Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie hydrożeli o mikrowzorze do badań mikroskopii sił trakcyjnych 2D. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw szkiełka nakrywkowego ze szkła metakrylanego i uformowanie na nim pierwszej warstwy hydrożelu poliakrylamidowego. Drugim krokiem jest stworzenie kolejnej warstwy hydrożelu zawierającej kulki fluorescencyjne do mikroskopii siły pociągowej.

Hydrożel jest nakładany na niego szkiełkiem nakrywkowym z mikrowzorem, co powoduje przeniesienie białek matrycy mikrowzoru na powierzchnię hydrożelu. Następnie hydrożel poliakrylamidowy pozostawia się do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Następnie ostrożnie usuwa się górną szkiełko nakrywkowe.

Obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym służy do wykazania obecności kulek i pomyślnego transferu białek macierzy zewnątrzkomórkowej o mikrowzorze. Metoda ta pomaga skutecznie i precyzyjnie mierzyć siły trakcyjne komórkowe poprzez wykorzystanie indukowanego światłem uwalniania komórek. Umożliwienie uzyskania większej liczby obserwacji doświadczalnych z tej samej próbki.

Procedurę zademonstruje Joel Christian, doktorant z mojego laboratorium. Dodaj 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody do zlewki. Następnie dodaj do roztworu 18,75 mililitra kwasu octowego, 18,75 mililitra metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu i 252,5 mililitra etanolu.

Gdy roztwór będzie gotowy, przenieś go do naczynia krystalizującego. Weź okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 24 milimetrów, wyczyść je precyzyjną chusteczką i włóż do specjalnie wykonanego stojaka teflonowego. Następnie zanurz go w roztworze i inkubuj przez 15 minut.

Weź stojak i opłucz go etanolem. Wysuszyć szkiełka pokrywy pod przepływem powietrza. Metakrylowane szkiełka nakrywkowe można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze pokojowej.

Weź 15-milimetrowe okrągłe szkiełko nakrywkowe i połóż je na szalce Petriego. Użyj pisaka diamentowego, aby zaznaczyć górną stronę szkiełka nakrywkowego. Następnie przystąp do czyszczenia za pomocą plazmy tlenowej.

Szkiełko nakrywkowe jest czyste przy ciśnieniu 0,4 milibara i mocy 200 watów przez dwie minuty. Odpipetować 100 mikrolitrów 0,01% roztworu poli-L-lizyny na powierzchnię szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe 10-milimolowym HEPES o pH 8,5.

Usuń nadmiar płynu, ale utrzymuj powierzchnię mokrą. Odpipetować 100 mikrolitrów po 50 miligramów na mililitr mPEG-SVA w 10-milimolowym roztworze HEPES o pH 8,5 na powierzchnię szkiełka nakrywkowego i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie spłucz szkiełka nakrywkowe 10-milimolowym filtrem HEPES o pH 8,5.

Następnie dodaj dwa mikrolitry żelu PLPP, a następnie 40 mikrolitrów etanolu na powierzchnię. Delikatnie przechyl szalkę Petriego, aby homogenizować roztwór. Odczekać pięć minut, aż roztwór zacznie polimeryzować.

Umieść szkiełko nakrywkowe w 35-milimetrowej szalce Petriego z dolnym otworem. Umieścić szalkę Petriego zawierającą szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu. Dostosuj ostrość na powierzchni szkła.

Załaduj i zablokuj wstępnie narysowany wzór. Rozpocznij wzór od dawki UV wynoszącej 30 milidżuli na milimetr kwadratowy. Po zakończeniu etapu tworzenia wzoru wyjmij szkiełko nakrywkowe i spłucz powierzchnię PBS.

Inkubować próbkę ze 100-mikrolitrową mieszaniną 25 mikrogramów na mililitr fibronektyny i 25 mikrogramów na mililitr fibrynogenu sprzężoną z Alexa 488 rozpuszczoną w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Aby przygotować podłoże hydrożelowe, należy rozpocząć od umieszczenia metakrylonego szkiełka nakrywkowego na szalce Petriego. Na początek przygotuj świeży utleniony roztwór HEA, dodając 9,55 mililitra podwójnie destylowanej wody do 15-mililitrowej probówki Falcon.

Następnie dodaj 0,5 mililitra HEA. Następnie dodaj 42 miligramy metapirogronianu sodu do roztworu. Umieść roztwór na shakerze na cztery godziny.

Następnie przygotować roztwór podstawowy, mieszając akrylamid, bis-akryloamid i wodę podwójnie destylowaną zgodnie z tabelą 1. Roztwór podstawowy można przechowywać do roku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotować roztwór roboczy dla dolnej warstwy, mieszając 99,3 mikrolitra roztworu podstawowego z 0,5 mikrolitra nadsiarczanu amonu 1% i 0,2 mikrolitra TEMED.

Pobrać 10 mikrolitrów z roztworu i pipetować kroplami na metakrylowane szkiełko nakrywkowe. Ostrożnie umieść 15-milimetrowe okrągłe szkiełko nakrywkowe na kropli i odczekaj 45 minut, aż się spolimeryzuje. Następnie odczep górną szkiełko nakrywkowe za pomocą skalpela.

Następnie przygotuj roztwór roboczy dla warstwy wierzchniej, mieszając 93,3 mikrolitra roztworu podstawowego z jednym mikrolitrem utlenionego HEA, pięcioma mikrolitrami kulek fluorescencyjnych, 0,5 mikrolitra nadsiarczanu amonu 1% i 0,2 mikrolitra TEMED. Weź pięć mikrolitrów z roztworu i odpipetuj go kroplami na dolną warstwę hydrożelu. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem na kropli.

Poczekaj 45 minut, aż się zpolimeryzuje. Delikatnie odczep szkiełko nakrywkowe skalpelem. I przyklej szkiełko nakrywkowe do spodu niestandardowej wywierconej płytki sześciodołkowej.

Dodaj PBS do studzienek. Aby zobaczyć komórki, odessaj PBS z płytki sześciodołkowej. W przypadku fibroblastów dodaj DMEM o wysokim poziomie glukozy zawierający L-glutaminę i uzupełnij go 10% FBS i 1% penicyliny oraz streptomycyny.

Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Włącz CO2 i ogrzewanie dla stolika mikroskopowego. Następnie włącz mikroskop i umieść płytkę studzienki na stoliku.

Ustaw wzór oświetlenia i zaznacz interesujące Cię komórki. Ponownie skup się na powierzchni hydrożelu. Uzyskaj obraz komórek w kanale jasnego pola.

Aby zrobić obraz koralików w stanie zdeformowanym, przełącz się na kanał Cy5. Następnie przełącz się na kanał laserowy i oświetlaj ogniwo zgodnie ze wzorem przez trzy minuty. Odpowiada to dawce 6 000 milidżuli na milimetr kwadratowy.

Następnie przełącz kanał i uzyskaj obraz koralików w stanie niezdeformowanym. Aby obliczyć siły uciągu, otwórz obrazy koralików fluorescencyjnych, które zostały już skorygowane o dryf boczny. Pełna analiza sił trakcyjnych jest szczegółowo opisana w załączonym skrypcie.

Aby zweryfikować selektywną adhezję komórek do mikrowzorcowych obszarów na powierzchni hydrożeli, próbki zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu wstępnie znakowanych białek matrycowych oraz za pomocą mikroskopii szerokokątnej w celu wizualizacji komórek. Właściwości mechaniczne hydrożeli poliakrylamidowych zmieniały się poprzez mieszanie różnych ilości akrylamidu i bis-akrylamidu. Sztywność hydrożelu oceniano za pomocą eksperymentów z nanotwardością za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Pomiary siły pociągowej przeprowadzono po zastosowaniu przestrzennego, kontrolowanego czasowo oświetlenia wiązką lasera ultrafioletowego w celu selektywnego oświetlenia mikronowych obszarów hydrożelu poliakrylamidowego. Siły trakcyjne zostały zrekonstruowane przy użyciu regularyzowanego FTTC z parametrem regularyzacji wybranym przez uogólnioną walidację krzyżową. Nasze modułowe podejście oparte na mikroskopii sił trakcyjnych w połączeniu z indukowanym światłem uwalnianiem komórek mikrowzorcowych jest wszechstronne i może być dalej wykorzystywane z innymi mikroskopami i obrazowaniem w celu poprawy rozdzielczości i czułości.