Name: Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę badania rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala rozróżnić transmigrację i adhezję komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Paulowi Bradfieldowi za przeczytanie manuskryptu i informacje zwrotne. A. S. otrzymał wsparcie finansowe od Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust Reg.,

Materiały pochodzenia ludzkiego zostały wykorzystane za świadomą zgodą ochotników i zgodnie z wytycznymi Szwajcarskich Komitetów Etycznych ds. badań klinicznych.
1. Izolacja i zamrażanie ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem izolacji HUVEC dodać do kolby T75 5 mL roztworu powlekającego (0,1 mg/mL kolagenu G i 0,2% żelatyny w PBS o pH 7,4) i inkubować przez 30 min w 37 °C.</li>
	<li>Przepłukać pępowinę PBS, wytrzeć sterylnymi kompresami i umieścić w sterylnym naczyniu Petriego o średnicy 20 cm. Odciąć końce pępowiny sterylnymi nożyczkami.</li>
	<li>Zidentyfikować jedną dużą żyłę oraz dwie małe tętnice. Delikatnie wprowadzić kaniulę z przymocowanym kurkiem trójdrożnym do końców żyły na końcach pępowiny.</li>
	<li>Mocno zabezpieczyć połączenie pępowiny z kaniulą za pomocą kawałka drutu.</li>
	<li>Przepłukać pępowinę dwukrotnie 20 mL medium RPMI zawierającego 10 U/mL penicyliny, 10 U/mL streptomycyny oraz 250 ng/mL amfoterycyny B, aby oczyścić żyły pępowiny. Proces ten sprawia, że pępowina staje się bielsza i bardziej przejrzysta. Przed dodaniem kolagenazy opróżnić żyłę, zbierając medium RPMI strzykawką z jednego końca.</li>
	<li>Przepłukać żyłę 12 mL kolagenazy typu I o stężeniu 1 mg/mL (przefiltrowanej przez filtr 0,2 µm).</li>
	<li>Zamknąć kurek na końcach pępowiny i inkubować pępowinę w 37 °C przez 12 min.</li>
	<li>Delikatnie masować pępowinę, aby odseparować komórki śródbłonka z światła żyły.</li>
	<li>Pobrać 30 mL medium RPMI zawierającego 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) do strzykawki 50 mL i podłączyć ją do jednego końca pępowiny.</li>
	<li>Podłączyć pustą strzykawkę 50 mL do drugiego końca pępowiny.</li>
	<li>Otworzyć kurek i przepłukać żyłę z jednego końca, jednocześnie zbierając zawiesinę z drugiego końca. 
	UWAGA: Zebrana zawiesina zawiera komórki śródbłonka.</li>
	<li>Odwirować tę zawiesinę komórkową przy 20 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odlać supernatant i resuspendować osad komórkowy w 10 mL kompletnego medium M19 (M19 zawierające 20% FCS, 15 µg/mL suplementów wzrostu komórek śródbłonka, 100 µg/mL heparyny sodowej, 0,5 µM hydrokortyzonu, 10 µg/mL kwasu L-askorbinowego, 10 U/mL penicyliny, 100 U/mL streptomycyny oraz 250 ng/mL amfoterycyny B).</li>
	<li>Usunąć roztwór powlekający z kolby T75 i przepłukać ją raz PBS.</li>
	<li>Zasiać komórki zebrane w kroku 1.13 do kolby T75 i umieścić ją w inkubatorze w 37 °C przy 5% CO2.</li>
	<li>Następnego dnia przepłukać kolbę 3 razy kompletnym medium M19, aby usunąć resztkowe krwinki czerwone, a następnie wymieniać medium co 2 dni aż do osiągnięcia konfluencji.</li>
	<li>Przy konfluencji 80–90% przepłukać monowarstwę HUVEC raz 5 mL PBS i odseparować komórki za pomocą 5 mL 0,05% trypsyny w 1 mM EDTA w 37 °C przez 5 min. Dodać 4 mL M19 i 1 mL FCS, aby zatrzymać działanie trypsyny. Przepłukać kolbę, aby odzyskać wszystkie komórki HUVEC.</li>
	<li>Pobrać alikwot 50 µL do barwienia na VE-cadherin, PECAM-1 oraz gp38 i analizować metodą cytometrii przepływowej w celu sprawdzenia czystości HUVEC.</li>
	<li>Pozostałe komórki HUVEC z kroku 1.18 zebrać do probówki 15 mL i odwirować przy 20 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odlać supernatant z kroku 1.19, resuspendować osad komórkowy w roztworze do mrożenia (FCS zawierający 10% DMSO) przy gęstości 5 x 105 komórek/mL w probówkach kriogenicznych i zamrozić w -80 °C lub w ciekłym azotcie do czasu użycia.</li>
	<li>Aby sprawdzić czystość HUVEC:
	<ol>
		<li>Do alikwotu 50 µL HUVEC zebranego w kroku 1.18 dodać 1 µL przeciwciała anty-ludzkiego VE-cadherin-FITC, 1 µL przeciwciała anty-ludzkiego PECAM1-PE oraz 1 µL przeciwciała anty-ludzkiego Podoplanin-APC.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
		<li>Dodać 10 µL PBS i odwirować przy 400 x g przez 30 s.</li>
		<li>Odlać supernatant i resuspendować w 10 µL PBS. Dane można teraz pozyskać za pomocą technik cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Komórki HUVEC są pozytywne dla VE-cadherin i PECAM-1 oraz negatywne dla podoplaniny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rozmrażanie komórek HUVEC
UWAGA: Do eksperymentów należy używać komórek HUVEC o niskim numerze pasażu (maksymalnie 5 pasaży).
<ol>
	<li>Pokryć kolbę T75 1 mL roztworu do pokrywania w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
	<li>Szybko rozmrozić HUVEC w temperaturze 37 °C przez 2 min i resuspenderać komórki w 10 mL kompletnego medium M19.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min i odrzucić nadsącz.</li>
	<li>Resuspenderać osad komórkowy w 10 mL kompletnego medium M19.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do uprzednio pokrytej kolby. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2. Wymieniać medium hodowlane co 2 dni.</li>
</ol>
3. Hodowla HUVEC w komorze 0.4 µ-Slide
<ol>
	<li>Na pięć dni przed rozpoczęciem eksperymentu z przepływem, pokryj komory slajdu 0,4 µ przy użyciu 30 µL PBS zawierającego 0,1 mg/mL kolagenu G oraz 0,2% żelatyny w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
	<li>Przepłucz komory 10 µL PBS.</li>
	<li>Odczep komórki z hodowli HUVEC w kolbie T75 przy konfluencji 80–90%.</li>
	<li>Opłucz HUVEC 5 mL PBS i odczep je za pomocą 5 mL 0,05% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
	<li>Wypłucz i zbierz zawiesinę komórkową do pełnej pożywki M199, a następnie policz komórki najwygodniejszą metodą. Wirować przy 20 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Resuspenduj osad komórkowy do stężenia 106 komórek/mL i rozdziel 30 µL (30 0 komórek) na każdą komorę.</li>
	<li>Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 1 h.</li>
	<li>Dodaj 150 µL pełnej pożywki M199 do każdej komory i hoduj komórki przez 5 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Wymieniaj pożywkę co 2 dni.</li>
</ol>
4. Barwienie HUVEC do testu rekrutacji monocytów w warunkach przepływu
<ol>
	<li>Przygotować medium do znakowania składające się z M19 i 1 µM CMFDA (diacetat 5-chlorometylofluoresceiny) i podgrzać je w temperaturze 37 °C przez 5 min przed znakowaniem komórek.</li>
	<li>Przepłukać komórki HUVEC dwukrotnie podgrzanym do 37 °C medium M19.</li>
	<li>Zastąpić medium 30 µL podgrzanego medium do znakowania zawierającego 1 µM CMFDA i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 min.</li>
	<li>Przepłukać raz kompletnym medium M19 i inkubować komórki w kompletnym medium M19 w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 min. 
	UWAGA: Ważne jest usunięcie wszystkich śladów serum przed dodaniem roztworu znakującego, w przeciwnym razie może to wpłynąć na barwienie HUVEC.</li>
	<li>Zastąpić medium kompletnym medium M199 zawierającym ludzki TNFα (50 U/mL) lub mieszankę ludzkiego TNFα (50 U/mL) z ludzkim VEGFA (1 µg/mL) i inkubować przez 6 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
5. Izolacja monocytów z trzustki ludzkiej i barwienie subpopulacji
<ol>
	<li>Należy użyć warstwy leukocytowej (buffy coat) skoncentrowanej krwi ludzkiej lub 20 mL świeżo pobranej krwi ludzkiej, zebranej w dniu eksperymentu do probówek typu vacutainer z EDTA.</li>
	<li>Krew należy rozcieńczyć w PBS-1 mM EDTA (1:1), a następnie ostrożnie nanieść pipetą 20 mL rozcieńczonej krwi na 20 mL medium gradientu gęstości. Wirować przy 40 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej, z powolnym przyspieszaniem i bez hamowania.</li>
	<li>Warstwę mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) i płytek krwi (znajdującą się między medium gradientu gęstości a warstwą osocza) należy zebrać do nowej probówki 50 mL zawierającej 40 mL PBS- 1 mM EDTA. Uzupełnić objętość do 50 mL za pomocą PBS- 1 mM EDTA.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Osad komórkowy należy zawiesić w 10 mL buforu do barwienia (PBS- 1 mM EDTA zawierający 0,5% albuminy surowicy bydlęcej BSA).</li>
	<li>Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.5 i 5.6.</li>
	<li>Osad komórkowy należy ponownie zawiesić w 10 mL buforu do barwienia. Pobrać alikwot 10 µL do pomiaru liczby komórek.</li>
	<li>Sprawdzić populacje PBMC i szybko policzyć komórki za pomocą cytometru przepływowego. 
	UWAGA: Można zaobserwować charakterystyczne populacje limfocytów i monocytów (Rysunek 1A). Z 50 mL świeżej krwi ludzkiej można spodziewać się około 50-100 x 106 PBMC.</li>
	<li>W celu badania rekrutacji PBMC CD14+ versus CDMC CD14- w przepływie:
	<ol>
		<li>Przemyć osad trzykrotnie buforem do przepływu (M19 zawierający 0,5% BSA) i zawiesić komórki mononuklearne w buforze do przepływu w stężeniu 6 x 106 komórek na mL.</li>
		<li>Przygotować alikwoty po 20 µL dla każdego testu. Inkubować w 37 °C do 20 min przed rozpoczęciem testu.</li>
		<li>Do każdego alikwotu dodać 5 µL przeciwciała anty-CD14-PE oraz Hoechst 3342 do końcowego stężenia 2 µM. Wymieszać i inkubować w 37 °C przez 10 min.</li>
		<li>Wirować alikwot przy 40 x g przez 30 s.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 200 µL buforu do przepływu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu badania rekrutacji subpopulacji monocytów w przepływie:
	<ol>
		<li>Wyizolować monocyty za pomocą zestawu do izolacji wszystkich monocytów (pan monocyte isolation kit) zgodnie z instrukcją producenta. 
		UWAGA: Poniższy protokół izolacji jest przeznaczony dla 50 x 106 komórek. Można go skalować w górę lub w dół, o ile mieści się to w zaleceniach producenta.</li>
		<li>Suspensję PBMC wirować przy 20 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 40 µL buforu do barwienia.</li>
		<li>Dodać 50 µL odczynnika blokującego receptory Fc oraz 50 µL koktajlu przeciwciał Pan Monocyte.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
		<li>Dodać 400 µL buforu do barwienia i 10 µL przeciwciał anty-biotynowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.</li>
		<li>Dodać 2 mL buforu do barwienia i użyć kolumny MACS LS połączonej z magnesem.</li>
		<li>Umieścić kolumnę LS na magnesie i dodać 1 mL buforu do barwienia. Odrzucić przesącz.</li>
		<li>Przepuścić suspensję PBMC przez kolumnę i zebrać klarowny przesącz zawierający wszystkie monocyty do nowej probówki 15 mL.</li>
		<li>Dodać bufor do barwienia, aby uzupełnić objętość do 5 mL.</li>
		<li>Pobrać alikwot i sprawdzić jakość izolacji monocytów za pomocą cytometru przepływowego.</li>
		<li>Wyznaczyć liczbę wszystkich monocytów. 
		UWAGA: Można zaobserwować wyłącznie populację monocytów (Rysunek 1B).</li>
		<li>Pozostałe monocyty z kroku 5.1.11 wirować przy 20 x g przez 5 min.</li>
		<li>Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 mL buforu do przepływu (M19 zawierający 0,5% BSA).</li>
		<li>Powtórzyć kroki od 5.1.13 do 5.1.14 dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady EDTA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować suspensję monocytów w buforze do przepływu (M19 z 0,5% BSA) w stężeniu 6 x 106 komórek/mL.</li>
	<li>Przygotować alikwoty po 20 µL monocytów dla każdego testu rekrutacji.</li>
	<li>Przechowywać alikwoty w inkubatorze w 37 °C do 20 min przed wstrzyknięciem.</li>
	<li>Do każdego alikwotu dodać 5 µL przeciwciała anty-CD16-PE oraz Hoechst 342 (stężenie końcowe 2 µM).</li>
	<li>Wymieszać i inkubować w 37 °C przez 10 min.</li>
	<li>Wirować alikwot przy 40 x g przez 30 s.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 250 µL buforu do przepływu.</li>
	<li>Dodać 30 µL suspensji monocytów do jednej komory szkiełka, aby służyła ona do ustawienia parametrów akwizycji w mikroskopie konfokalnym.</li>
	<li>Przechowywać alikwoty suspensji monocytów z kroku 5.18 w 37 °C. 
	UWAGA: Taka suspensja jest gotowa do wstrzyknięcia do systemu przepływowego.</li>
</ol>
6. Przygotowanie układu mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Upewnij się, że inkubator komórkowy do obrazowania został ustawiony na 37 °C. 
	UWAGA: Schemat układu przepływowego przedstawiono na Rysunek 2.</li>
	<li>Montaż części rurek I: Włóż męski konektor Luer do jednego końca odcinka rurki silikonowej (o długości 8 cm i grubości 3 mm), a drugi koniec podłącz do liniowego zestawu do wstrzykiwania Luer. Następnie podłącz wspomniany konektor Luer do jednego końca odcinka rurki silikonowej (o długości 40 cm i grubości 3 mm). 
	UWAGA: Opcjonalnie, między liniowy zestaw wstrzykiwaczy Luer a rurkę silikonową można wstawić trójdrożny kran połączony z strzykawką o pojemności 5 ml w celu ewentualnego usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Montaż drenów, część II: Podłącz strzykawkę o pojemności 20 ml do jednego końca odcinka rurki silikonowej (o długości 1 m i grubości 3 mm). Do drugiego końca rurki wprowadź męski konektor Luer.</li>
	<li>Połącz wężyki z części I i części II, wkładając męskie końcówki Luer do żeńskiej złączki Luer lock (Rycina 2A).</li>
	<li>Umieść wolny koniec rurki silikonowej w zbiorniku zawierającym bufor przepływowy (M19 + 0,5% BSA) podgrzany do 37 °C.</li>
	<li>Pociągnij tłok strzykawki o pojemności 20 ml, aby napełnić przewody buforem przepływowym.</li>
	<li>Umieść strzykawkę w pompie i zabezpiecz ją.</li>
	<li>Ustaw pompę w trybie pobierania (w przeciwieństwie do trybu podawania) i określ szybkość przepływu.</li>
	<li>Wyznacz prędkość przepływu zgodnie z użytym szkiełkiem IBIDI, stosując następujący wzór: 
	<img alt="Równanie szybkości przepływu: naprężenie ścinające podzielone przez lepkość buforu i współczynnik slajdu; wzór dynamiki płynów." src="/files/ftp_upload/58509/58509eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
	Uwaga: Współczynnik slajdu zależy od rodzaju slajdu IBIDI użytego w eksperymencie. Dla µ-slajd I0.4 W przypadku zastosowanego w tym przykładzie złącza Luer lock współczynnik przesunięcia wynosi 131,6. W celu uzyskania konkretnych współczynników przesunięcia należy odwiedzić stronę internetową firmy.14Lepkość buforu przepływowego wynosi 0,072 dyn·s/cm.2Naprężenie ścinające w żylkach posutylarnych wynosi około 0,5 dyn/cm².2.</li>
	<li>Podłącz preparat (Rycina 2B):
	<ol>
		<li>Zaciśnij rurkę silikonową wokół żeńskiego łącznika Luer Lock i odłącz dwa męskie złącza Luer od łącznika.</li>
		<li>Podłączyć je do zbiorników na płytce zawierającej stymulowane komórki HUVEC i napełnić pożywką. Na tym etapie należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Zdejmij zaciski i upewnij się, że połączenie nie przecieka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść preparat pod mikroskopem w celu wykonania obrazowania time-lapse i uruchom pompę.</li>
</ol>
7. Obrazowanie time-lapse rekrutacji monocytów w warunkach przepływu za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Do obrazowania użyj obiektywu 40x (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Aktywuj lasery 405 nm (niebieskie jądra monocytów), 48 nm (zielone komórki śródbłonka) i 561 nm (czerwony podzbiór CD16+).</li>
	<li>Użyj komory zawierającej monocyty do ustawienia parametrów akwizycji. 
	UWAGA: Aby wykryć zarówno monocyty nietransmigrowane, jak i transmigrowane, otwór pinhole oraz intensywność lasera 405 nm ustawiono na wysoką wartość. W związku z tym monocyty nietransmigrowane są słabo widoczne w płaszczyźnie podstawnej. Jednak tylko monocyty transmigrowane wykazują niebarwiony obszar wokół jądra, odpowiadający nowej przestrzeni zajmowanej pod komórkami śródbłonka.</li>
	<li>Umieść komorę do obrazowania pod mikroskopem.</li>
	<li>Wybierz 3 pola widzenia w promieniu 1 cm do konfokalnego obrazowania wielopunktowego.</li>
	<li>Zdefiniuj stronę podstawną i apikalną komórek śródbłonka.</li>
	<li>Ustaw z-stack w zakresie 10–12 µm (krok 0,5 µm). Przeprowadź akwizycję time-lapse co 1 min.</li>
	<li>Po 3 min obrazowania wstrzyknij 20 µL zawiesiny monocytów (6x106 komórek/mL) przez liniowy port wtryskowy Luer. 
	UWAGA: Monocyty szybko pojawiają się w apikalnej płaszczyźnie ogniskowej, przylegają i rozpoczynają transmigrację (przechodzą z płaszczyzny apikalnej do podstawnej).</li>
	<li>Obrazuj przez co najmniej 30 min. Po zakończeniu przerwij obrazowanie i zatrzymaj przepływ. Zaciśnij rurki, aby odłączyć je od preparatu.</li>
	<li>Utrwal preparat 4% paraformaldehydem w 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Przemyj preparat buforem PBS i przechowuj w 4 °C do dalszej analizy, jeśli jest to wymagane.</li>
</ol>
8. Analiza danych w programie ImageJ
<ol>
	<li>Policz całkowitą liczbę przytwierdzonych monocytów w każdym polu widzenia. Wyznacz liczbę komórek na mm2.</li>
	<li>Policz ztransmigrowane monocyty znajdujące się w płaszczyźnie podstawnej pod komórkami śródbłonka, identyfikując je po obecności „czarnej dziury” (w kanale zielonym) wokół jądra komórkowego.</li>
	<li>Podziel liczbę ztransmigrowanych leukocytów przez całkowitą liczbę przytwierdzonych leukocytów. Wskaźnik transmigracji przedstawia się jako procent monocytów przytwierdzonych.</li>
	<li>W celach ilustracyjnych można jednocześnie pokazać stronę apikalną i podstawną, aby zobrazować zdarzenia zachodzące w każdym z tych przedziałów śródbłonka.</li>
</ol>

<ol><li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Monocytes%3A+Development%2C+Heterogeneity%2C+and+Relationship+with+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li>
<li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li>
<li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355(2018).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li>
<li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163%E2%88%92+and+CD163%2B+monocytes+into+functional+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li>
<li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li>
<li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+%28TEMs%29+in+human+peripheral+blood+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li>
<li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li>
<li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li>
<li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li>
<li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Shear+Stress+and+Shear+Rates+for+ibidi+%C2%B5-Slides+-+Based+on+Numerical+Calculations%22">Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations</a>. , (2014).</li>
<li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li>
<li>Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1%2C+VCAM-1%2C+and+IL-8+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).</li>
<li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li>
<li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+%28Vestweber+series%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li>
<li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu przedstawiamy metodę szczegółowo opisującą badanie, w jaki sposób subpopulacje monocytów przemieszczają się przez monowarstwę śródbłonka objętą stanem zapalnym. W omawianej metodzie wykorzystano mikroskopię konfokalną zamiast mikroskopii z kontrastem fazowym, która jest również wykorzystywana do badania rekrutacji monocytów pod przepływem 3,11,19. Jedną z głównych zalet stosowania mikroskopii konfokalnej do obrazow...

Monocyty stanowią fagocytarny składnik wrodzonej odporności, który jest niezbędny do zwalczania patogenów, oczyszczania uszkodzonych tkanek, angiogenezy i patofizjologii wielu chorób, w tym nowotworów1,2,3. Monocyty to komórki pochodzące ze szpiku kostnego złożone z heterogennych subpopulacji, które krążą we krwi, ale mogą być rekrutowane do miejsca zapalenia w tkance obwodowej za pomocą określonych mechanizmów molekularnych. Kaskady rekrutacji monocytów, podobnie jak w przypadku leukocytów w ogóle, implikują różne etapy, w tym wychwytywanie, toczenie, pełzanie, zatrzymanie, migrację przezśródbłonkową (transmigracja) i migrację przez ścianę naczynia (błona podstawna i komórki ścienne)<klasa sup = "xref">4. Etapy te obejmują głównie cząsteczki wywołane stanem zapalnym na śródbłonkowej powierzchni światła, takie jak selektyny, ligandy glikoproteinowe, chemokiny, cząsteczki adhezyjne międzykomórkowe i połączeniowe oraz ich receptory na leukocytach, takie jak ligandy selektorynowe i integryny. Szlaki transportowe przez połączenia komórek śródbłonka (parakomórkowe) lub przez ciało komórki śródbłonka (transkomórkowe) mogą być wykorzystywane przez leukocyty do przekraczania bariery śródbłonka5. Chociaż historycznie udokumentowano, że monocyty migrują drogą transkomórkową, zaproponowano potencjalne rozbieżności w ich szlaku migracyjnym, ponieważ monocyty nie są już uważane za jednorodną populację komórek. Obecnie staje się jasne, że różnorodność monocytów może być definiowana przez każdą z ich różnic i cech wspólnych, w odniesieniu do ich charakterystycznych kaskad wynaczynienia3,6. Dlatego, aby jednoznacznie rozróżnić subpopulacje monocytów, kluczowe jest zobrazowanie i fenotypowanie zachowania każdej z tych różnych subpopulacji podczas procesu rekrutacji.
Monocyty człowieka, świni, szczura i myszy zostały podzielone na subpopulacje fenotypowe z pewnymi przypisanymi funkcjami i specyficznymi zachowaniami migracyjnymi7,8,9. Na przykład u ludzi monocyty można podzielić na trzy podzbiory w oparciu o ich powierzchniową ekspresję CD14, koreceptora dla bakteryjnego lipopolisacharydu i CD16, receptora Fc-gamma III. Subpopulacje ludzkich monocytów obejmują klasyczne CD14 + CD16-, pośrednie CD14 + CD16 + i nieklasyczneCD14 dimCD16 + komórki6,9. Wykazano, że klasyczne monocyty CD14 + CD16- są głównie zapalne, podczas gdy pula monocytów CD16 + łącznie wykazuje ekspresję TIE2 i funkcję proangiogenną 10. Konsekwentnie, stymulacja komórek śródbłonka cytokinami zapalnymi α takimi jak ludzki czynnik martwicy nowotworów (TNF) lub interleukina (IL-1)beta (konwencjonalne zapalenie), jest wystarczająca do wywołania pełnej rekrutacji klasycznych monocytów CD14 + CD16. Jednak jednoczesne działanie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)A i TNFα (zapalenie wywołane czynnikami angiogennymi) jest wymagane, aby sprowokować transmigrację puli proangiogennej monocyt<ów CD16 + sup class="xref">3. Historycznie rzecz biorąc, tradycyjny system Transwell w warunkach statycznych, równoległa komora przepływu płytowego i μ-suwakowe komory przepływowe były używane do ilościowej analizy rekrutacji jednej populacji leukocytów na raz in vitro11,12,13. Chociaż protokoły te zostały zweryfikowane, bardziej solidna metoda, która pozwoliła na jednoczesną analizę wielu subpopulacji monocytów, byłaby uważana za bardziej wnikliwą. Takie metodologie muszą uwzględniać wiele interakcji i różne częstości występowania w każdej populacji, a także zapewniać mechanistyczne zrozumienie podobieństw i specyfiki kaskad rekrutacyjnych, które definiują każdy podzbiór monocytów.
Tutaj prezentujemy metodę opartą na obrazowaniu poklatkowym rekrutacji monocytów w przepływie, która pozwala na jednoczesne badanie kaskad migracyjnych różnych subpopulacji monocytów za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta integruje pewne krytyczne cechy, które naśladują zapalenie komórek śródbłonka, a także hemodynamikę krążących monocytów w żyłkach pozakapilarnych, głównym miejscu rekrutacji leukocytów in vivo. Proponowana metoda wykorzystuje ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), które są generowane za pomocą dobrze ugruntowanego protokołu izolacji od ludzkiej pępowiny. Ten zasób kliniczny ma tę zaletę, że jest łatwo dostępny jako biologiczny produkt uboczny, a jednocześnie zapewnia rozsądną wydajność komórek śródbłonka, które można wyizolować z żyły pępowinowej. Użyliśmy również barwników fluorescencyjnych i immunofluorescencji, aby rozróżnić różne składniki komórkowe, oraz mikroskopii konfokalnej, aby jednoznacznie określić pozycjonowanie monocytów (luminalne vs. abluminalne) w czasie. Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu jednoczesnego pomiaru poziomów transmigracji subpopulacji monocytów. Ponadto należy zauważyć, że metodologia ta może zostać rozszerzona o badanie innych subpopulacji leukocytów i procesów rekrutacji przy użyciu różnych biomarkerów i znakowania.

<table><tbody><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych 75 cm2</td><td>TPP</td><td>90076</td><td>Rutynowa hodowla izolowanych HUVEC</td></tr><tr><td>&micro;-Slide VI 0,4</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 mL</td><td>TPP</td><td>191015</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 50 mL</td><td>TPP</td><td>191050</td><td></td></tr><tr><td>Collagen G</td><td>Biochrom</td><td>L 7213</td><td>Do powlekania hodowli komórkowych kolby</td></tr><tr><td>żelatynowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1393</td><td>Do powlekania kolb do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (bez MgCl2 i CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (z MgCl2 i CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>3-drożne zawory odcinające</td><td>BIO-RAD</td><td>7328103</td><td></td></tr><tr><td>penicylina 10 000 &mu;/ml streptomycyna 10 000 &mu; g/mL fungizone 25 &mu;/mL</td><td>AMIMED</td><td>4-02F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 1</td><td>Worthington</td><td>LS004216</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 1x avec Earle's salt, L-glutamina, 25 mM Hepes</td><td>GIBCO</td><td>22340020</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca frakcja V</td><td>ThermoFisher</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka, 150 mg</td><td>Milipore</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna Sól disodowa sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149RT</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6909</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A 4544</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sól disodowa dwuwodna C10H14N2Na2O8 &middot; 2H2O</td><td>APPLICHEM</td><td>A2937.0500</td><td></td></tr><tr><td>CD144 (VE-Cadherin), ludzki rekombinowany klon: REA199, FITC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-100-713</td><td>AB_2655150</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD31-PE, ludzki rekombinowany klon: REA730, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-807</td><td>AB_2657280</td></tr><tr><td>Anti-Podoplanin-APC, ludzki rekombinowany klon: REA446, APC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-107-016</td><td>AB_2653263</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Plus</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide I Luer</td><td>IBIDI</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA (dioctan 5-chlorometylofluoresceiny)</td><td>ThermoFisher</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TNF i alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka VEGFA</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>NE-1000 Programowalna pompa strzykawkowa</td><td>KF Technology</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp; Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD14-PE, ludzki rekombinowany klon: REA599, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-519</td><td>AB_2655051</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji Pan Monocyte, ludzki</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD16-PE, ludzki rekombinowany klon: REA423, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-106-762</td><td>AB_2655403</td></tr><tr><td>kolumny LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trichlorowodorek, trójwodzian</td><td>ThermoFisher</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>IBIDI</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>Złącze kolankowe Luer</td><td>IBIDI</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Żeńskie złącze Luer Lock</td><td>IBIDI</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Złącze Luer Lock żeńskie</td><td>IBIDI</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Liniowy port wtrysku Luer</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ar1 mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x</td><td>obiektyw Nikon</td><td>40x 0,6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3,6-2,8 mm korekcja 0-2 mm</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Rekrutacja monocytów z krwi do docelowych tkanek obwodowych jest kluczowa dla procesu zapalnego podczas uszkodzenia tkanki, rozwoju guza i chorób autoimmunologicznych. Jest to możliwe dzięki procesowi wychwytywania ze swobodnego przepływu na powierzchnię światła aktywowanych komórek śródbłonka, a następnie ich adhezji i migracji przezśródbłonkowej (transmigracji) do leżącej poniżej dotkniętej tkanki. Jednak mechanizmy, które wspierają preferencyjną i zależną od kontekstu rekrutację subpopulacji monocytów, nadal nie są w pełni poznane. Dlatego opracowaliśmy metodę, która pozwala na jednoczesną wizualizację i pomiar rekrutacji różnych subpopulacji monocytów pod przepływem. Metoda ta, oparta na poklatkowym obrazowaniu konfokalnym, pozwala na jednoznaczne rozróżnienie monocytów adherentnych i transmigrujących. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób można wykorzystać tę metodę do jednoczesnego badania kaskady rekrutacyjnej proangiogennych i nieangiogennych monocytów in vitro. Co więcej, metoda ta może zostać rozszerzona o różne etapy rekrutacji do trzech populacji monocytów.

Określanie stanu aktywacji HUVEC wywołanej przez TNFα
Bioaktywność cytokiny zapalnej TNFα może się różnić w zależności od partii oraz liczby cykli zamrażania i odmrażania. Ważne jest sprawdzenie stanu aktywacji HUVEC po traktowaniu TNFα. Można to przeprowadzić poprzez równoległe barwienie niektórych próbek konfluencyjnych HUVEC w celu oceny indukcji zapalnej selektyn, ICAM-1 oraz VCAM-115,<sup cla...

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Metoda ta może bowiem pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie zapalenia i immunologii. Na przykład, jaki jest molekularny mechanizm adhezji leukocytów i migracji przezśródbłonkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na nieograniczone zastosowanie rozróżniania między transmigracją a silnym dodawaniem monocytów do monowarstwy śródbłonka.Chociaż metoda ta dostarcza informacji na temat rekrutacji monocytów w przepływie, można ją również dostosować do innych komórek układu krwiotwórczego, takich jak limfocyty T, limfocyty B lub pochodne ich subpopulacji. Po umyciu oznacz ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub HUVEC 30 mikrolitrami pożywki M199 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej jednym mikromolowym CMFDA przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji przemyć komórki 150 mikrolitrami kompletnej pożywki M199 i inkubować kulturę w 150 mikrolitrach świeżej kompletnej pożywki M199 przez kolejne 30 minut.Następnie zastąpić supernatant 150 mikrolitrami kompletnej pożywki M199 zawierającej odpowiednie suplementy eksperymentalne i zwrócić kulturę w komorze szkiełkowej do inkubatora na sześć godzin. W celu izolacji ludzkich monocytów PAN należy rozcieńczyć świeżo pobraną próbkę krwi w PBS uzupełnioną jednym milimolowym EDTA w stosunku jeden do jednego i ostrożnie nałożyć 20 ml roztworu krwi na 20 ml pożywki o gradinie gęstości w celu rozdzielenia gradientu gęstości przez odwirowanie. Zebrać warstwę płytek krwi jednojądrowej środkowej krwi obwodowej do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml PBS uzupełnionej 1 milimolowym EDTA i doprowadzić końcową objętość do 50 ml za pomocą dodatkowego PBS-EDTA Po zliczeniu wyizolować monocyty za pomocą zestawu do izolacji monocytów PAN zgodnie z instrukcją producenta.I umyj komórki trzy razy w pożywce M199 uzupełnionej 0,5% albuminą surowicy bydlęcej lub BSA, aby wyeliminować wszelkie ślady EDTA. Jakość izolacji monocytów ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia solidnego wyniku transmigracji i adhezji. Dlatego ważne jest, aby ściśle przestrzegać zaleceń producenta dotyczących izolacji.Zawiesić osad w stężeniu 6 razy 10 do 6 monocytów na ml w świeżej pożywce M199 uzupełnionej 0,5% BSA i podzielić komórki na jedną podwielokrotność 200 mikrolitrów na probówkę mikrowirówki na test rekrutacyjny. Następnie umieść komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut przed ich wstrzyknięciem do komory przepływowej. Aby przygotować układ fluidyczny do analizy, należy najpierw włożyć męskie złącze luer do jednego końca kawałka silikonowej rurki o długości 8 cm i grubości 3 mm, a drugi koniec podłączyć do wbudowanego zestawu do wstrzykiwania luer.Następnie podłącz złącze luer do jednego końca kawałka silikonowej rurki o długości 40 cm i grubości 3 mm. Następnie przyłóż strzykawkę 20 mm do jednego końca kawałka silikonowej rurki o długości 1 m i grubości 3 mm i włóż męskie złącze luer do drugiego końca. Następnie włóż oba męskie złącza luer do żeńskiego łącznika luer lock i umieść wolny koniec silikonowej rurki w zbiorniku z medium M199 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionym 0,5% BSA.Cofnąć tłok, aby napełnić rurkę buforem przepływowym i zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej. Następnie ustaw pompę w tryb wycofania i określ natężenie przepływu. Aby podłączyć komorę suwaka, clamp silikonową rurkę wokół żeńskiego łącznika luer lock i odłącz dwa męskie złącze luer od łącznika, aby umożliwić ich podłączenie do zbiornika suwaka.Pęcherzyki powietrza nie tylko pogarszają jakość obrazu, ale także wywołują w komórkach stres kapilarny, prowadząc do śmierci komórek. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, upewnij się, że rurka jest prawidłowo zaciśnięta przed włożeniem luera do zbiornika. Następnie zdejmij zaciski, aby upewnić się, że połączenie nie przecieka i umieść szkiełko pod mikroskopem.W celu zobrazowania rekrutacji monocytów pod przepływem, dodać 5 mikrolitrów sprzężonego z fluorescencją przeciwciała anty CD16 i odpowiedniego barwnika jądrowego do każdego podszytego monocytów na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej i zebrać komórki przez krótkie odwirowanie. Zawiesić osad w 250 mikrolitrach bufora przepływowego i uruchomić pompę strzykawkową. Dodaj 30 mikrolitrów jednej zawiesiny monocytów do jednej komory szkiełka i wybierz obiektyw 40X w mikroskopie konfokalnym.Aktywuj odpowiednie lasery fluorescencyjne i użyj komory z oznakowanym monocytem, aby ustawić parametry akwizycji mikroskopu konfokalnego Następnie wybierz trzy pola widzenia w promieniu pół centymetra dla wielopozycyjnego obrazowania konfokalnego i ustaw stos Z na zakres od 10 do 12 mikrometrów, a akwizycja poklatkowa ma być uruchamiana co minutę. Po trzech minutach obrazowania wstrzyknij 200 mikrolitrów monocytów przez wbudowany port do wstrzykiwania luer i rozpocznij obrazowanie interakcji komórkowej. Po upływie co najmniej 30 minut należy przerwać obrazowanie i przepływ, a następnie zacisnąć rurkę, aby umożliwić odłączenie jej od szkiełka.Aby określić szybkość transmigracji komórek przez stymulowane HUVEC, otwórz obraz J i policz całkowitą liczbę przylegających monocytów w każdym polu, aby określić liczbę komórek na milimetr kwadratowy. Następnie policz liczbę transmigrowanych monocytów, które są obecne w płaszczyźnie podstawy pod komórkami śródbłonka, zgodnie z obecnością strefy czarnej wokół jądra. Prostym sposobem sprawdzenia stanu aktywacji HUVEC po stymulacji jest wizualizacja ich wydłużenia pod wpływem stresu zapalnego.Poklatkowe obrazowanie konfokalne umożliwia wizualizację monocytów w płaszczyźnie wierzchołkowej, gdzie można ocenić ich fenotyp. Migrujące komórki poddawane transmigracji przemieszczają się do międzykomórkowego połączenia komórka-komórka, zanim znikną z płaszczyzny wierzchołkowej i pojawią się ponownie w płaszczyźnie podstawnej. Kwantyfikacja rekrutacji monocytów w czasie potwierdza, że po adhezji monocytów następuje transmigracja.Szybkość transmigracji monocytów CD16 dodatnich jest niska, gdy komórki śródbłonka są stymulowane tylko TNF alfa, ale wzrasta, gdy komórki śródbłonka są stymulowane zarówno TNF alfa, jak i czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego lub VEGFA. Stymulacja HUVEC za pomocą TNF alfa i TNF alfa plus VEGFA indukuje wzrost adhezji komórek T, B i NK CD14-ujemnych w porównaniu z monocytami CD14-dodatnimi. Ponadto stymulacja HUVEC indukuje transmigrację tylko populacji monocytów, ponieważ komórki T, B i NK nie migrują ani w warunkach stymulujących TNF alfa, ani TNF alfa plus VEGFA.Aby przeprowadzić optymalny test rekrutacji monocytów, ważne jest, aby zaplanować eksperyment z wyprzedzeniem i zrobić to tego samego dnia. A kiedy oczyszczasz komórki, upewnij się, że twój mikroskop ma 37 stopni, aby nie przenosić komórek do innej temperatury podczas eksperymentu. Aby poznać tę procedurę, można przeprowadzić wszystkie metody, takie jak profilowanie ekspresji cytokin i chemokiny HUVEC, a także badania chemotaksji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie dotyczące mechanizmu molekularnego, który podtrzymuje transmigrację i adhezję określonej populacji monocytów.

simultaneous-study-recruitment-monocyte-subpopulations-under-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test in vitro badający immunomodulacyjny wpływ mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) na proliferację efektorowych limfocytów T. Test obejmuje jednoczesną hodowlę MSCs z PBMC w celu skłonienia populacji monocytów do uzyskania fenotypu immunomodulującego, prowadzącego do wydzielania interleukiny-10 (IL-10). Po inkubacji z aktywowanymi limfocytami T CD4 + indukowane monocyty skutecznie hamują proliferację limfocytów T.

Test in vitro do oceny immunomodulacyjnego wpływu monocytów na proliferację leukocytów

Film demonstruje metodę badania wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów. W modelu komory z przepływem równoległym cytokiny prozapalne indukują ekspresję receptorów adhezyjnych przez komórki śródbłonka, ułatwiając rekrutację i migrację neutrofili. Wzajemne oddziaływanie między komórkami zrębu a komórkami śródbłonka zmniejsza rekrutację neutrofili do komórek śródbłonka.

Badanie przepływu in vitro wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów

Rekrutacja leukocytów do wątroby odbywa się w wyspecjalizowanych kanałach sinusoid wątrobowych, które są wyściełane unikalnymi komórkami śródbłonka sinusoidalnego wątroby.  Mikroskopia z kontrastem fazowym rekrutacji leukocytów przez ludzki śródbłonek sinusoidalny wątroby w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego może ułatwić wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tego procesu.

Test adhezji przepływowej do badania rekrutacji leukocytów do ludzkiego śródbłonka sinusoidalnego wątroby w warunkach naprężeń ścinających

Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi ocenić dynamikę rekrutacji leukocytów ex vivo poprzez podłączenie komory pokrytej cząsteczkami adhezyjnymi pochodzącymi ze śródbłonka do układu krążenia myszy. Metoda ta ma istotne zalety, ponieważ pozwala na ocenę leukocytów we względnych warunkach biologicznych.

Ocena interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu w autoperfuzyjnym teście komorowym ex vivo z mikroprzepływem

Zdolność śródbłonka w stanie zapalnym do rekrutacji leukocytów z przepływu jest regulowana przez mezenchymalne komórki zrębu. Opisujemy dwa modele in vitro obejmujące pierwotne komórki ludzkie, które można wykorzystać do oceny rekrutacji neutrofili na podstawie przepływu i zbadania roli, jaką mezenchymalne komórki zrębu odgrywają w regulacji tego procesu.

Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu

Monocyty są integralnymi składnikami ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego, który polega na metabolizmie glikolitycznym po aktywacji. Opisujemy protokół cytometrii przepływowej do pomiaru ekspresji transportera glukozy i wychwytu glukozy przez całkowite monocyty i subpopulacje monocytów w świeżej krwi pełnej.

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Opisujemy protokół pomiaru transmigracji monocytów przez monowarstwy ludzkiego śródbłonka i ich późniejszego dojrzewania do komórek piankowych. Zapewnia to wszechstronną metodę oceny właściwości miażdżycowych monocytów wyizolowanych od osób z różnymi stanami chorobowymi oraz oceny czynników we krwi, które mogą zwiększać tę skłonność.

Kwantyfikacja transmigracji monocytów i tworzenia komórek piankowatych u osób z przewlekłymi stanami zapalnymi

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia aktywności chemotaktycznej monocytów krwi w modelach mysich, do oceny wpływu interwencji żywieniowych, farmakologicznych i genetycznych na monocyty krwi oraz do scharakteryzowania makrofagów pochodzących z monocytów krwi w modelach mysich przy użyciu zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej monocytów-chemoattraktantu-1 (MCP-1).

Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi

Poznaj metodę badania rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala rozróżnić transmigrację i adhezję komórek.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Przeglądaj więcej filmów