Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Metoda ta może bowiem pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie zapalenia i immunologii. Na przykład, jaki jest molekularny mechanizm adhezji leukocytów i migracji przezśródbłonkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na nieograniczone zastosowanie rozróżniania między transmigracją a silnym dodawaniem monocytów do monowarstwy śródbłonka.

Chociaż metoda ta dostarcza informacji na temat rekrutacji monocytów w przepływie, można ją również dostosować do innych komórek układu krwiotwórczego, takich jak limfocyty T, limfocyty B lub pochodne ich subpopulacji. Po umyciu oznacz ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub HUVEC 30 mikrolitrami pożywki M199 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej jednym mikromolowym CMFDA przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji przemyć komórki 150 mikrolitrami kompletnej pożywki M199 i inkubować kulturę w 150 mikrolitrach świeżej kompletnej pożywki M199 przez kolejne 30 minut.

Następnie zastąpić supernatant 150 mikrolitrami kompletnej pożywki M199 zawierającej odpowiednie suplementy eksperymentalne i zwrócić kulturę w komorze szkiełkowej do inkubatora na sześć godzin. W celu izolacji ludzkich monocytów PAN należy rozcieńczyć świeżo pobraną próbkę krwi w PBS uzupełnioną jednym milimolowym EDTA w stosunku jeden do jednego i ostrożnie nałożyć 20 ml roztworu krwi na 20 ml pożywki o gradinie gęstości w celu rozdzielenia gradientu gęstości przez odwirowanie. Zebrać warstwę płytek krwi jednojądrowej środkowej krwi obwodowej do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml PBS uzupełnionej 1 milimolowym EDTA i doprowadzić końcową objętość do 50 ml za pomocą dodatkowego PBS-EDTA Po zliczeniu wyizolować monocyty za pomocą zestawu do izolacji monocytów PAN zgodnie z instrukcją producenta.

I umyj komórki trzy razy w pożywce M199 uzupełnionej 0,5% albuminą surowicy bydlęcej lub BSA, aby wyeliminować wszelkie ślady EDTA. Jakość izolacji monocytów ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia solidnego wyniku transmigracji i adhezji. Dlatego ważne jest, aby ściśle przestrzegać zaleceń producenta dotyczących izolacji.

Zawiesić osad w stężeniu 6 razy 10 do 6 monocytów na ml w świeżej pożywce M199 uzupełnionej 0,5% BSA i podzielić komórki na jedną podwielokrotność 200 mikrolitrów na probówkę mikrowirówki na test rekrutacyjny. Następnie umieść komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut przed ich wstrzyknięciem do komory przepływowej. Aby przygotować układ fluidyczny do analizy, należy najpierw włożyć męskie złącze luer do jednego końca kawałka silikonowej rurki o długości 8 cm i grubości 3 mm, a drugi koniec podłączyć do wbudowanego zestawu do wstrzykiwania luer.

Następnie podłącz złącze luer do jednego końca kawałka silikonowej rurki o długości 40 cm i grubości 3 mm. Następnie przyłóż strzykawkę 20 mm do jednego końca kawałka silikonowej rurki o długości 1 m i grubości 3 mm i włóż męskie złącze luer do drugiego końca. Następnie włóż oba męskie złącza luer do żeńskiego łącznika luer lock i umieść wolny koniec silikonowej rurki w zbiorniku z medium M199 o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionym 0,5% BSA.

Cofnąć tłok, aby napełnić rurkę buforem przepływowym i zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej. Następnie ustaw pompę w tryb wycofania i określ natężenie przepływu. Aby podłączyć komorę suwaka, clamp silikonową rurkę wokół żeńskiego łącznika luer lock i odłącz dwa męskie złącze luer od łącznika, aby umożliwić ich podłączenie do zbiornika suwaka.

Pęcherzyki powietrza nie tylko pogarszają jakość obrazu, ale także wywołują w komórkach stres kapilarny, prowadząc do śmierci komórek. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, upewnij się, że rurka jest prawidłowo zaciśnięta przed włożeniem luera do zbiornika. Następnie zdejmij zaciski, aby upewnić się, że połączenie nie przecieka i umieść szkiełko pod mikroskopem.

W celu zobrazowania rekrutacji monocytów pod przepływem, dodać 5 mikrolitrów sprzężonego z fluorescencją przeciwciała anty CD16 i odpowiedniego barwnika jądrowego do każdego podszytego monocytów na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej i zebrać komórki przez krótkie odwirowanie. Zawiesić osad w 250 mikrolitrach bufora przepływowego i uruchomić pompę strzykawkową. Dodaj 30 mikrolitrów jednej zawiesiny monocytów do jednej komory szkiełka i wybierz obiektyw 40X w mikroskopie konfokalnym.

Aktywuj odpowiednie lasery fluorescencyjne i użyj komory z oznakowanym monocytem, aby ustawić parametry akwizycji mikroskopu konfokalnego Następnie wybierz trzy pola widzenia w promieniu pół centymetra dla wielopozycyjnego obrazowania konfokalnego i ustaw stos Z na zakres od 10 do 12 mikrometrów, a akwizycja poklatkowa ma być uruchamiana co minutę. Po trzech minutach obrazowania wstrzyknij 200 mikrolitrów monocytów przez wbudowany port do wstrzykiwania luer i rozpocznij obrazowanie interakcji komórkowej. Po upływie co najmniej 30 minut należy przerwać obrazowanie i przepływ, a następnie zacisnąć rurkę, aby umożliwić odłączenie jej od szkiełka.

Aby określić szybkość transmigracji komórek przez stymulowane HUVEC, otwórz obraz J i policz całkowitą liczbę przylegających monocytów w każdym polu, aby określić liczbę komórek na milimetr kwadratowy. Następnie policz liczbę transmigrowanych monocytów, które są obecne w płaszczyźnie podstawy pod komórkami śródbłonka, zgodnie z obecnością strefy czarnej wokół jądra. Prostym sposobem sprawdzenia stanu aktywacji HUVEC po stymulacji jest wizualizacja ich wydłużenia pod wpływem stresu zapalnego.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne umożliwia wizualizację monocytów w płaszczyźnie wierzchołkowej, gdzie można ocenić ich fenotyp. Migrujące komórki poddawane transmigracji przemieszczają się do międzykomórkowego połączenia komórka-komórka, zanim znikną z płaszczyzny wierzchołkowej i pojawią się ponownie w płaszczyźnie podstawnej. Kwantyfikacja rekrutacji monocytów w czasie potwierdza, że po adhezji monocytów następuje transmigracja.

Szybkość transmigracji monocytów CD16 dodatnich jest niska, gdy komórki śródbłonka są stymulowane tylko TNF alfa, ale wzrasta, gdy komórki śródbłonka są stymulowane zarówno TNF alfa, jak i czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego lub VEGFA. Stymulacja HUVEC za pomocą TNF alfa i TNF alfa plus VEGFA indukuje wzrost adhezji komórek T, B i NK CD14-ujemnych w porównaniu z monocytami CD14-dodatnimi. Ponadto stymulacja HUVEC indukuje transmigrację tylko populacji monocytów, ponieważ komórki T, B i NK nie migrują ani w warunkach stymulujących TNF alfa, ani TNF alfa plus VEGFA.

Aby przeprowadzić optymalny test rekrutacji monocytów, ważne jest, aby zaplanować eksperyment z wyprzedzeniem i zrobić to tego samego dnia. A kiedy oczyszczasz komórki, upewnij się, że twój mikroskop ma 37 stopni, aby nie przenosić komórek do innej temperatury podczas eksperymentu. Aby poznać tę procedurę, można przeprowadzić wszystkie metody, takie jak profilowanie ekspresji cytokin i chemokiny HUVEC, a także badania chemotaksji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie dotyczące mechanizmu molekularnego, który podtrzymuje transmigrację i adhezję określonej populacji monocytów.