Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych
29 stycznia 2022
Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.
Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie hydrożeli o mikrowzorze do badań mikroskopii sił trakcyjnych 2D. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw szkiełka nakrywkowego ze szkła metakrylanego i uformowanie na nim pierwszej warstwy hydrożelu poliakrylamidowego. Drugim krokiem jest stworzenie kolejnej warstwy hydrożelu zawierającej kulki fluorescencyjne do mikroskopii siły pociągowej.
Hydrożel jest nakładany na niego szkiełkiem nakrywkowym z mikrowzorem, co powoduje przeniesienie białek matrycy mikrowzoru na powierzchnię hydrożelu. Następnie hydrożel poliakrylamidowy pozostawia się do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Następnie ostrożnie usuwa się górną szkiełko nakrywkowe.
Obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym służy do wykazania obecności kulek i pomyślnego transferu białek macierzy zewnątrzkomórkowej o mikrowzorze. Metoda ta pomaga skutecznie i precyzyjnie mierzyć siły trakcyjne komórkowe poprzez wykorzystanie indukowanego światłem uwalniania komórek. Umożliwienie uzyskania większej liczby obserwacji doświadczalnych z tej samej próbki.
Procedurę zademonstruje Joel Christian, doktorant z mojego laboratorium. Dodaj 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody do zlewki. Następnie dodaj do roztworu 18,75 mililitra kwasu octowego, 18,75 mililitra metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu i 252,5 mililitra etanolu.
Gdy roztwór będzie gotowy, przenieś go do naczynia krystalizującego. Weź okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 24 milimetrów, wyczyść je precyzyjną chusteczką i włóż do specjalnie wykonanego stojaka teflonowego. Następnie zanurz go w roztworze i inkubuj przez 15 minut.
Weź stojak i opłucz go etanolem. Wysuszyć szkiełka pokrywy pod przepływem powietrza. Metakrylowane szkiełka nakrywkowe można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze pokojowej.
Weź 15-milimetrowe okrągłe szkiełko nakrywkowe i połóż je na szalce Petriego. Użyj pisaka diamentowego, aby zaznaczyć górną stronę szkiełka nakrywkowego. Następnie przystąp do czyszczenia za pomocą plazmy tlenowej.
Szkiełko nakrywkowe jest czyste przy ciśnieniu 0,4 milibara i mocy 200 watów przez dwie minuty. Odpipetować 100 mikrolitrów 0,01% roztworu poli-L-lizyny na powierzchnię szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe 10-milimolowym HEPES o pH 8,5.
Usuń nadmiar płynu, ale utrzymuj powierzchnię mokrą. Odpipetować 100 mikrolitrów po 50 miligramów na mililitr mPEG-SVA w 10-milimolowym roztworze HEPES o pH 8,5 na powierzchnię szkiełka nakrywkowego i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie spłucz szkiełka nakrywkowe 10-milimolowym filtrem HEPES o pH 8,5.
Następnie dodaj dwa mikrolitry żelu PLPP, a następnie 40 mikrolitrów etanolu na powierzchnię. Delikatnie przechyl szalkę Petriego, aby homogenizować roztwór. Odczekać pięć minut, aż roztwór zacznie polimeryzować.
Umieść szkiełko nakrywkowe w 35-milimetrowej szalce Petriego z dolnym otworem. Umieścić szalkę Petriego zawierającą szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu. Dostosuj ostrość na powierzchni szkła.
Załaduj i zablokuj wstępnie narysowany wzór. Rozpocznij wzór od dawki UV wynoszącej 30 milidżuli na milimetr kwadratowy. Po zakończeniu etapu tworzenia wzoru wyjmij szkiełko nakrywkowe i spłucz powierzchnię PBS.
Inkubować próbkę ze 100-mikrolitrową mieszaniną 25 mikrogramów na mililitr fibronektyny i 25 mikrogramów na mililitr fibrynogenu sprzężoną z Alexa 488 rozpuszczoną w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Aby przygotować podłoże hydrożelowe, należy rozpocząć od umieszczenia metakrylonego szkiełka nakrywkowego na szalce Petriego. Na początek przygotuj świeży utleniony roztwór HEA, dodając 9,55 mililitra podwójnie destylowanej wody do 15-mililitrowej probówki Falcon.
Następnie dodaj 0,5 mililitra HEA. Następnie dodaj 42 miligramy metapirogronianu sodu do roztworu. Umieść roztwór na shakerze na cztery godziny.
Następnie przygotować roztwór podstawowy, mieszając akrylamid, bis-akryloamid i wodę podwójnie destylowaną zgodnie z tabelą 1. Roztwór podstawowy można przechowywać do roku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotować roztwór roboczy dla dolnej warstwy, mieszając 99,3 mikrolitra roztworu podstawowego z 0,5 mikrolitra nadsiarczanu amonu 1% i 0,2 mikrolitra TEMED.
Pobrać 10 mikrolitrów z roztworu i pipetować kroplami na metakrylowane szkiełko nakrywkowe. Ostrożnie umieść 15-milimetrowe okrągłe szkiełko nakrywkowe na kropli i odczekaj 45 minut, aż się spolimeryzuje. Następnie odczep górną szkiełko nakrywkowe za pomocą skalpela.
Następnie przygotuj roztwór roboczy dla warstwy wierzchniej, mieszając 93,3 mikrolitra roztworu podstawowego z jednym mikrolitrem utlenionego HEA, pięcioma mikrolitrami kulek fluorescencyjnych, 0,5 mikrolitra nadsiarczanu amonu 1% i 0,2 mikrolitra TEMED. Weź pięć mikrolitrów z roztworu i odpipetuj go kroplami na dolną warstwę hydrożelu. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem na kropli.
Poczekaj 45 minut, aż się zpolimeryzuje. Delikatnie odczep szkiełko nakrywkowe skalpelem. I przyklej szkiełko nakrywkowe do spodu niestandardowej wywierconej płytki sześciodołkowej.
Dodaj PBS do studzienek. Aby zobaczyć komórki, odessaj PBS z płytki sześciodołkowej. W przypadku fibroblastów dodaj DMEM o wysokim poziomie glukozy zawierający L-glutaminę i uzupełnij go 10% FBS i 1% penicyliny oraz streptomycyny.
Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Włącz CO2 i ogrzewanie dla stolika mikroskopowego. Następnie włącz mikroskop i umieść płytkę studzienki na stoliku.
Ustaw wzór oświetlenia i zaznacz interesujące Cię komórki. Ponownie skup się na powierzchni hydrożelu. Uzyskaj obraz komórek w kanale jasnego pola.
Aby zrobić obraz koralików w stanie zdeformowanym, przełącz się na kanał Cy5. Następnie przełącz się na kanał laserowy i oświetlaj ogniwo zgodnie ze wzorem przez trzy minuty. Odpowiada to dawce 6 000 milidżuli na milimetr kwadratowy.
Następnie przełącz kanał i uzyskaj obraz koralików w stanie niezdeformowanym. Aby obliczyć siły uciągu, otwórz obrazy koralików fluorescencyjnych, które zostały już skorygowane o dryf boczny. Pełna analiza sił trakcyjnych jest szczegółowo opisana w załączonym skrypcie.
Aby zweryfikować selektywną adhezję komórek do mikrowzorcowych obszarów na powierzchni hydrożeli, próbki zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu wstępnie znakowanych białek matrycowych oraz za pomocą mikroskopii szerokokątnej w celu wizualizacji komórek. Właściwości mechaniczne hydrożeli poliakrylamidowych zmieniały się poprzez mieszanie różnych ilości akrylamidu i bis-akrylamidu. Sztywność hydrożelu oceniano za pomocą eksperymentów z nanotwardością za pomocą mikroskopii sił atomowych.
Pomiary siły pociągowej przeprowadzono po zastosowaniu przestrzennego, kontrolowanego czasowo oświetlenia wiązką lasera ultrafioletowego w celu selektywnego oświetlenia mikronowych obszarów hydrożelu poliakrylamidowego. Siły trakcyjne zostały zrekonstruowane przy użyciu regularyzowanego FTTC z parametrem regularyzacji wybranym przez uogólnioną walidację krzyżową. Nasze modułowe podejście oparte na mikroskopii sił trakcyjnych w połączeniu z indukowanym światłem uwalnianiem komórek mikrowzorcowych jest wszechstronne i może być dalej wykorzystywane z innymi mikroskopami i obrazowaniem w celu poprawy rozdzielczości i czułości.
Przegląd
To badanie łączy litografię w pobliżu UV i mikroskopię sił trakcyjnych w celu zmierzenia sił komórkowych na mikrowzórkach żeli. Metoda ta pozwala na ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek indukowanych światłem, umożliwiając dużą liczbę pomiarów z tej samej próbki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biofizyka
Tło
- Mikroskopię sił trakcyjnych stosuje się do badania mechaniki komórkowej.
- Mikrowzórki żeli zapewniają kontrolowane środowisko dla adhezyjności komórek.
- Litografia w pobliżu UV umożliwia precyzyjne kształtowanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Efektywne pomiary sił komórkowych mogą poprawić nasze zrozumienie zachowania komórek.
Cel badania
- Wytworzenie mikrowzórków żeli do mikroskopii sił trakcyjnych.
- Poprawa dokładności i wydajności pomiarów sił komórkowych.
- Przedstawienie procedury pomiaru sił trakcyjnych komórek z wykorzystaniem studenta jako demonstranta.
Zastosowane metody
- Przygotowanie szkła pokrywowego zmodyfikowanego metacrylatem.
- Tworzenie warstw żelu poliakrylamidu z fluorescencyjnymi kulkami.
- Zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do zweryfikowania pomyślnego przeniesienia wzorca.
- Zastosowanie litografii w pobliżu UV do mikrowzórków.
Główne wyniki
- Pomyślne wytworzenie mikrowzórków żeli.
- Zdemonstrowana zdolność do efektywnego pomiaru sił trakcyjnych komórek.
- Duża liczba pomiarów uzyskanych z jednej próbki.
- Weryfikacja obecności kulek i przeniesienia wzorca poprzez obrazowanie.
Konkluzje
- Połączona metoda poprawia badanie mechaniki komórkowej.
- Uwolnienie komórek indukowanych światłem umożliwia wielokrotne pomiary.
- To podejście może być zastosowane do różnych typów komórek w dalszych badaniach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardizing cell adhesion patterns enables reproducible traction force measurements, addressing variability in cell shape and force output that limits throughput in mechanobiology assays. This approach supports predictive confidence in target validation by providing quantitative, deformation-based readouts of cellular mechanotransduction pathways. The method enhances assay reliability for early discovery workflows where mechanical phenotype correlates with drug response or target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by controlling adhesion geometry to isolate force-dependent signaling pathways.
- Operational Value: Reduces biological noise from heterogeneous cell spreading, improving assay consistency across replicates.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking of targets involved in mechanosensing, such as YAP/TAZ or integrin-linked kinases.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantifiable traction force matrices for comparing compound effects on cellular contractility.
- Operational Value: Allows sequential force measurements from the same sample via localized UV release, increasing data density per well.
- Assay Readiness: Produces reusable hydrogel substrates with defined adhesive islands compatible with high-resolution imaging and bead-based displacement tracking.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro mechanical phenotypes to disease-relevant models where altered traction forces indicate pathological states.
- Preclinical Utility: Enables dose-response profiling of compounds targeting cytoskeletal regulators or focal adhesion components.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies mechanotoxic liabilities early by detecting aberrant force generation in patterned cellular systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for pathways where mechanical signaling modulates target validity or compound efficacy.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by enabling controlled application and release of mechanical cues to dissect force-dependent signaling nodes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative displacement readouts of embedded beads as a proxy for cellular traction forces across conditions.
- Analytics: Employs regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) to reconstruct traction fields, providing standardized force maps for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanical output to phenotypic outcomes only when supported by disease models showing traction force alterations in fibrosis, cancer, or stem cell differentiation.
- Enterprise Reuse: Positions the hydrogel patterning workflow as a modular, adaptable platform for mechanophenotyping across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing confounding variables in cellular force measurements.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized adhesion patterns and sequential sampling via light-induced release.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of mechanobiological liabilities that may lead to late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on mechanical phenotype concordance with disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photolithography, hydrogel chemistry, and fluorescence microscopy for pattern fabrication and bead tracking.
- Depends on UV illumination systems with spatial control and polyacrylamide synthesis capabilities for tunable elasticity.
- Necessitates standardization of protein coating protocols and UV dosing to ensure consistent adhesion patterns across batches.
- Involves adaptation considerations when extending to 3D models or primary cells with distinct adhesion kinetics.
- Practical limitations include UV-induced hydrogel degradation over repeated cycles and bead photobleaching during prolonged imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:22
Preparation of Methacrylated Coverslips
2:39
Micropatterning of Extracellular Matrix Proteins on Glass Coverslips
5:31
Fabrication of Patterned Polyacrylamide Hydrogels
9:15
Local Release of Cell Traction Forces by UV-A Laser Illumination
10:26
Image Processing, Particle Image Velocity and Calculation of Traction Forces
10:55
Results
11:56
Conclusion
