Konstruowanie cyklicznych peptydów przy użyciu centrum sulfonowego na uwięzi

W tym protokole skonstruowano sól sulfonium, która mogła działać jak nowa ręka, która reagowała z białkiem cysteiną w specjalnej odległości. Zaletą tej techniki było to, że reakcja ta była szybka i wydajna, a także wolna od katalizatora Met, a także opracowano prostą i wydajną metodę stabilizacji peptydów. Na początek przygotuj N-końcowy roztwór 9-fluorynyloksykarbonylowy 20% piperydyny lub 50% morfoliny i DMF w 500-mililitrowej zlewce lub kolbie.

Następnie dodaj 10 mililitrów roztworu odwadniającego do kolumny i wlewaj azot do roztworu przez 30 minut lub dwa razy przez pięć minut. Odcedzić roztwór za pomocą pompy próżniowej i przemyć żywicę kolejno pięciokrotnie dichlorometanem i N,N-dimetyloformamidem. Aby wykryć żywicę jako ciemnożółty roztwór, dodaj jeden mililitr N, N-dimetyloformamidu do niewielkiej ilości żywicy i dodaj 200 mikrolitrów 5% ninhydryny do szklanej probówki.

Podgrzej go w 130 stopniach Celsjusza przez trzy minuty, aby ocenić zmiany koloru żywicy. W celu sprzężenia peptydów należy przygotować roztwór mieszaniny zgodnie z opisem w manuskrypcie w probówce polipropylenowej i rozpuścić go w trzech mililitrach N, N-dimetyloformamidu. Następnie dodaj 173 mikrolitry N, N-diizopropyloetyloaminy lub 154 mikrolitry N, N'diizopropylokarbodiamidu do roztworu, aby dezaktywować aminokwas.

Następnie dodaj mieszaninę do kolumny z żywicą i bąbelkuj ją azotem przez dwie godziny. Po sprzężeniu dodaj jeden mililitr N, N-dimetyloformamidu do niewielkiej ilości żywicy i dodaj 200 mikrolitrów 5% ninhydryny do szklanej probówki. Podgrzej go w 130 stopniach Celsjusza przez trzy minuty, podczas gdy żywica zmieni się na bezbarwną, co potwierdza brak wolnej grupy aminowej przed etapem deprotekcji.

Po odsączeniu roztworu umyj żywicę, jak pokazano wcześniej, i dodaj 10 mililitrów roztworu odwadniającego do kolumny. Następnie bąbelkować azotem przez 30 minut lub dwa razy przez pięć minut. I znowu dodaj świeży roztwór.

Dodaj 10 mililitrów bezwodnego metanolu do kolumny z żywicą w celu odwodnienia i wysusz azotem do następnego użycia. Odważyć 100 miligramów żywicy do kolumny i przepłukać żywicę dichlorometanem i N, N-dimetyloformamidem przed etapem sprzęgania. Przygotować roztwór do usunięcia grupy ochronnej trytylo-L-cysteiny przez dodanie mieszaniny kwasu trifluorooctowego, triizopropylosilanu i dichlorometanu w 100-mililitrowej zlewce lub kolbie w celu usunięcia grupy ochronnej.

Dodaj pięć do 10 mililitrów przygotowanego roztworu do kolumny, aby usunąć grupę ochronną na 10 minut. Powtórz sześć razy z bulgotaniem azotu, aż żółty kolor całkowicie zniknie. Po spuszczeniu roztworu za pomocą pompy próżniowej umyj żywicę, jak pokazano wcześniej.

Następnie przygotuj roztwór do reakcji z odzabezpieczoną cysteiną, dodając dihalogenowany łącznik i N, N-diizopropyloetyloaminę w 50-mililitrowej zlewce lub kolbie z N, N-dimetyloformamidem. Dodaj od pięciu do 10 mililitrów roztworu reakcyjnego do kolumny, aby reagować z chronioną cysteiną przez co najmniej trzy godziny z bulgotaniem azotu. Ponownie spuść roztwór za pomocą pompy próżniowej i umyj żywicę sekwencyjnie, jak pokazano wcześniej.

Aby przygotować roztwór cyklizacji peptydów, dodaj mieszaninę kwasu trifluorooctowego do 20-mililitrowej zlewki lub kolby w dygestorii do cyklizacji peptydów. Następnie dodaj od pięciu do 10 mililitrów roztworu mieszaniny do probówki polipropylenowej i rozszczepij żywicę pod koktajlem kwasu trifluorooctowego przez trzy godziny. Po odwodnieniu i umyciu żywicy przed wcześniejszym zademonstrowaniem etapu sprzęgania, należy przygotować 1% roztwór wodny kwasu mrówkowego i jeden milimolowy bromek propargylu i dodać do roztworu peptydu metioniny.

Następnie wstrząsać reakcją sprzęgania metioniny i bromku propargylu w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Po reakcji rozpuścić produkt w probówce z polipropylenu i acetonitrylu i przefiltrować przez membranę filtracyjną o średnicy 0,22 mikrometra. Następnie należy natychmiast oczyścić roztwór za pomocą HPLC z odwróconą fazą i wysuszyć go na proszek do następnego użycia.

Zsyntetyzowane peptydy cykliczne wykorzystujące bis-alkilowanie między cysteiną a metioniną scharakteryzowano za pomocą widma HPLC i LCMS, co pokazuje, że epimery wykazywały różne czasy retencji i identyczne masy cząsteczkowe. Ślady HPLC epimerów i ich sprzężonego produktu wykazały zależną od czasu konwersję między cyklicznym peptydem a jego produktem. Masę cząsteczkową cyklicznych peptydów syntetyzowanych w reakcji typu tiol-yn oznaczono za pomocą LCMS, a peptyd wyizolowano i oczyszczono za pomocą HPLC.

Peptydy zostały następnie scharakteryzowane za pomocą NMR protonów i heterojądrowych widm koherentnych pojedynczych kwantowych, ujawniając przesunięcie chemiczne. Widma protonowego NMR zależnej od czasu konwersji między cyklicznym peptydem a ditiotreitolem i tlenkiem deuteru uzyskano w celu zbadania stabilności peptydu spowodowanego otwarciem pierścienia sulfonowego. Wyniki wykazały, że po 24 godzinach nie powstały żadne produkty dodawania lub otwierania pierścienia.

Procedura ta ustanowiła skuteczną strategię syntezy cyklicznych peptydów. Reakcja mówi, że selektywność została również zwiększona poprzez tworzenie potwierdzenia, które stabilizuje peptyd cyklizacyjny, co wskazuje, że cykliczne peptydy były obiecującym katalizatorem leków.