Budowa cyklicznych peptydów penetrujących komórki w celu zwiększenia penetracji barier biologicznych

Poważną przeszkodą w leczeniu nowotworów jest ograniczony dostęp terapii do głębszych komórek nowotworowych ze względu na bariery fizjologiczne. W związku z tym opracowanie nowych transporterów molekularnych zdolnych do leczenia barier biologicznych jest bardzo pożądane w celu zwiększenia wydajności dostarczania leków. Celem tej procedury jest synteza cyklicznych peptydów penetrujących komórki w celu zwiększenia penetracji między komórkami.

Zaletą tej metody jest to, że cyklizację peptydów można łatwo osiągnąć poprzez reakcje substytucji cysteinami i żywicą bez konieczności stosowania katalizatorów metalowych. Włączenie aromatycznych wiązań poprzecznych poprawia ogólną hydrofobowość peptydów w porównaniu z hydrofilowymi wiązaniami laktamowymi lub triazolowymi, zwiększając w ten sposób ich przepuszczalność. Aby rozpocząć, zmontuj ręczny aparat do syntezy peptydów w dygestorium.

Umieść trójdrogowe zawory odcinające na kolektorze próżniowym i podłącz je do azotu. Upewnij się, że zakryłeś nieużywane wloty. Przymocować 10-mililitrową kolumnę polipropylenową do trójdrogowych kurków i spuścić mieszaninę reakcyjną lub rozpuszczalniki z kolumny polipropylenowej za pomocą gumowej bańki do pipet lub odkurzacza przez syfon na odpady.

Aby przygotować żywicę do syntezy peptydów, dodaj 4 do 5 mililitrów DMF do wymaganej ilości żywicy i przenieś ją do kolumny polipropylenowej z delikatnym bulgotaniem azotu przez 30 minut, aby odpowiednio spęczniać żywicę. Odcedź DMF i dodaj 4 do 5 mililitrów 50% morfoliny/DMF do żywicy. Delikatnie bąbelkować azotem przez 30 minut, aby usunąć N-końcową grupę Fmoc, a następnie odcedzić mieszaninę.

Dokładnie umyj żywicę trzy razy, dodając 4 do 5 mililitrów DMF do kolumny i bulgocząc azotem przez co najmniej 1 minutę za każdym razem. W ten sam sposób trzykrotnie umyj żywicę dichlorometanem i trzykrotnie DMF. Następnie rozpuść 648,8 miligramów argininy chronionej przez Fmoc i PBF oraz 372,6 miligramów HATU w 5 mililitrach DMF w probówce wirówkowej.

Dodać 348,4 mikrolitrów DIPEA, aby aktywować reakcję sprzęgania i przenieść mieszaninę reakcyjną do kolumny polipropylenowej z żywicą. Delikatnie mieszaj mieszaninę z bulgotaniem azotu przez 1 do 2 godzin, a następnie powtórz jednokrotnie reakcję sprzęgania. Odcedzić mieszaninę reakcyjną i przemyć żywicę kolejno DMF, dichlorometanem i ponownie DMF trzy razy przez co najmniej 1 minutę za każdym razem.

Usuń grupę ochronną Fmoc i umyj żywicę zgodnie z procedurą pokazaną wcześniej przed przystąpieniem do łączenia następnego aminokwasu. Następnie połącz beta-alaninę jako przekładkę do znakowania FITC, używając tego samego procesu, który pokazano dla sprzężenia aminokwasów, a następnie dodaj mieszaninę FITC, DIPEA i DMF do kolumny polipropylenowej w ciemności, aby wykonać znakowanie FITC peptydów na żywicy. Reakcja trwała prawie 8 godzin.

Aby przeprowadzić cyklizację peptydu liniowego, dodaj mieszaninę kwasu trifluorooctowego, triizopropylosilanu i dichlorometanu do kolumny polipropylenowej na 2 minuty, aby selektywnie usunąć grupę cysteiny chroniącą trytyl. Odcedź mieszaninę i powtarzaj procedurę, aż żółtawy roztwór stanie się bezbarwny, aby całkowicie usunąć grupę chroniącą przed trytylem. Przeprowadzić sekwencyjne płukanie żywicy DMF i dichlorometanem co najmniej trzy razy i rozpuścić 4,4'bis-bromometylo-bifenyl w DMF za pomocą DIPEA.

Dodaj roztwór do kolumny i reaguj przez 4 godziny. Umyj żywicę 4 do 5 mililitrami metanolu dwa razy przez pięć minut każdy i wysusz ją ciągłym przepływem azotu. W przypadku peptydów zawierających cysteiny należy potraktować żywicę skutecznym koktajlem rozszczepienia z kwasu trifluorooctowego, triizopropylosililanu i wody lub kwasu trifluorooctowego, triizopropylosilanu, 1, 2-etanodiolu i wody.

Traktuj żywicę związaną z peptydami przez 2 do 3 godzin, aby rozszczepić peptyd, a następnie ostrożnie usuń kwas trifluorooctowy strumieniem azotu. Aby otrzymać surowe peptydy, dodać 4 do 5 mililitrów eteru dietylowego do rozszczepionego preparatu peptydowego w celu wytrącenia surowych peptydów i odwirować przy 10 000 x g przez 4 minuty. Ostrożnie wyrzuć supernatant i susz peptyd na powietrzu przez 3 minuty w skutecznym dygestorium.

Rozpuść surowy peptyd na małą skalę w 800 mikrolitrach acetonitrylu, a następnie przeanalizuj go za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Zaszczepić 100 000 komórek HeLa w 2 mililitrach DMEM w 12-dołkowej komorze z wkładką do hodowli tkankowej i inkubować przez 24 godziny w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza zawierającym 5% dwutlenku węgla. Usuń pożywkę i inkubuj komórki w komorach z 1 mililitrem 10 mikromolowych FITC-R8 lub FITC-sR8-4 w DMEM wolnym od FBS przez 1 godzinę.

Następnie usuń pożywkę zawierającą peptydy i umyj komórki trzykrotnie 1 mililitrem PBS. Dodaj 1 mililitr świeżego DMEM wolnego od FBS do komór, a następnie współinkubuj komórki HeLa w komorze z wkładką do kultury tkankowej, z komórkami HeLa na okrągłych szkiełkach nakrywkowych na dnie przez 2 godziny. Utrwal komórki HeLa na okrągłych szkiełkach nakrywkowych za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego przez 15 minut, a następnie barwić komórki DAPI przez 15 minut.

Na koniec obserwuj komórki HeLa na szkiełkach nakrywkowych pod mikroskopem fluorescencyjnym. Przedstawiono tutaj schemat ideowy syntezy liniowego peptydu R8 znakowanego FITC i zszywanego peptydu R8 znakowanego FITC. Widma HPLC i MS liniowego peptydu R8 i zszywanego peptydu R8 pokazano na tym rysunku.

Czas retencji zszywanego peptydu był znacznie dłuższy niż w przypadku analogu liniowego, co wskazuje na zwiększoną ogólną hydrofobowość peptydu po cyklizacji z hydrofobowym wiązaniem krzyżowym. Ten obraz graficzny przedstawia stabilność peptydu liniowego i peptydu zszywanego w obecności 25% FBS. Cykliczny R8 pozostaje w 77,3% nienaruszony po inkubacji z FBS przez 4 godziny, podczas gdy jego liniowy odpowiednik został w większości zdegradowany, co sugeruje zwiększoną stabilność proteolityczną cyklicznego peptydu R8.

Przedstawiono tutaj obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek komórek HeLa i komórek 4T1 po 1 godzinie inkubacji z 3 mikromolowymi liniowymi peptydami R8 znakowanymi FITC i znakowanym FITC zszywanym peptydem R8. Można zauważyć, że komórki potraktowane cyklicznym R8 z wiązaniem aromatycznym wykazywały wyższą fluorescencję wewnątrzkomórkową niż te potraktowane ich liniowym odpowiednikiem. Podobne wyniki uzyskano przy analizie metodą cytometrii przepływowej.

Aby dokładniej zbadać, czy cykliczny R8 zapewnia zwiększoną penetrację między komórkami, wykorzystano modele transwell do symulacji przepuszczalności bariery peptydów z jednej warstwy komórkowej do drugiej. Cykliczny R8 wyraźnie wykazywał wyższą penetrację bariery trans-barierowej niż liniowy peptyd R8, na co wskazuje znaczny wzrost fluorescencji wewnątrzkomórkowej. Całkowita deprotekcja grupy trytylowej cysteiny i żywicy jest ważna dla następnego etapu cyklizacji.

Poza tym wydajność cyklizacji zależy również od określonych sekwencji i długości peptydów ze względu na efekty steryczne. W takim przypadku pomocne byłoby użycie żywicy o mniejszej nośności lub cyklizacji peptydów w rozcieńczonych stężeniach w fazie roztworu. Te cykliczne peptydy wykazały zwiększoną przepuszczalność między komórkami w porównaniu z ich liniowymi odpowiednikami.

Wierzymy, że są one bardzo obiecujące w pokonywaniu barier biologicznych i zostaną wykorzystane jako cząsteczka do dalszych zastosowań w dziedzinie dostarczania leków.