Name: Konstruowanie cyklicznych peptydów przy użyciu centrum sulfonowego na uwięzi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj metodę syntezy cyklicznych peptydów wykorzystującą centrum sulfonowe na uwięzi. Technika opiera się na bisalkilacji cysteiny i metioniny oraz reakcji tiol-yn bez katalizatora Met.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wsparcie finansowe ze strony Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2021YFC2103900); granty Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (21778009 i 21977010); Fundacja Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (2022A1515010996 i 2020A1515010521): Komitet Innowacji Naukowych i Technologicznych Shenzhen (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 i JCYJ20200109140406047); oraz Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Grant dla instytucji badawczych (2019SHIBS0004). Autorzy dziękują za wsparcie czasopisma Chemical Science, The Royal Society of Chemistry (numer 30) oraz The Journal of Organic Chemistry (American Chemical Society) (numer 31).

1. Przygotowanie sprzętu
UWAGA: Morfolina, N,N-dimetyloformamid (DMF), dichlorometan (DCM), N,N-diizopropyloetyloamina (DIPEA), TFA, morfolina, piperydyna, eter dietylowy i metanol są toksyczne, lotne i. Odczynniki te mogą szkodzić ludzkiemu organizmowi poprzez wdychanie, spożycie lub kontakt ze skórą. Do wszystkich eksperymentów chemicznych należy używać sprzętu ochronnego, w tym rękawiczek jednorazowych, fartuchów eksperymentalnych i okularów ochronnych.
<ol>
	<li>Zbuduj wszystkie substraty peptydowe na żywicy 4-metylobenzhydryloaminy (MBHA) z rinkowidu za pomocą standardowej ręcznej syntezy peptydów w fazie stałej opartej na Fmoc (SPPS)29, jak pokazano w Rysunek 1.</li>
	<li>Użyj jednej z dwóch opcji do konstruowania peptydów liniowych: po pierwsze, zsyntetyzuj peptyd przy użyciu czynnika kondensującego 2-(7-azabenzotriazol-1-ylo)-N,N, N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) i odczynnika DIPEA; lub dwóch, zsyntetyzuj z wykorzystaniem 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT) i N,N'-diizopropylokarbodimidu (DIC) jako odczynnika do kondensacji amidu. Wybierz odpowiedni protokół syntezy peptydów zgodnie z sekwencją peptydu.</li>
	<li>Aby stworzyć ręczne urządzenie do syntezy peptydów, należy ustawić zmodyfikowane urządzenie do próżniowej ekstrakcji fazy stałej w dygestoriach i podłączyć je do trójdrogowego zaworu odcinającego. Następnie umieść polipropylenowy wkład filtracyjny lub szklany reaktor na urządzeniu, gdy jest podłączony do azotu (N2) gazu. 
	UWAGA: W celu modyfikacji sprzętu do ekstrakcji próżniowej do fazy stałej należy wyjąć rurkę ekstrakcyjną i pozostawić system zamknięty próżniowo.</li>
	<li>Załaduj żywicę MBHA do kolumn wypełnionych żywicą i rozpuść ją w DMF. Wyreguluj przełącznik trójdrogowych zaworów odcinających na bulgotanie N2, a następnie usuń rozpuszczalnik z kolumny za pomocą działającej pompy podłączonej do systemu próżniowego. Obliczyć wymaganą ilość aminokwasu lub środka kondensacyjnego, korzystając z następującego wzoru: 
	Aminokwas (g) i czynnik kondensujący (g) = skala żywicy (g) × pojemność żywicy (mM/g) × równoważnik (5 eq) × masa cząsteczkowa (g/M) 
	UWAGA: Wybierz ilość załadowanej żywicy w zależności od długości peptydu sprzęgającego. Do pełniejszej reakcji stosuje się wiele odpowiedników (eq) aminokwasów. Ciekłe rozpuszczalniki muszą zostać przekształcone w objętość według gęstości. Korektor 5 pokazuje, że ilość wejściowa obliczonego związku jest wzmacniana pięciokrotnie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie żywicy
UWAGA: Wybierz ilość załadowanej żywicy zgodnie z długością peptydu sprzęgającego.
<ol>
	<li>Odważyć 302 mg żywicy rinkamidowej MBHA (załadowanej 0,331 mM/g) do kolumny (zbiornik o pojemności 20 ml). Dodaj 5-10 ml DCM lub DMF do kolumny, aby spęcznić żywicę podN2, bulgocząc przez 30 minut.</li>
	<li>Następnie zamknij przełącznik N2, a następnie włącz przełącznik ssania pompy próżniowej, aby usunąć rozpuszczalnik. Następnie przemyj żywice sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.</li>
</ol>
3. Blokada Fmoc na N-terminalu
UWAGA: Deprotekcja przez morfolinę trwa 30 minut, a deprotekcja przez piperydynę trwa 5 minut.
<ol>
	<li>Przygotować N-końcowy roztwór deprotekcyjny 9-fluorenylometylokoksykarbonylu (Fmoc): przygotować wystarczającą ilość (500 ml) 20% (v/v) piperydyny lub 50% (v/v) morfoliny w DMF w szklanym pojemniku do deprotekcji grupy Fmoc.</li>
	<li>Dodać 10 ml roztworu odwadniającego do kolumny, wprowadzić bąbelki N2 do roztworu na 30 minut lub 5 minut 2x i powtórzyć procedury deprotekcji 2x.</li>
	<li>Odcedź roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyj żywicę sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Wykryj żywicę jako ciemnożółty roztwór o barwie za pomocą 5% ninhydryny (test Kaisera) po każdym odbezpieczaniu, aby potwierdzić brak grupy Fmoc przed etapem sprzęgania. Szczegółowo dodaj 1 ml DMF do niewielkiej ilości żywicy i dodaj 200 μl 5% ninhydryny do szklanej probówki podgrzewanej w temperaturze 130 °C przez 3 minuty, aby ocenić zmiany koloru żywicy.</li>
	<li>Odcedź roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyj żywicę sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.</li>
</ol>
4. Sprzężenie peptydu liniowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
UWAGA: Gdy sekwencje syntetycznych peptydów zawierają dwie lub więcej powtarzających się jednostek, procedurę łączenia można przeprowadzić bezpośrednio, wybierając typ aminokwasu, taki jak Fmoc-AA-OH lub Fmoc-AAA-OH, i tak dalej. Niektóre specjalne aminokwasy z przeszkodą steryczną i peptydy o dłuższych sekwencjach aminokwasowych są wymagane do prawidłowego wydłużenia czasu reakcji na sprzężenie.
<ol>
	<li>Dla pojedynczego etapu sprzęgania, weźmy jako przykład sprzężenie reszty Cys (zsyntetyzuj skale żywicy 300 mg). Przygotować roztwór mieszaniny zawierający Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) i HATU (5 eq, 206 mg) lub Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) i HOBT (5 eq, 106 mg) w probówce polipropylenowej i rozpuścić go w 3 ml DMF.</li>
	<li>Dodać 173 μl DIPEA (10 eq) lub 154 μl DIC (10 eq) do roztworu Cys, aby aktywować aminokwas. Pozwól mieszaninie wstępnie aktywować się przez 1 minutę. Dodaj mieszaninę do kolumny z żywicą i bąbelkuj ją z N2 przez 2 godziny 
	UWAGA: Konkretny wymagany czas reakcji powinien być ustandaryzowany, aby wykryć 5% ninhydryny.</li>
	<li>Po sprzężeniu dodaj 1 ml DMF do niewielkiej ilości żywicy i dodaj 200 μl 5% ninhydryny do szklanej rurki podgrzewanej w temperaturze 130 °C przez 3 minuty. Obserwuj, jak żywica zmienia się na bezbarwną, aby potwierdzić brak wolnej grupy aminowej przed etapem deprotekcji.</li>
	<li>Odcedź roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyj żywicę sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Dodać 10 ml roztworu deprotektora do kolumny, bańkować N2 przez 30 minut lub 5 minut 2x, dodać świeży roztwór i powtórzyć procedury deprotekcji 2x.</li>
	<li>Powtórz następujące kroki: deprotekcja grupy Fmoc; wykrywanie deprotekcji żywicy; mycie żywicy; sprzęganie aminokwasu; wykrywanie reakcji sprzęgania. Powtarzaj krok sprzęgania, aż wszystkie peptydy zostaną zsyntetyzowane. 
	UWAGA: Użyj testu Kaisera, aby monitorować, czy każdy etap deprotekcji jest zakończony lub czy każdy etap sprzężenia aminokwasów jest dokładny. Alternatywnie, niewielka ilość peptydu może zostać odcięta od żywicy i sprawdzona przez LC-MS pod kątem pomyślnego sprzężenia.</li>
</ol>
5. Bissalkilacja między Met i Cys (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Skonstruuj peptyd liniowy z Met i Cys, powtarzając kroki 4.1-4.6. Dodać 10 ml bezwodnego metanolu do kolumny z żywicą w celu odwodnienia i wysuszyć za pomocą N2 do następnego użycia (powtórzyć 2x) po liniowym sprzężeniu peptydów.</li>
	<li>Odważyć 100 mg żywicy otrzymanej w poprzednim etapie do kolumny (zbiornik o pojemności 20 ml) i przepłukać żywicę DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) przed etapem łączenia.</li>
	<li>Przygotować roztwór do usunięcia grupy ochronnej Cys trt(trytyl). Przygotować wystarczającą objętość (100 ml) mieszaniny TFA/TIS/DCM (3:5:92) w szklanym pojemniku w celu usunięcia grupy ochronnej.</li>
	<li>Dodać 5-10 ml roztworu TFA/TIS/DCM (3:5:92) do kolumny, aby usunąć grupę ochronną na 10 minut. Powtórz sześć razy z bulgotaniem N2, aż żółty kolor całkowicie zniknie.</li>
	<li>Odcedź roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyj żywicę sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do reakcji z odchronionym Cysem. Przygotować wystarczającą objętość (50 ml) roztworu mieszaniny (DMF) zawierającego di-halogenowany łącznik (2 eq) i DIPEA (4 eq) do reakcji z odchronionym Cys.</li>
	<li>Dodać 5-10 ml roztworu reakcyjnego do kolumny, aby reagować z odchronionym Cys przez co najmniej 3 godziny z bulgotaniem N2. Odwodnić bezwodnym metanolem i wysuszyćN2 do następnego użycia.</li>
	<li>Odcedź roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyj żywicę sekwencyjnie za pomocą DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Przygotować roztwór do cyklizacji peptydów: przygotować wystarczającą objętość (20 ml) mieszaniny TUTW (TFA:TF:H 2O = 95:2,5:2,5) w szklanym pojemniku w dygestorium do cyklizacji peptydów.</li>
	<li>Dodaj 5-10 ml roztworu mieszaniny TFA do probówki polipropylenowej i rozłup żywicę pod koktajlem TFA przez 3 godziny 
	UWAGA: TFA jest silnie i drażniący; Proces rozszczepiania peptydów powinien odbywać się w dygestorium.</li>
	<li>Wykonać kroki 7.1-7.5 w celu otrzymania liniowego roztworu peptydu przez oczyszczanie w fazie odwróconej fazy ciekłej (HPLC). Liofilizuj roztwór do następnego użycia.</li>
</ol>
6. Cyklizacja soli propargylosulfoniowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 4)
<ol>
	<li>Skonstruuj peptyd liniowy z Met i Cys, powtarzając kroki 4.1-4.6. Dodać 10 ml bezwodnego metanolu do kolumny z żywicą do odwodnienia i wysuszyć za pomocą N2 do następnego użycia (powtórzyć dwukrotnie) po liniowym sprzężeniu peptydów.</li>
	<li>Odważyć 100 mg żywicy otrzymanej w poprzednim etapie do kolumny (zbiornik o pojemności 20 ml) i przepłukać żywicę DCM (5-10 ml) i DMF (5-10 ml) przed etapem łączenia.</li>
	<li>Wykonać kroki 7.1-7.5 w celu uzyskania liniowego roztworu peptydu metodą HPLC i liofilizować próbkę, jak wspomniano, do następnego użycia.</li>
	<li>Przygotować 1% roztwór wodny HCOOH (objętościowo) i 1,0 mM bromku propargylu (5 eq) i dodać do roztworu peptydu Met (0,2 mM, 1 eq; 0,2 ml MeCN/H2O [1:1, v/v]).</li>
	<li>Następnie wstrząsać reakcją sprzęgania Met i bromku propargylu w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.</li>
	<li>Po reakcji rozpuścić produkt w probówce polipropylenowej w acetonitrylu i przefiltrować przez membranę filtracyjną 0,22 μm. Następnie należy natychmiast oczyścić roztwór za pomocą HPLC z odwróconymi fazami i wyliofilizować go na proszek do następnego użycia.</li>
	<li>W ostatnim etapie dodać peptyd z bromkiem propargylu do probówki polipropylenowej, utrzymać pH roztworu reakcyjnego na poziomie 8,0 przez dodanie roztworu (NH4)2CO3 i wstrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Na tym etapie uzyskuje się cykliczny peptyd soli propargylosulfoniowej.</li>
	<li>Zebrać ostatnią mieszaninę reakcyjną: rozpuścić ją w probówce polipropylenowej w acetonitrylu i przefiltrować przez membranę filtracyjną 0,22 μm. Następnie należy natychmiast oczyścić roztwór za pomocą HPLC z odwróconymi fazami i wyliofilizować go na proszek do następnego użycia.</li>
</ol>
7. Oczyszczanie cyklicznych peptydów
<ol>
	<li>Skonstruuj liniowe substraty peptydowe na żywicy Rink-amide MBHA, powtarzając kroki 4.1-4.6. Dodać 10 ml bezwodnego metanolu do kolumny z żywicą w celu odwodnienia i wysuszyć za pomocą N2 do następnego użycia (powtórzyć dwukrotnie) po liniowym sprzężeniu peptydów.</li>
	<li>Przygotować odpowiednią ilość koktajlu rozszczepiającego (TFA/H2O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) w dygestorium. Dodaj 1-5 ml roztworu mieszaniny TFA do probówki polipropylenowej i rozłupuj żywicę pod koktajlem TFA przez 3 godziny.</li>
	<li>Następnie kolejno wysusz żywicę pod parąN2 w kolumnie. Alternatywnie użyj urządzenia filtrującego, aby przefiltrować żywicę i zebrać roztwór peptydu. Następnie dodać 20 ml eteru do roztworu peptydu w celu wytrącenia peptydu, odwirować przy 3,500 x g przez 5 minut i powtórzyć dwukrotnie. Zebrać surowy osad peptydowy i wysuszyć go pod strumieniem N2 do następnego kroku.</li>
	<li>Rozpuścić 200 mg surowego peptydu w probówce polipropylenowej w 4 ml roztworu acetonitrylu i przefiltrować przez filtr 0,22 μm. Przenieść peptyd do wkładki do fiolki HPLC. Umieścić wkładkę w podajniku próbek półpreparatywnego systemu HPLC z odwróconymi fazami, wyposażonego w kolumnę C18 5 μm, 4,6 mm x 250 mm i pętlę iniekcyjną o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Oczyść i wyizoluj peptyd za pomocą programu gradientu 5% -95% acetonitrylu w wodzie z 0,1% TFA przez 30 minut, monitorując widma HPLC za pomocą UV przy 254 nm. Potwierdź masę cząsteczkową peptydu za pomocą LC-MS, zbierz roztwór peptydu i liofilizuj go na proszek do następnego użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions%3A+Progressing+toward+the+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality.</a> Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).</li>
<li>Shi, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+stapling+of+unprotected+peptides+via+chemoselective+methionine+bis-alkylation%2Fdealkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation.</a> Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).</li>
<li>Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+peptide+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in peptide drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).</li>
<li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li>
<li>Victoria, G. G., Reddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+synthesis+of+organic+chloramines+and+their+insights+into+health+care%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care.</a> New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).</li>
<li>Kim, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+and+stereoselective+reduction+of+hapten+side+chains+in+the+antibody+combining+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site.</a> Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).</li>
<li>Waddington, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organometallic+strategy+for+cysteine+borylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An organometallic strategy for cysteine borylation.</a> Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).</li>
<li>Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+all-hydrocarbon+stapling+technique+in+the+design+of+membrane-active+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).</li>
<li>Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+stapling+of+native+peptides+at+lysine+and+tyrosine+or+arginine+with+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde.</a> Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).</li>
<li>Blaum, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+and+arginine+side+chains+in+glycosaminoglycan-protein+complexes+investigated+by+NMR%2C+cross-Linking%2C+and+mass+spectrometry%3A+a+case+study+of+the+factor+h-heparin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).</li>
<li>Petitdemange, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+tuning+of+elastin-like+polypeptide+properties+via+methionine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation.</a> Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).</li>
<li>Kadlcik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+modification+of+a+methionine+residue+in+the+amyloid-beta+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259(2006).</li>
<li>Reguera, L., Rivera, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicomponent+reaction+toolbox+for+peptide+macrocyclization+and+stapling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling.</a> Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).</li>
<li>Reddy, C. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+of+3-%281-chloropiperidin-4-yl%29-6-fluoro+benzisoxazole+2+against+white+spot+syndrome+virus+in+freshwater+crab%2C+Paratelphusa+hydrodomous%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous.</a> Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).</li>
<li>Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+tuning+of+fluorobenzene+probes+for+cysteine-selective+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).</li>
<li>Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+N-terminal+modification+of+peptides+and+proteins%3A+recent+progresses+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications.</a> Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ-reactive+peptide+activates+ephrin-B+reverse+signaling+and+inhibits+neuronal+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).</li>
<li>Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+covalent+targeting+of+anti-apoptotic+BFL-1+by+cysteine-reactive+stapled+peptide+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors.</a> Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).</li>
<li>Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+technologies+for+the+synthesis+of+cyclic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides.</a> Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).</li>
<li>Zhang, H. Y., Chen, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+peptide+drugs+approved+in+the+last+two+decades+%282001-2021%29%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021).</a> RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).</li>
<li>Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+stabilization+and+multimerization+of+a+peptide+alpha-helix+by+stapling+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization.</a> Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).</li>
<li>Karthikeyan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-viral+activity+of+methyl+1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo%5Bd%5D+imidazole-5-carboxylate+against+white+spot+syndrome+virus+in+freshwater+crab+%28Paratelphusa+hydrodromous%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+International%22%5BJournal%5D)">Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous).</a> Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+aspartic+acids+as+helix-nucleating+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).</li>
<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-tether+chiral+center+modulates+the+helicity%2C+cell+permeability%2C+and+target+binding+affinity+of+a+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).</li>
<li>Hu, K., Sun, C., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+versatile+on-tether+modification+of+chiral-center-induced+helical+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).</li>
<li>Kramer, J. R., Deming, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+chemoselective+tagging+and+functionalization+of+methionine+containing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides.</a> Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).</li>
<li>Shi, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+stapling+of+unprotected+peptides+via+chemoselective+methionine+bisalkylation%2Fdealkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation.</a> Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).</li>
<li>Merrifield, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+synthesis.+Nobel+lecture%2C+8+December+1984%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984.</a> Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).</li>
<li>Wang, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sulfonium+tethered+peptide+ligand+rapidly+and+selectively+modifies+protein+cysteine+in+vicinity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity.</a> Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).</li>
<li>Hou, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sulfonium+triggered+thiol-yne+reaction+for+cysteine+modification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification.</a> The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).</li>
<li>Reguera, L., Rivera, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicomponent+reaction+toolbox+for+peptide+macrocyclization+and+stapling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling.</a> Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podejście syntetyczne opisane w tym artykule zapewnia metodę syntezy peptydów cyklicznych przy użyciu Cys i Met w sekwencji peptydowej, w której podstawowe peptydy liniowe są konstruowane za pomocą powszechnych technik syntezy peptydów w fazie stałej. W przypadku bissalkilacji cyklicznych peptydów między Cys i Met, całą drogę syntezy można podzielić na trzy główne procesy: deprotekcję Cys na żywicy, sprzężenie łącznika i cyklizację między Cys i Met w roztworze rozszczepienia kwasu trifluorooctowego. Warto zauważyć, że us...

Interakcje białko-białko (PPIs)1 odgrywają kluczową rolę w badaniach i rozwoju leków. Konstruowanie stabilizowanych peptydów o ustalonej konformacji za pomocą środków chemicznych jest jedną z najważniejszych metod opracowywania motywów mimetycznych IPs2. Do tej pory opracowano kilka cyklicznych peptydów, które są ukierunkowane na IPP3. Większość peptydów jest ograniczona do konformacji α-helisy, aby zmniejszyć entropię konformacyjną i poprawić stabilność metaboliczną, powinowactwo do wiązania celu i przepuszczalność komórek4,5. W ciągu ostatnich 2 dekad łańcuchy boczne Cys6,7, lysine8,9, tryptofan10, arginine11 i Met12,13 zostały wprowadzone do nienaturalnych aminokwasów, aby utrwalić peptyd w cyklicznej konformacji. Takie cykliczne peptydy mogą celować w unikalną przestrzeń chemiczną lub specjalne miejsca, wywołując w ten sposób reakcję kowalencyjną w celu utworzenia kowalencyjnego wiązania białko-peptyd 14,15,16,17. W niedawnym raporcie Yu i wsp., chloroacetamid został zakotwiczony w domenie ligandów peptydowych, zapewniając kowalencyjną reakcję koniugacji o doskonałej specyficzności białkowej18. Co więcej, elektrofilowe głowice bojowe, takie jak akryloamid i fluorek arylu sulfonylu (ArSO2F), zostały następnie włączone do peptydów przez Walensky'ego i wsp.19 w celu utworzenia stabilizowanych peptydowych inhibitorów kowalencyjnych i poprawy działania przeciwnowotworowego inhibitorów peptydów. Dlatego bardzo ważne jest wprowadzenie dodatkowej grupy funkcyjnej w celu kowalencyjnej modyfikacji ligandów białkowo-peptydowych20. Grupy te nie tylko reagują z białkami w łańcuchu bocznym, ale także stabilizują drugorzędową strukturę peptydu21. Jednak zastosowanie kowalencyjnie modyfikowanych białek indukowanych przez ligandy peptydowe jest ograniczone ze względu na skomplikowaną drogę syntezy i niespecyficzne wiązanie grup chemicznych22,23. Dlatego pilnie potrzebne są skuteczne strategie syntezy cyklicznych peptydów.
Zainspirowany różnorodnymi strategiami cyklicznych peptydów2,24,25,26, ten protokół próbuje opracować prostą i skuteczną metodę stabilizacji peptydów. Ponadto zauważyliśmy, że grupa łańcucha bocznego stabilnego peptydu może reagować kowalencyjnie z białkiem docelowym, gdy znajduje się przestrzennie blisko ligandów peptydowych. Brak chemicznie modyfikowanego Met został uzupełniony przez grupę Deminga w 2013 roku, poprzez opracowanie nowatorskiej metody wytwarzania selektywnie modyfikowanego peptydu metioniny27. Opierając się na tym tle, Shi i in. skupili się na rozwoju zamykania pierścieni łańcuchów bocznych w celu utworzenia centrum soli sulfonowej. Kiedy ligand peptydowy łączy się z białkiem docelowym, grupa soli sulfonium reaguje kowalencyjnie z przestrzennie bliskim białkiem Cys. W ostatnich latach Shi i in. zaprojektowali nową metodę stabilizacji cyklicznego peptydu28. Sól sulfoniowa na cyklicznym peptydzie została zredukowana przez środek redukujący z grupą sulfhydrylową, która została odwracalnie zredukowana do Met. Reakcja miała jednak niską skuteczność, co było szkodliwe dla późniejszych biologicznych badań aplikacyjnych. W obecnym badaniu zaprojektowano reakcję zamykania pierścienia Met-Cys i bromku propargylu-Cys, w której pojedyncza sól sulfonium pozostaje w łańcuchu bocznym cyklicznego peptydu. Sól sulfonowa działała jak nowa głowica bojowa, która reagowała kowalencyjnie z białkiem Cys w pobliżu przestrzennym. Krótko mówiąc, zmutowany peptyd Cys i Met został poddany cyklizacji przez wewnątrzcząsteczkową alkilację, w wyniku czego powstało centrum sulfonium na uwięzi. W tym procesie utworzenie bocznego mostka łańcuchowego miało kluczowe znaczenie dla cyklicznych peptydów. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten opisuje szczegółową cyklizację peptydów na bazie sulfonium, którą osiąga się przy użyciu prostych warunków i operacji reakcji. Celem jest opracowanie potencjalnej metody do dalszych szerokich zastosowań biologicznych.

<table><tbody><tr><td>1,3-bis(bromometylo)-benzen</td><td>Energy</td><td>D0215</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 1,3-dimetylobarbiturowy</td><td>Energy</td><td>A46873</td><td></td></tr><tr><td>1H NMR i HSQC</td><td>Bruker</td><td>&nbsp; AVANCE-III 400</td><td></td></tr><tr><td>1-hydroksybenzotriazol hydrat</td><td>Energy</td><td>E020543</td><td></td></tr><tr><td>2-(7-azabenzotriazol-1-ylo)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td><td>Energy</td><td>A1797</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptopyrydyna</td><td>Energy</td><td>Y31130</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 6-aminokapronowy</td><td>Energy</td><td>A010678</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik</td> <td>octowyEnergia</td><td>A01021454</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>Węglan amonu</td><td>Energia</td><td>12980</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan (DCM)</td><td>Energia</td><td>W330229</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowe ogrzewanie Chłodzenie Sucha kąpiel</td><td>&nbsp; Thermo Scientific</td><td>88880029</td><td></td></tr><tr><td>Diizopropyloetyloamina (DIPEA)</td><td>Energia</td><td>W320014</td><td></td></tr><tr><td>Dimetyloformamid (DMF)</td><td>Energia</td><td>B020051</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Energy</td><td>A10027</td><td></td></tr><tr><td>Masa jonizacyjna do elektrorozpylania</td><td>SHIMADZU2020</td><td>&nbsp; LC-MS2020</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R30101</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R30201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R30501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln(Trt)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu(OtBu)-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R30701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Boc)-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R30902</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31001</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31301</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>Peptyd Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser(tBu)-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Trp(Boc)-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31801</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(tBu)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31901</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Peptide Nanjing Biotech Ltd</td><td>R32001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Energia</td><td>W810042</td><td></td></tr><tr><td>Wysokowydajna chromatografia cieczowa </td><td>SHIMADZU</td><td>LC-2030</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik N,N'-Diizopropylokarbodimidu</td><td>Energy</td><td>B010023</td><td></td></tr><tr><td>Ninhydryna</td><td>Energy</td><td>N7285</td><td></td></tr><tr><td>Bromek propargylu</td><td>Energy</td><td>W320293</td><td></td></tr><tr><td>Żywica MBHA Rink Amide</td><td>Nanjing Peptide Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki do ekstrakcji próbek do ekstrakcji do fazy stałej (SPE)</td><td>&nbsp; Thermo Scientific</td><td>60300-403</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(trifenylofosfina) pallad</td><td>Energy</td><td>T1350</td><td></td></tr><tr><td>Zawory trójdrogowe</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Trietyloamina</td><td>Energy</td><td>B010737</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>J& K</td><td>101398</td><td></td></tr><tr><td>Triizopropylosilan (TIS)</td><td>Energia</td><td>T1533</td><td></td></tr></tbody></table>

konstruowanie cyklicznych peptydów przy użyciu centrum sulfonowego na uwięzi

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

W ostatnich latach, cykliczne peptydy przyciągają coraz większą uwagę w dziedzinie odkrywania leków ze względu na ich doskonałe działanie biologiczne, a w konsekwencji są obecnie stosowane klinicznie. Dlatego tak ważne jest poszukiwanie skutecznych strategii syntezy cyklicznych peptydów, aby promować ich zastosowanie w dziedzinie odkrywania leków. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół efektywnej syntezy cyklicznych peptydów przy użyciu bisalkilacji na żywicy lub wewnątrzcząsteczkowej (międzycząsteczkowej). Korzystając z tego protokołu, zsyntetyzowano peptydy liniowe, wykorzystując syntezę peptydów w fazie stałej z cysteiną (Cys) i metioniną (Met) sprzężonymi jednocześnie na żywicy. Co więcej, cykliczne peptydy zsyntetyzowano poprzez bisalkilację między Met i Cys przy użyciu przestrajalnego tethera i centrum sulfonium on-tether. Całą drogę syntezy można podzielić na trzy główne procesy: deprotekcję Cys na żywicy, sprzężenie łącznika oraz cyklizację między Cys i Met w roztworze rozszczepienia kwasu trifluorooctowego (TFA). Ponadto, zainspirowana reaktywnością centrum sulfonium, grupa propargylowa została przyłączona do Met, aby wywołać addycję tiol-yny i utworzyć cykliczny peptyd. Następnie surowe peptydy wysuszono i rozpuszczono w acetonitrylu, oddzielono, a następnie oczyszczono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Masę cząsteczkową cyklicznego peptydu potwierdzono za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS), a stabilność kombinacji cyklicznego peptydu z reduktorem potwierdzono za pomocą HPLC. Ponadto przesunięcie chemiczne w cyklicznym peptydzie analizowano za pomocą widm magnetycznegorezonansu jądrowego 1 H (1H NMR). Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten miał na celu ustanowienie skutecznej strategii syntezy cyklicznych peptydów.

Wszystkie peptydy liniowe zostały zsyntetyzowane na żywicy Rink-amide MBHA przy użyciu standardowej manualnej syntezy na fazie stałej metodą Fmoc. Modelowy cykliczny heksapeptyd (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) został zbudowany zgodnie z opisem na Ryc. 5A. Warto zauważyć, że w wyniku alkilowania Met powstało nowe chiralne centrum na łańcuchu, a obecność dwóch epimerów peptydu cyklicznego (Ia, Ib) potwierdzono za pomocą HPLC w odwróconej fazie. Ponadto konwersję oraz stosunek epimerów okr...

Ten protokół przedstawia syntezę cyklicznych peptydów poprzez bissalkilację między cysteiną a metioniną oraz łatwą reakcję tiol-yne wywołaną przez centrum propargylu sulfonium.

Konstruowanie cyklicznych peptydów przy użyciu centrum sulfonowego na uwięzi

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

W tym protokole skonstruowano sól sulfonium, która mogła działać jak nowa ręka, która reagowała z białkiem cysteiną w specjalnej odległości. Zaletą tej techniki było to, że reakcja ta była szybka i wydajna, a także wolna od katalizatora Met, a także opracowano prostą i wydajną metodę stabilizacji peptydów. Na początek przygotuj N-końcowy roztwór 9-fluorynyloksykarbonylowy 20% piperydyny lub 50% morfoliny i DMF w 500-mililitrowej zlewce lub kolbie.Następnie dodaj 10 mililitrów roztworu odwadniającego do kolumny i wlewaj azot do roztworu przez 30 minut lub dwa razy przez pięć minut. Odcedzić roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyć żywicę kolejno pięciokrotnie dichlorometanem i N,N-dimetyloformamidem. Aby wykryć żywicę jako ciemnożółty roztwór, dodaj jeden mililitr N, N-dimetyloformamidu do niewielkiej ilości żywicy i dodaj 200 mikrolitrów 5% ninhydryny do szklanej probówki.Podgrzej go w 130 stopniach Celsjusza przez trzy minuty, aby ocenić zmiany koloru żywicy. W celu sprzężenia peptydów należy przygotować roztwór mieszaniny zgodnie z opisem w manuskrypcie w probówce polipropylenowej i rozpuścić go w trzech mililitrach N, N-dimetyloformamidu. Następnie dodaj 173 mikrolitry N, N-diizopropyloetyloaminy lub 154 mikrolitry N, N'diizopropylokarbodiamidu do roztworu, aby dezaktywować aminokwas.Następnie dodaj mieszaninę do kolumny z żywicą i bąbelkuj ją azotem przez dwie godziny. Po sprzężeniu dodaj jeden mililitr N, N-dimetyloformamidu do niewielkiej ilości żywicy i dodaj 200 mikrolitrów 5% ninhydryny do szklanej probówki. Podgrzej go w 130 stopniach Celsjusza przez trzy minuty, podczas gdy żywica zmieni się na bezbarwną, co potwierdza brak wolnej grupy aminowej przed etapem deprotekcji.Po odsączeniu roztworu umyj żywicę, jak pokazano wcześniej, i dodaj 10 mililitrów roztworu odwadniającego do kolumny. Następnie bąbelkować azotem przez 30 minut lub dwa razy przez pięć minut. I znowu dodaj świeży roztwór.Dodaj 10 mililitrów bezwodnego metanolu do kolumny z żywicą w celu odwodnienia i wysusz azotem do następnego użycia. Odważyć 100 miligramów żywicy do kolumny i przepłukać żywicę dichlorometanem i N, N-dimetyloformamidem przed etapem sprzęgania. Przygotować roztwór do usunięcia grupy ochronnej trytylo-L-cysteiny przez dodanie mieszaniny kwasu trifluorooctowego, triizopropylosilanu i dichlorometanu w 100-mililitrowej zlewce lub kolbie w celu usunięcia grupy ochronnej.Dodaj pięć do 10 mililitrów przygotowanego roztworu do kolumny, aby usunąć grupę ochronną na 10 minut. Powtórz sześć razy z bulgotaniem azotu, aż żółty kolor całkowicie zniknie. Po spuszczeniu roztworu za pomocą pompy próżniowej umyj żywicę, jak pokazano wcześniej.Następnie przygotuj roztwór do reakcji z odzabezpieczoną cysteiną, dodając dihalogenowany łącznik i N, N-diizopropyloetyloaminę w 50-mililitrowej zlewce lub kolbie z N, N-dimetyloformamidem. Dodaj od pięciu do 10 mililitrów roztworu reakcyjnego do kolumny, aby reagować z chronioną cysteiną przez co najmniej trzy godziny z bulgotaniem azotu. Ponownie spuść roztwór za pomocą pompy próżniowej i umyj żywicę sekwencyjnie, jak pokazano wcześniej.Aby przygotować roztwór cyklizacji peptydów, dodaj mieszaninę kwasu trifluorooctowego do 20-mililitrowej zlewki lub kolby w dygestorii do cyklizacji peptydów. Następnie dodaj od pięciu do 10 mililitrów roztworu mieszaniny do probówki polipropylenowej i rozszczepij żywicę pod koktajlem kwasu trifluorooctowego przez trzy godziny. Po odwodnieniu i umyciu żywicy przed wcześniejszym zademonstrowaniem etapu sprzęgania, należy przygotować 1% roztwór wodny kwasu mrówkowego i jeden milimolowy bromek propargylu i dodać do roztworu peptydu metioniny.Następnie wstrząsać reakcją sprzęgania metioniny i bromku propargylu w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Po reakcji rozpuścić produkt w probówce z polipropylenu i acetonitrylu i przefiltrować przez membranę filtracyjną o średnicy 0,22 mikrometra. Następnie należy natychmiast oczyścić roztwór za pomocą HPLC z odwróconą fazą i wysuszyć go na proszek do następnego użycia.Zsyntetyzowane peptydy cykliczne wykorzystujące bis-alkilowanie między cysteiną a metioniną scharakteryzowano za pomocą widma HPLC i LCMS, co pokazuje, że epimery wykazywały różne czasy retencji i identyczne masy cząsteczkowe. Ślady HPLC epimerów i ich sprzężonego produktu wykazały zależną od czasu konwersję między cyklicznym peptydem a jego produktem. Masę cząsteczkową cyklicznych peptydów syntetyzowanych w reakcji typu tiol-yn oznaczono za pomocą LCMS, a peptyd wyizolowano i oczyszczono za pomocą HPLC.Peptydy zostały następnie scharakteryzowane za pomocą NMR protonów i heterojądrowych widm koherentnych pojedynczych kwantowych, ujawniając przesunięcie chemiczne. Widma protonowego NMR zależnej od czasu konwersji między cyklicznym peptydem a ditiotreitolem i tlenkiem deuteru uzyskano w celu zbadania stabilności peptydu spowodowanego otwarciem pierścienia sulfonowego. Wyniki wykazały, że po 24 godzinach nie powstały żadne produkty dodawania lub otwierania pierścienia.Procedura ta ustanowiła skuteczną strategię syntezy cyklicznych peptydów. Reakcja mówi, że selektywność została również zwiększona poprzez tworzenie potwierdzenia, które stabilizuje peptyd cyklizacyjny, co wskazuje, że cykliczne peptydy były obiecującym katalizatorem leków.

constructing-cyclic-peptides-using-an-on-tether-sulfonium-center

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisano wydajną syntezę na fazie stałej funkcjonalizowanego trimeru bis-peptydowego z wykorzystaniem procedury odszczepiania typu „safety catch” z żywicy HMBA.

Synteza na fazie stałej funkcjonalizowanego bis-peptydu z wykorzystaniem metodologii „safety catch”

Przedstawiono prostą i ogólną metodę syntezy cyklicznych peptydów za pomocą promieniowania mikrofalowego. Procedura ta umożliwia syntezę cyklicznych peptydów szkieletowych ze zbiorem różnych konformacji przy zachowaniu łańcuchów bocznych i ugrupowań farmakoforycznych, a tym samym pozwala na badanie przesiewowe pod kątem konformacji bioaktywnej.

Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Przedstawiamy protokół budowy spiralnych peptydów tioeterowych/siarczków winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiol-en/tiol-yne.

Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

Synteza amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) jest znaczącym wyzwaniem ze względu na obecność wielu azotów aminowych, co wymaga rozsądnego użycia grup ochronnych w celu zamaskowania tych reaktywnych funkcji. W tym artykule opisujemy łatwą metodę otrzymywania tych nowych klas cząsteczek samoorganizujących się.

Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Peptydy bogate w cysteinę składają się w odrębne trójwymiarowe struktury w zależności od ich połączeń dwusiarczkowych. Ukierunkowana synteza pojedynczych izomerów dwusiarczkowych jest wymagana, gdy utlenianie buforu nie prowadzi do pożądanego połączenia dwusiarczkowego. Protokół dotyczy selektywnej syntezy peptydów z wiązaniami 3-dwusiarczkowymi oraz ich analizy strukturalnej z wykorzystaniem badań NMR i MS/MS.

Synteza i oznaczanie struktury izomerów PIIIA μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych

Enancjomerycznie wzbogacone szkielety bispiro[γ-butyrolakton-pirolidyn-4,4'-pirazolon] są asymetrycznie syntetyzowane przez prostą organokatalityczną reakcję cykloaddycji 1,3-dipolarnej.

Wydajna budowa lekopodobnych rusztowań bispirocyklicznych poprzez cykloaddycje organokatalityczne α-imino γ-laktonów i alkilolidenopirazlonów

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Ten protokół opisuje syntezę cyklicznych peptydów penetrujących komórki z aromatycznymi wiązaniami krzyżowymi oraz ocenę ich przepuszczalności przez bariery biologiczne.

Budowa cyklicznych peptydów penetrujących komórki w celu zwiększenia penetracji barier biologicznych

Prezentowano prosty, niedrogi i nowatorski aparat do syntezy peptydów w fazie stałej w komercyjnym reaktorze mikrofalowym.

Niedroga adaptacja komercyjnego reaktora mikrofalowego do syntezy peptydów fazy stałej

Poznaj metodę syntezy cyklicznych peptydów wykorzystującą centrum sulfonowe na uwięzi. Technika opiera się na bisalkilacji cysteiny i metioniny oraz reakcji tiol-yn bez katalizatora Met.

Konstruowanie cyklicznych peptydów przy użyciu centrum sulfonowego na uwięzi

Przeglądaj więcej filmów