut, a następnie perfunduj urządzenie 10 µM ATP i przejmij obrazy przez 30 minut w odstępach jednominutowych.

W przypadku pomiaru tlenku azotu w komórkach ważne jest zrozumienie, że adapter oddzielający dla profilu intensywności reprezentuje skumulowaną produkcję tlenku azotu w czasie, a nie jego stężenie. Ręcznie zaznacz obszary zainteresowania (ROI) na zebranych obrazach na poziomie poszczególnych komórek. Każdy ROI obejmuje obszar jednej pojedynczej komórki, który może być wskazany przez obrys fluorescencyjny.

Ilościowo określ zmiany poziomu wapnia oraz tlenku azotu w śródbłonku wywołane przez ATP. Obliczenia należy przeprowadzić na podstawie zmian intensywności fluorescencji Fluo-4, po odjęciu tła tkankowego. Szybkość produkcji tlenku azotu należy wyznaczyć poprzez obliczenie pierwszej pochodnej intensywności fluorescencji DAF-2 w funkcji czasu.

Wzór mikrokanałów w urządzeniu posiada trójstopniową sieć rozgałęzień. Przeprowadzono trójwymiarową symulację numeryczną w celu oszacowania rozkładów naprężeń ścinających przy szybkości przepływu 0,35 µL/min. Komórki śródbłonka wysiano do sieci zgodnie z opisem.

Następnie przeprowadzono znakowanie F-aktyny oraz jąder komórkowych. W podobny sposób wykonano barwienie VE-kadheryny. Wyniki były zbliżone do ekspresji VE-kadheryny w nienaruszonej żyłce.

Następnie zbadano wzrosty stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia oraz produkcji tlenku azotu indukowane przez ATP. Poziomy wapnia badano z użyciem Fluo-4 AM zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Produkcję tlenku azotu monitorowano z użyciem DAF-2 DA zgodnie z opisem w sekcji protokołu.

Wyniki były porównywalne z tymi uzyskanymi przy użyciu indywidualnie perfundowanych nienaruszonych żyłek. Zaawansowanie było łatwe i ściśle kontrolowane w warunkach biologicznych i dynamicznych środowisk płynowych, co nie byłoby możliwe przy zastosowaniu konwencjonalnych technik mikrochirurgicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykonać urządzenie oraz przeprowadzić pomiary wapnia i tlenku azotu.

Dzięki temu, że technika ta utorowała drogę badaczom, możliwe stało się nie tylko badanie mechanizmów indukowanych przez agonistę, ale także otwarcie szerszych możliwości zastosowań w badaniach biomedycznych.