Name: Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii sił trakcyjnych z wykorzystaniem hydrożeli poliakrylamidowych i litografii UV. Technika umożliwia precyzyjne pomiar sił komórkowych oraz wielokrotne pomiary z tej samej próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pani Rebecce Alvarado za wsparcie w produkcji filmu z protokołem oraz Panu Stephenowi Casale za konstruktywną krytykę rękopisu. Dziękujemy kolegom z Zakładu Biofizyki Komórkowej Instytutu Badań Medycznych im. Maxa Plancka za pomocne dyskusje. Wsparcie finansowe ze strony Max-Planck-Gesellschaft dla E.A.C.-A. oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 do E.A.C.-A. i P4 do U.S.S.; DFG EXC 2082/1-390761711 do U.S.S.) jest również bardzo ceniony. J.B. dziękuje Fundacji Carla Zeissa za wsparcie finansowe. E.A.C.-A., C.S. i U.S.S. potwierdzają finansowanie za pośrednictwem Max Planck School Matter to Life wspieranego przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF). C.S. jest wspierany przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (Consolidator Grant PHOTOMECH, no.101001797).

<ol><li>Geiger, B., Bershadsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+neighborhood%3A+adhesion-coupled+cell+mechanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors.</a> Cell. 110 (2), 139-142 (2002).</li>
<li>Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -l, Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+forces+of+fibroblasts+are+regulated+by+the+Rho-dependent+kinase+but+not+by+the+myosin+light+chain+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7(2006).</li>
<li>Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li>
<li>Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+spread+area+and+traction+forces+determine+myosin-II-based+cortex+thickness+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta.+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation.</a> Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516(2019).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li>
<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).</li>
<li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiprotein+printing+by+light-induced+molecular+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption.</a> Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAzioune%2C+A+%22Microtubules%3A+in+vivo+Methods+in+Cell+Biology%22">Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology</a>. , 133-146 (2010).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li>
<li>Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogel+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogel micropatterning.</a> Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell-generated+forces%3A+a+guide+to+the+available+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li>
<li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates%3A+A+guide+to+recent+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+forces+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying forces in cell biology.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).</li>
<li>Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+force+generation+by+spreading+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Dynamics of force generation by spreading platelets.</a> Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).</li>
<li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li>
<li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">Digital particle image velocimetry.</a> Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).</li>
<li>Lourenco, L., Krothapalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+accuracy+of+velocity+and+corticity+measurements+with+PIV%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV.</a> Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).</li>
<li>Adrian, R. J., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdrian%2C+RJ+%22Particle+Image+Velocimetry%22">Particle Image Velocimetry</a>. , Cambridge University Press. (2011).</li>
<li>Westerweel, J., Scarano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+outlier+detection+for+PIV+data%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">Universal outlier detection for PIV data.</a> Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+forces+at+focal+adhesions+from+elastic+substrate+data%3A+the+effect+of+localized+force+and+the+need+for+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization.</a> Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).</li>
<li>Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+traction+force+microscopy+method+with+automated+denoising+in+a+user-friendly+software+package%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+Physics+Communications%22%5BJournal%5D)">A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package.</a> Computer Physics Communications. 256, 107313(2020).</li>
<li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+of+hydrogel+biomaterials+with+controlled+mechanical+properties+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications.</a> Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).</li>
<li>Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+soft+hydrogel+microindentation%3A+Impact+of+various+indentation+parameters+on+the+measurement+of+Young%27s+modulus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus.</a> PLoS One. 14 (8), 0220281(2019).</li>
<li>Oria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+loading+explains+spatial+sensing+of+ligands+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force loading explains spatial sensing of ligands by cells.</a> Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics.+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).</li>
<li>Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+strains+induced+by+cells%3A+Computing+how+far+cells+can+feel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).</li>
<li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li>
<li>Galluzzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+methodology+and+AFMech+Suite+software+for+nanomechanics+on+heterogeneous+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Communications%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials.</a> Nat Communications. 9 (1), 3584(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym protokole opisujemy przygotowanie mikrowzorzystych hydrożeli PA zawierających kulki fluorescencyjne, które są wykorzystywane jako markery referencyjne do badań TFM. Nasze podejście opiera się na trzech krokach: 1) przygotowaniu dwuwarstwowych hydrożeli PA; 2) mikromodelowanie białek ECM i ich transfer na powierzchnię hydrożelu; 3) zastosowanie wzorzystego światła bliskiego UV dla TFM. Eksperymentalna konfiguracja do analizy trakcji komórek do podłoża wymaga użycia liniowych materiałów sprężystych o znanych wartościach sztywności do obliczenia sił związanych z przemieszczeniem koralików fluorescencyjnych26. Hydrożele PA są łatwe w przygotowaniu, sztywność można łatwo dostroić i są powszechnie stosowane do wykrywania sztywności i TFM18,28. Jednak, aby uzyskać powtarzalne czasy polimeryzacji i jednorodną polimeryzację całego hydrożelu, należy zwrócić uwagę na warunki i czas przechowywania odczynników, np. APS powinien być przechowywany w eksykatorze, aby uniknąć utraty swojej aktywności; TEMED należy chronić przed bezpośrednim działaniem światła. Zastosowanie utlenionego HEA pozwala na kowalencyjne wiązanie białek macierzy na powierzchni hydrożelu, co może być korzystne dla uzyskania pełnej i stabilnej warstwy białka. Utleniony roztwór HEA należy przygotowywać na świeżo za każdym razem, gdy wytwarzane są hydrożele PA. Dwuwarstwowy hydrożel PA ma trzy główne zalety: 1) zapewnia alternatywny sposób na powtarzalne uzyskanie jednorodnego rozmieszczenia kulek fiducial w pobliżu powierzchni hydrożelu, bez konieczności nadawania żelowi niezwykle cienkiej (tj. <20 μm). Kontrola nad grubością hydrożelu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych pomiarów za pomocą TFM. Gdy elastyczny substrat jest zbyt cienki, silnie przylegające komórki, takie jak fibroblasty, mogą wyczuwać i mechanicznie reagować na leżące pod nim sztywne szklane podłoże29,30. Gęste hydrożele sprawiają, że akwizycja obrazu w celu rekonstrukcji siły jest trudniejsza. Co więcej, wiele mikroskopów nie będzie miało wystarczającej ilości miejsca, aby je pomieścić, biorąc pod uwagę dodatkową grubość szklanego podłoża używanego do mocowania hydrożelu, chyba że stosowane są ultracienkie szkiełka mikroskopowe. 2) W dwuwarstwowym hydrożelu PA jednorodny rozkład kulek fiducial w pobliżu powierzchni hydrożelu PA uzyskuje się bez użycia wirówki, ale raczej poprzez prostą inkubację precyzyjnych ilości roztworów hydrożelu i kulek fluorescencyjnych. Wysoka gęstość ściegów jest istotną zaletą podczas wykonywania analizy PIV, ponieważ zwiększa rozdzielczość sił trakcyjnych i stosunek sygnału do szumu bez konieczności stosowania mikroskopii konfokalnej. 3) Zamknięcie kulek w cienkiej warstwie blisko granicy faz komórka-materiał umożliwia obrazowanie sił trakcyjnych za pomocą mikroskopów epifluorescencyjnych, a także mikroskopów konfokalnych. Przygotowując hydrożel, użytkownik powinien upewnić się, że mocno przylega on do dolnej szyby przed przystąpieniem do kolejnych kroków protokołu. Zalecamy przestrzeganie czasu inkubacji wskazanego dla polimeryzacji warstw hydrożelu, ponieważ usunięcie szkła z powierzchni bez uszkodzenia powierzchni hydrożelu może być trudne.
Najbardziej znanymi technikami pomiaru właściwości elastycznych są AFM, nanotwardość, próby rozciągania i reometria. Jednak nanotwardość indukuje bardzo duże naprężenia na materiałach, które mogą wpływać na określenie właściwości elastycznych. Z drugiej strony próby rozciągania i reometria są makroskopowymi technikami pomiarowymi, podczas gdy komórki oddziałują na siebie w skali mikroskopowej31,32. AFM umożliwia pomiary w mikroskali ze zredukowanymi odkształceniami w warunkach fizjologicznych. Wiarygodność pomiarów AFM może ulec pogorszeniu, jeśli brakuje szczegółów eksperymentalnych (np. siły wgłębienia i prędkości) lub rejestruje się niewystarczającą ilość danych27. Huth i in. opisują algorytm wyodrębniania modułów Younga z danych AFM, który kładzie nacisk na utrzymanie stałych szczegółów pomiaru27. Algorytm ten oferuje precyzyjne i wiarygodne określenie modułów Younga i został wykorzystany w naszych eksperymentach. Dodatkowo zmierzyliśmy wiele krzywych na próbkach wytworzonych w różnych dniach i uzyskaliśmy bardzo podobne wyniki (zmienność średnich wartości ok. 1-2 kPa). To pokazuje, że sztywność naszych żeli można wiarygodnie przewidzieć.
W tym protokole używamy modułu fotomodelingu do tworzenia mikrowzorów na szkle, które są następnie przenoszone na powierzchnie hydrożelowe. Mikrowzorzec pokazany w tym protokole opiera się na bezmaskowej litografii bliskiej UV opartej na DMD (λ = 375 nm)7. DMD składa się z dużej liczby mikroluster na chipie. Pojedynczy piksel odpowiada pojedynczemu mikrolustrze. Plik obrazu pikselowego wzoru z komputera jest rzutowany przez DMD i ogniskowany na powierzchni za pomocą soczewki obiektywu. Do mikromodelowania białek skupione światło laserowe służy do rozszczepiania odstraszających szczotek polimerowych za pomocą fotoinicjatora. Następnie odsłonięte obszary są wypełniane białkami ECM. Ta metoda ablacji bez maski oferuje dużą elastyczność w projektowaniu nowych wzorów, ponieważ nie polega na użyciu fotomaski. Zaprojektowanie i zastosowanie wzoru jest bardzo łatwe, ponieważ zajmuje tylko kilka minut przy użyciu darmowego oprogramowania, takiego jak Inkscape. Jednak liczba wzorów i próbek wytworzonych w krótkim czasie jest poważną wadą, ponieważ metoda ta może być stosowana tylko do modelowania tylko jednego podłoża za każdym razem. Moduł fotowzorcowy wykorzystuje źródło lasera na ciele stałym w bliskim UV, które emituje kilka miliwatów. Odsłonięta wiązka lasera jest niebezpieczna dla oczu i skóry. Odbite i rozproszone światło i promieniowanie mogą być również niebezpieczne. Do obsługi należy dołączyć instrukcję bezpieczeństwa od oficerów laserowych. Najważniejszym krokiem w protokole podczas korzystania z modułu fotomodelowania jest upewnienie się, że podczas mikromodelowania i ablacji laser jest odpowiednio skupiony na powierzchni. Stała dawka oświetlenia (intensywność pomnożona przez czas) światła UV podczas modelowania zależy od tego, w jaki sposób laser jest skupiony na powierzchni. Słaba intensywność na powierzchni spowodowana słabym skupieniem może spowodować niepowodzenie transferu ECM na powierzchnię hydrożelu, co spowoduje, że żadne komórki nie przyłączą się do hydrożelu.
W eksperymentach TFM, po wstępnym obrazowaniu przylegających komórek i markerów odniesienia, komórki są uwalniane z hydrożelu PA przez leczenie trypsyną, aby zarejestrować ich stan relaksu. Wadą w wykonywaniu tego kroku jest obchodzenie się z próbką na etapie mikroskopii. Bez komory perfuzyjnej otwieranie pokrywy naczynia, zasysanie pożywki, płukanie i pipetowanie roztworu trypsyny stanowią wyzwanie dla początkujących i doświadczonych użytkowników. W rzeczywistości procedury te są głównym źródłem dryfu w osiach xyz , co skutkuje utratą pozycji i ostrości. Nasz protokół lokalnego oświetlenia UV sprawia, że TFM jest bardziej dostępną techniką dla początkujących. Należy zauważyć, że użyliśmy dostępnego na rynku modułu fotowzorcowego bez maski opartego na mikroskopii, ale w zasadzie można było zastosować dowolny system oświetlenia UV-A, ostatecznie w połączeniu z maską w celu ochrony obszarów podłoży, w których siły trakcyjne komórek nie powinny być rejestrowane. Wystawienie komórek na działanie znacznej dawki światła widzialnego o niskiej długości fali (np. światła fioletowego, które wzbudza emisję DAPI) doprowadzi do wzrostu stresu oksydacyjnego, co może skutkować fototoksycznością i śmiercią komórki. Dlatego technika ta może być stosowana nawet w mikroskopie epifluorescencyjnym bez modułu lasera UV. Ponieważ jednak intensywność jest znacznie słabsza, w tym przypadku znacznie łatwiej będzie osiągnąć TFM za pomocą leczenia enzymatycznego.
Dzięki LUVI-TFM możliwe jest użycie tej samej próbki do kilku pomiarów ze względu na miejscowe oderwanie pojedynczych komórek lub małych grup komórek. Należy jednak zwrócić uwagę na wybór ogniw do odłączenia, aby uniknąć rejestrowania sił z sąsiednich komórek. W związku z tym w przypadku pomiarów pojedynczych komórek przy braku mikrowzorców należy unikać zatłoczonych regionów; W przypadku pomiarów na pojedynczych komórkach z mikrowzorami, wzory powinny być zaprojektowane w taki sposób, aby odległość między pojedynczymi strukturami była co najmniej dwukrotnie większa od średnicy obszaru z wzorem. Zalecamy również, aby nie używać komórek z sąsiednich wzorów w sekwencji, ale raczej pobierać próbki z odległych obszarów na podłożu. Nasz pomiar jest dobrze przeprowadzony na mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w funkcję kontroli ostrości i soczewkę 40 x NA = 0,9, gdzie odległość robocza soczewki jest wystarczająco duża, a szybki ruch od jednego dołka do drugiego jest wysoce przestrajalny. Ukierunkowane oddzielenie komórek do zastosowań TFM jest skuteczne w pomiarze siły komórkowej pojedynczej komórki lub całego klastra małych komórek (np. o średnicy do 300 μm). Korzystając z naszej konfiguracji, zaobserwowaliśmy zaokrąglanie i odwarstwianie komórek w przypadku obróbki UV pojedynczych komórek (ryc. 3A), podczas gdy odwarstwienie rzadko występowało w przypadku małych klastrów komórek. Może to prowadzić do niedoszacowania sił trakcyjnych komórek. W przypadku większych skupisk komórek zalecane jest odłączanie enzymatyczne, ponieważ użytkownicy powinni używać obiektywu pneumatycznego 20x do obrazowania całego klastra i potrzebna jest funkcja kontroli ostrości. Ponieważ głębia ostrości obiektywu pneumatycznego 20x jest znacznie większa, obsługa nie będzie tak krytyczna, jak w przypadku obiektywu o większym powiększeniu. Użytkownik powinien upewnić się, że ostrość jest prawidłowo ustawiona do ablacji komórek, ponieważ dawka oświetlenia zależy od skupienia lasera na powierzchni. Chociaż zdajemy sobie sprawę z możliwych ograniczeń w stosowaniu LUVI-TFM w kolektywach komórkowych ze względu na możliwe interakcje mechaniczne z sąsiednimi nieleczonymi komórkami, ten aspekt może okazać się przydatny w badaniach nad mechaniką celowanej ekstruzji komórek, np. z monowarstw nabłonka.
Podsumowując, dzięki naszemu podejściu TFM w połączeniu z indukowanym światłem uwalnianiem komórek z mikrowzorem, zapewniamy solidny i wysokoprzepustowy protokół do pomiaru sił adhezji komórek. Wszechstronność tej metody może być dalej wykorzystywana przy użyciu mikroskopii i konfiguracji obrazowania w celu poprawy rozdzielczości i czułości.

Podczas interakcji ze swoim środowiskiem zewnątrzkomórkowym, przylegające komórki wywierają siły, które są głównie pośredniczone przez ogniskowe zrosty oparte na integrynie, łączące macierz zewnątrzkomórkową (ECM) z cytoszkieletem aktyny. Adhezje ogniskowe to zespoły wielobiałkowe, które koncentrują się wokół wiązania integryn z białkami ECM, takimi jak fibronektyna i kolagen. Grupowanie integryn i wzrost zrostów ogniskowych ma kluczowe znaczenie nie tylko dla ustanowienia stabilnego mechanicznie połączenia, ale także dla rekrutacji innych ogniskowych białek adhezyjnych, w tym tych, które aktywują szlak RhoA do regulacji kurczliwości komórkowej1. Zależna od RhoA kurczliwość cytoszkieletu aktynowego pozwala komórkom rozprzestrzeniać się i migrować na leżącym pod spodem ECM, a także wyczuwać jego sztywność2. Rozkład sił trakcyjnych silnie zależy od obszaru rozprzestrzeniania się i kształtu komórek, z których oba zależą od właściwości matrycy, a zatem wpływają na organizację cytoszkieletu, ostatecznie tworząc zamkniętą pętlę sprzężenia zwrotnego między mechaniką macierzy a organizacją cytoszkieletu3,4.
Techniki mikrowzorcowania powierzchni pozwalają na zdefiniowaną kontrolę kształtu komórki poprzez tworzenie mikronowych obszarów prezentujących białka adhezyjne ECM; w zależności od wielkości tych regionów, pojedynczych komórek lub grup komórek, które przylegają do mikrowzorca5. Białka ECM mogą być wzorowane na podłożach szklanych za pomocą różnych metod, takich jak druk mikrokontaktowy, foto-patterning lub laserowe modelowanie6. Zastosowanie światła UV (λ = 185 lub 375 nm) w połączeniu ze strategiami przeciwporostowymi powierzchni zapewnia elastyczność w projektowaniu różnych kształtów i rozmiarów oraz immobilizacji wielu typów białek z dużą precyzją przy krawędziach powierzchni7,8. Obszary pokryte substancjami chemicznymi odstraszającymi białka, takimi jak glikol polietylenowy (PEG), są chronione za pomocą chromowej fotomaski lub bezmaskowego systemu litograficznego opartego na cyfrowym urządzeniu lustrzanym (DMD). Wzory w maskach pozwalają na ekspozycję na światło UV obszarów, które następnie zostaną wymodelowane za pomocą białek ECM. Modelowanie powierzchni hydrożelowych za pomocą białek ECM wymaga etapu transferu w celu usunięcia białek z powierzchni szkła i usieciowania ich z wzorami. Alternatywnie, wzór na miękkich materiałach można uzyskać, najpierw pokrywając fotomaskę białkiem odstraszającym, a następnie spalając niezamaskowane obszary za pomocą głębokiego oświetlenia UV. Ponieważ głębokie promieniowanie UV generuje ozon i sprawia, że powierzchnia jest reaktywna w celu wiązania białek, niezamaskowane regiony są powlekane białkami ECM, a na koniec żel jest polimeryzowany bezpośrednio na niezamaskowanych regionach9,10.
Wzorzyste hydrożele mogą być używane do wykonywania TFM, techniki, która mierzy siły komórkowe na granicy komórka-materiał11. W 2D-TFM wykorzystuje się płaską powierzchnię grubej folii polimerowej, w której osadzono koraliki znacznika w celu śledzenia deformacji12,13,14,15. Aby wyodrębnić wektory przemieszczenia, konieczne jest połączenie dwóch obrazów, jednego obrazu w stanie zdeformowanym i jednego obrazu odniesienia bez deformacji. Dwa obrazy są następnie odwzorowywane na siebie za pomocą przetwarzania obrazu. Przy dużej gęstości znaczników odbywa się to zwykle za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV), która jest dobrze znaną metodą rekonstrukcji przepływu hydrodynamicznego. Przy niskiej gęstości znaczników i w 3D-TFM odbywa się to zwykle za pomocą prędkości śledzenia cząstek (PTV), która obejmuje specyficzne cechy zestawu danych eksperymentalnych. Przykładem tańszej obliczeniowo alternatywy jest przepływ optyczny, taki jak algorytm Kanade-Lucas-Tomasi (KLT)16. W przypadku podłoży hydrożelowych kulki fluorescencyjne są zwykle zatapiane w dużej gęstości podczas polimeryzacji materiału, a obrazy są rejestrowane przed i po uwolnieniu komórek po oderwaniu enzymatycznym. Enzymatyczne odrywanie przylegających komórek, np. przez trypsynizację, prowadzi do jednoczesnego uwolnienia trakcji komórkowych ze wszystkich komórek na hydrożelach, co utrudnia uzyskanie szczegółowej analizy z dużej liczby komórek.
Tutaj prezentujemy protokół przygotowania mikrowzorcowych hydrożeli do kontroli kształtu i lokalizacji komórek oraz metodę efektywnego pomiaru sił trakcyjnych w sekwencji za pomocą UV do oddzielania pojedynczych komórek od podłoża. Do pomiarów siły pociągowej przedstawiamy technikę wytwarzania dwuwarstwowych hydrożeli PA, gdzie kulki fluorescencyjne zatopione są tylko w wierzchniej warstwie, co zwiększa ich gęstość i zmniejsza ich pionowe rozpiętość. Połączenie uwalniania komórkowych sił trakcyjnych za pośrednictwem promieniowania UV z mikrowzorcami umożliwia uzyskanie kontroli przestrzennej nad oderwaniem komórek (np. pojedynczych komórek bez wpływu na adhezję innych komórek w obszarze zainteresowania), pod warunkiem, że istnieje wystarczająca odległość między komórkami wzorzystymi. Trakcja komórkowa jest następnie rekonstruowana przy użyciu najbardziej wydajnej i niezawodnej metody dla 2D-TFM, a mianowicie cytometrii trakcyjnej z transformacją Fouriera (FTTC) z regularyzacją17,18.

<table><tbody><tr><td>Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu</td><td>#440159</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>#33209</td><td>Akrylamid Honeywell</td><td></td></tr><tr><td>40 %</td><td>#1610140</td><td>Bio-Rad</td><td>UWAGA : toksyczny, praca pod wyciągiem</td></tr><tr><td>Wspornik AFM</td><td>#CP-CONT-BSG-A-G</td><td>NanoAndMore</td><td>5 &mu; </td></tr><tr><td>m system AFM</td> z końcówką sferyczną<td>#NanoWizard3</td><td>JPK</td><td>Sprzężony z mikroskopem optycznym wyposażonym w 40-krotny obiektyw powietrzny i filtr GFP</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>#A3678</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akryloamid 2 %</td><td>#1610142</td><td>Bio-Rad</td><td>UWAGA : toksyczny, praca pod wyciągiem</td></tr><tr><td>Kamera sCMOS</td><td>#C11440-42U30</td><td>Hamamatsu</td><td></td></tr><tr><td>Kamera sCMOS</td><td>#ANDORZYLA4.2</td><td>Oxford Instrument</td><td></td></tr><tr><td>CellRox</td><td>#C10422</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowa komora</td><td></td> inkubatora <td>EMBLEM</td><td></td></tr><tr><td>Klej dentystyczny</td><td>#1300 100</td><td>Picodent</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>#41965</td><td>Mikroskop</td> epifluorescencyjny Thermo Fisher<td></td></tr><tr><td></td><td>#Eclipse Ti2E</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescencja mikroskop</td><td>#Axiovert200</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>#9065.3</td><td>Carl Roth</td><td></td></tr><tr><td>FBS Ameryka Południowa</td><td>#S181T</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen</td><td>#F13191</td><td>Invitrogen</td><td>Alexa488 sprzężony</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>#F1141</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne 200 nm</td><td>#F8805</td><td>Invitrogen</td><td>Karboksylowany ( 365/415)</td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne 200 nm</td><td>#F8848</td><td>Invitrogen</td><td>Karboksylowane (505/515)</td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne 200 nm</td><td>#F8810</td><td>Invitrogen</td><td>Karboksylowane (580/605)</td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne 200 nm</td><td>#F8807</td><td>Invitrogen</td><td>Karboksylowane (660/680)</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe szklane 15 mm okrągłe</td><td>#41001115</td><td>Szkiełko</td> nakrywkowe Assistent <td></td></tr><tr><td>Glass 24 mm okrągłe</td><td>#41001124</td><td>Obiektyw mikroskopu wspomagającego</td><td></td></tr><tr><td></td><td>#MRH08230</td><td>Nikon</td><td>20x air NA 0.45</td></tr><tr><td>Mysie fibroblasty embrionalne</td><td>#CRL-2991</td><td>ATCC</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>#MPEG-SVA-5000</td><td>Laysan Bio</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksyetyloakrylamid</td><td>#697931</td><td>Środek</td> do czyszczenia plazmowego Aldrich<td></td></tr><tr><td></td><td>#100-E</td><td>TePla</td><td></td></tr><tr><td>Żel PLPP</td><td>#PLPPgel</td><td>Alveole</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lizyna</td><td>#P4823</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Poly(L-lizyna)-graft-poli(glikol etylenowy)</td><td>#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)</td><td>SuSoS</td><td></td></tr><tr><td>Periodynian sodu(meta)</td><td>#S1878</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>TEMED#</td><td>17919</td><td>Moduł</td> do modelowania UV Thermo Scientific <td></td></tr><tr><td></td><td>#PRIMO</td> Środek czyszczący <td>Alveole</td><td></td></tr><tr><td>UVO</td><td>#342-220</td><td>Jelight</td><td></td></tr></tbody></table>

kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Mikroskopia siły pociągowej (TFM) jest główną metodą używaną w mechanobiologii do pomiaru sił komórkowych. Zwykle jest to używane do komórek przylegających do płaskich miękkich podłoży, które odkształcają się pod wpływem trakcji komórkowej (2D-TFM). TFM opiera się na zastosowaniu liniowych materiałów elastycznych, takich jak polidimetylosiloksan (PDMS) lub poliakryloamid (PA). W przypadku 2D-TFM na PA trudność w osiągnięciu wysokiej przepustowości wynika głównie z dużej zmienności kształtów komórek i trakcji, co wymaga standaryzacji. Przedstawiamy protokół szybkiego i wydajnego wytwarzania mikrowzorcowych hydrożeli PA do badań 2D-TFM. Mikrowzory są najpierw tworzone przez fotolitografię bez maski przy użyciu światła bliskiego UV, gdzie białka macierzy zewnątrzkomórkowej wiążą się tylko z obszarami mikrowzorów, podczas gdy reszta powierzchni pozostaje nieadhezyjna dla komórek. Mikrowzorzec białek macierzy zewnątrzkomórkowej wynika z obecności aktywnych grup aldehydowych, w wyniku czego powstają obszary adhezyjne o różnych kształtach, aby pomieścić pojedyncze komórki lub grupy komórek. Do pomiarów TFM używamy hydrożeli PA o różnej elastyczności poprzez zmianę ilości akrylamidu i bis-akrylamidu oraz śledzenie przemieszczenia osadzonych kulek fluorescencyjnych w celu rekonstrukcji pól trakcyjnych komórek za pomocą regularnej cytometrii trakcyjnej z transformacją Fouriera (FTTC).
Aby jeszcze bardziej osiągnąć precyzyjny zapis sił komórkowych, opisujemy użycie kontrolowanej dawki światła wzorcowego do uwalniania trakcji komórek w określonych regionach dla pojedynczych komórek lub grup komórek. Metodę tę nazywamy mikroskopią sił trakcyjnych z lokalnym oświetleniem UV (LUVI-TFM). W przypadku obróbki enzymatycznej wszystkie komórki są odłączane od próbki jednocześnie, podczas gdy w przypadku LUVI-TFM siły trakcyjne komórek w różnych regionach próbki mogą być rejestrowane sekwencyjnie. Wykazujemy możliwość zastosowania tego protokołu (i) do badania sił trakcyjnych komórek w funkcji kontrolowanej adhezji do podłoża oraz (ii) do uzyskania większej liczby obserwacji eksperymentalnych z tej samej próbki.

Hydrożele PA polimeryzowano na metakrylowanych szkiełkach przedmiotowych, które posiadają grupy reaktywne umożliwiające kowalencyjne wiązanie PA. W ten sposób zapobieżono odrywaniu się hydrożeli od podłoża podczas ich umieszczania w roztworze wodnym (Rysunek 1A-D). Aby uzyskać wysoką gęstość markerów referencyjnych w pobliżu powierzchni hydrożelu, opracowaliśmy metodę przygotowania dwuwarstwowego hydrożelu PA. Dolną warstwę, pozbawioną kuleczek fluorescencyjnych, polimeryzowano na metakrylowanym szkiełku. Następnie na górze dolnej warstwy polimeryzowano kolejną warstwę zawierającą kuleczki (Rysunek 1E-H), co wyeliminowało konieczność sedymentacji, często stosowanej w celu uzyskania rozkładu kuleczek w jednej płaszczyźnie ogniskowania i zwiększenia ich gęstości. Aby uzyskać kontrolę nad kształtem komórek podczas pomiarów TFM, wytworzono mikrowzorowane hydrożele PA via bezpośredni transfer mikrostruktur z wzorem z fibronektyny ze szkiełka przedmiotowego na uprzednio spolimeryzowany PA (Rysunek 1F-F'). Dodatek 1% niekonwencjonalnego sieciowania (utlenionego HEA) w roztworze górnej warstwy hydrożelu dostarcza grup aldehydowych, które wiążą się kowalencyjnie z grupami aminowymi fibronektyny.
Przygotowaliśmy hydrożele PA o grubości około 60 µm, w których w górnej warstwie, blisko powierzchni hydrożelu, uwięziono fluorescencyjne kuleczki. Ten rodzaj hydrożelu stanowi odpowiedni podłoże do obrazowania trakcji komórkowych za pomocą mikroskopów odwróconych i jest wystarczająco gruby (minimalna grubość do przeprowadzenia TFM została określona na 20-30 µm)18, aby zapobiec wpływowi szklanego podłoża. Lokalizację fluorescencyjnych kuleczek obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej (Ryc. 1I). Aby zwizualizować transfer białek na hydrożelu, wykorzystano białka ECM znakowane fluorescencyjnie, które obrazowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (Ryc. 1J). Przygotowano mikrowzory koliste z fibronektyny o średnicach 100 µm (lewa strona) i 50 µm (prawa strona), aby umożliwić adhezję grup komórek lub pojedynczych komórek, co przedstawiono na nałożonych na siebie obrazach w polu jasnym przylegających komórek, fluorescencyjnie znakowanych kuleczek referencyjnych oraz mikrowzorów z fibronektyny. Na innym preparacie odpowiedź adhezyjną pojedynczych komórek na mikrowzory z fibronektyny zweryfikowano za pomocą pośredniej mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu obrazowania lokalizacji białek adhezji ogniskowej, takich jak paxillin (Ryc. 1K).
Zarówno powlekanie białkami ECM, jak i sztywność hydrożelu są kluczowymi parametrami dla adhezji komórek26. Aby scharakteryzować właściwości mechaniczne naszych hydrożeli PA, przeprowadziliśmy eksperymenty nanoindentacji za pomocą AFM27, sprzężonego z mikroskopem epifluorescencyjnym. Przygotowano i przetestowano w naszej konfiguracji podłoża hydrożelowe o trzech różnych stopniach sztywności (Rysunek 2 i Tabela 1). Sferyczne końcówki AFM były cyklicznie zbliżane i oddalane od nieukształtowanych hydrożeli PA oraz od obszarów z mikrowzorami koniugatu fibrynogenu z Alexa488, przy jednoczesnym rejestrowaniu krzywych siła-odległość. Następnie ocena punktu kontaktu i zastosowanie modelu Hertza pozwoliły nam oszacować moduł Younga (E) każdej próbki. Mikrowzorowanie ECM nie zmieniło modułu Younga, który pozostał porównywalny do każdego z nieukształtowanych hydrożeli PA.
Aby zmierzyć siły trakcyjne wywierane przez komórki adherentne na podłoże, opracowaliśmy układ eksperymentalny do TFM opartego na referencji, przeprowadzanego na mikroskopie epifluorescencyjnym w polu szerokim, wyposażonym w moduł lasera bliskiego UV (UV-A 6000 mJ/mm2) w celu zniesienia trakcji komórkowych (Rycina 3A). Ponieważ oświetlenie wiązką lasera może być kontrolowane czasowo i przestrzennie, możliwe jest nie tylko selektywne naświetlanie pojedynczej komórki lub skupiska komórek wysoką dawką lasera, ale co ważniejsze, nie jest już wymagany inwazyjny etap pośredni usuwania komórek z całej próbki przy użyciu enzymu trawiennego, takiego jak trypsyna. Naświetlanie komórek tak wysoką dawką lasera indukuje zwiększony stres oksydacyjny prowadzący do śmierci komórek (Rycina 3B). Śmierć komórek skutkuje zniesieniem trakcji z podłoża, co jest wskazane przez przesunięcie kulek (zilustrowane na Rycynie 3A). Połączyliśmy naświetlanie UV-A z modułem wzorcowania światłem, aby selektywnie naświetlać obszary hydrożeli PA o rozmiarach mikrometrycznych (Rycina 3B-C). W ten sposób możliwe jest zniesienie trakcji w mikrowzorowanych skupiskach komórek (Rycina 3C,F) lub pojedynczych komórek (Rycina 3B). Co istotne, w naszych skalach czasowych właściwości mechaniczne wzorowanych hydrożeli ECM nie uległy znacznemu pogorszeniu pod wpływem ekspozycji na UV (Rycina 2C). Wzrost stresu oksydacyjnego przedstawiono na Rycynie 3D,E. Siły trakcyjne zrekonstruowano przy użyciu zregularizowanej FTTC z parametrem regularyzacji wybranym metodą Generalized Cross Validation (Rycina 3B,F). Zniesienie sił dla pojedynczych komórek nastąpiło w ciągu 15 min, a wynik LUVI-TFM jest porównywalny z TFM opartym na trypsynie (Rycina 3G-H).
<img alt="Schemat polimeryzacji żelu poliakrylamidowego metodą APS, TEMED; wzór adhezyjny, mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przygotowania podłoża z wzorowaną fibronektyną do TFM. (A) Roztwór na warstwę dolną jest pipetowany na powierzchnię metakrylowaną. (B) Mniejsze, czyste szkiełko nakrywką jest ostrożnie kładzione na kropli. (C) Czas żelowania wynosi 45 min. (D) Górne szkiełko nakrywkowe zostaje odczepione. Warstwa dolna jest gotowa. (E) Roztwór na warstwę górną jest pipetowany na hydrożel. (F) Wzorowane szkiełko nakrywkowe jest ostrożnie kładzione na kropli. (F') Mikrowzorowanie białek adhezyjnych na szkle jest wykonywane za pomocą bezmaskowej litografii bliskiego UV, a następnie przenoszone ze szkła na hydrożel PA. Wolne grupy aminowe białek adhezyjnych, np. fibronektyny, wiążą się kowalencyjnie z grupami aldehydowymi na powierzchni PA. (G) Czas żelowania wynosi 45 min. (H) Górne szkiełko nakrywkowe zostaje odczepione. Wzorowany hydrożel PA jest gotowy. (I) Reprezentacja 3D mikrografii konfokalnej xyz pokazująca wysoką gęstość kulek fiducjalnych w pobliżu powierzchni. (J) Mikrografia znakowanej fluorescencyjnie fibronektyny (magenta) na powierzchni PA z zatopionymi fluorescencyjnymi kuleczkami (zielony), nałożona na obraz komórek w świetle przechodzącym. (K) Obrazowanie mikroskopowe z pośrednią immunofluorescencją pojedynczej komórki przylegającej do kolistego mikrowzoru fibronektyny (100 µm). Jądro (niebieski), paksylina (czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu AFM, krzywa siła-wgłębienie, wyniki modułu Younga dla hydrożelu PAA, wzory ECM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Charakterystyka właściwości mechanicznych próbki za pomocą AFM. (A) Układ eksperymentalny nanoindentacji AFM. Do badania mikrowzorów ECM przed lub po obróbce UV, a także niezwzorowanych obszarów dwuwarstwowego PA (5% akryloamidu, 0,3% bis-akryloamidu), wykorzystuje się wspornik o kształcie sferycznym. (B) Reprezentatywna krzywa zależności siły od wgłębienia dla mikrowzoru ECM (czarna). Dopasowanie wg modelu Hertza (czerwone) jest używane do obliczenia modułu Younga (E) próbki. (C) Pomiary mechaniczne dla niezwzorowanych obszarów dwuwarstwowego PA (bez ECM), mikrowzoru ECM oraz mikrowzoru ECM po ekspozycji na promieniowanie UV-A. Słupki przedstawiają średnią ± S.E.M. (test Brown-Forsythe i ANOVA Welcha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Deformacja i regeneracja komórek indukowana promieniowaniem UV-A; wykresy naprężenie-odkształcenie, obrazy mikroskopowe, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63121/63121fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Lokalna iluminacja UV-A w TFM (LUVI-TFM) umożliwia lokalne pomiary sił trakcyjnych w szerokim polu widzenia. (A) Schemat lokalnego oświetlania UV-A w TFM. Komórki są poddawane działaniu wysokiej dawki lasera UV-A w celu uzyskania obrazu niedeformowanego (referencyjnego). (B) Obraz w polu jasnym pojedynczej komórki przed naświetlaniem laserem UV-A. Środek: Obraz w polu jasnym pojedynczej komórki po naświetlaniu laserem UV-A. Prawo: Siła trakcyjna pojedynczego MEF przylegającego do powleczonego fibronektyną hydrożelu PA (E = 5,74 kPa) naświetlanego za pomocą 50 µm średnica wiązki światła UV (czerwona przerywana linia). (C) Po lewej: Rejestracja sił trakcyjnych klastra zarodkowych fibroblastów mysich (MEF) przylegających do mikrowzorca fibronektyny (koło, 100 µm średnica). Klastry oświetlano za pomocą 200 µm średnica wiązki światła UV (czerwona przerywana linia). Po prawej: Rejestracja sił trakcyjnych klastra embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) przylegających do mikrowzorca fibronektyny (koło, 300 µm średnica). Gromadę oświetlono za pomocą 300 µm średnica wiązki światła UV (czerwona przerywana linia). Pasek skali = 200 µm. (D,E) Zwiększenie stresu oksydacyjnego w komórkach, objawiające się wzrostem intensywności sygnału Cy5 po zastosowaniu wysokiej dawki lasera UV-A, jest wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Stres oksydacyjny prowadzi do śmierci komórek. Pasek skali = 200 µm. (F) Lewo: Mapa ciepła naprężeń klastra embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) przylegających do mikrowzorowanej fibronektyny (koło, 100 µm średnica). Po prawej: mapa ciepła naprężeń dla klastra embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) przylegających do mikrowzorowanej fibronektyny (koło, 300 µm średnica). (G) komórki MEF przylegające do 100 µm mikrowzory fibronektyny powoli uwalniają naprężenia po ekspozycji na promieniowanie UV-A. Pełne uwolnienie następuje po 15 min (obraz referencyjny wykonano wówczas 15 min po ekspozycji).H) Porównanie z konwencjonalną TFM opartą na trypsynozie dla komórek MEF przylegających do 300 µm średnicy wzorowanej fibronektyny. Wynik naświetlania UV-A (6 000 mJ/mm2) po 15-minutowym czasie oczekiwania nie wykazuje istotnej różnicy w porównaniu do konwencjonalnej inkubacji z trypsyną (tj. 0,05% przez 20 min). Słupki przedstawiają średnią ± S.E.M. (dwustronny test t Studenta) t-test, ****P &lt; 0,0001, * P &lt; 0,05, ns P ≤0,5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63121/63121fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Akrylamid (%)</td>
			<td>Bis-akrylamid (%)</td>
			<td>Akrylamid z 40% roztworu stokowego (ml)</td>
			<td>Bis-akrylamid z 2% roztworu stokowego (ml)</td>
			<td>Woda (ml)</td>
			<td>Moduł Younga (kPa)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>8.5</td>
			<td>5,74 ± 0,53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.75</td>
			<td>8</td>
			<td>9,69 ± 0,68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.25</td>
			<td>11,33 ± 1,06</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Mieszaniny roztworów stokowych hydrożelu i wynikająca z nich elastyczność
Wszystkie dane zostały zdeponowane w otwartym repozytorium danych Towarzystwa Maxa Plancka (Edmond) i są dostępne pod następującym adresem: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie hydrożeli o mikrowzorze do badań mikroskopii sił trakcyjnych 2D. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw szkiełka nakrywkowego ze szkła metakrylanego i uformowanie na nim pierwszej warstwy hydrożelu poliakrylamidowego. Drugim krokiem jest stworzenie kolejnej warstwy hydrożelu zawierającej kulki fluorescencyjne do mikroskopii siły pociągowej.
Hydrożel jest nakładany na niego szkiełkiem nakrywkowym z mikrowzorem, co powoduje przeniesienie białek matrycy mikrowzoru na powierzchnię hydrożelu. Następnie hydrożel poliakrylamidowy pozostawia się do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Następnie ostrożnie usuwa się górną szkiełko nakrywkowe.
Obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym służy do wykazania obecności kulek i pomyślnego transferu białek macierzy zewnątrzkomórkowej o mikrowzorze. Metoda ta pomaga skutecznie i precyzyjnie mierzyć siły trakcyjne komórkowe poprzez wykorzystanie indukowanego światłem uwalniania komórek. Umożliwienie uzyskania większej liczby obserwacji doświadczalnych z tej samej próbki.
Procedurę zademonstruje Joel Christian, doktorant z mojego laboratorium. Dodaj 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody do zlewki. Następnie dodaj do roztworu 18,75 mililitra kwasu octowego, 18,75 mililitra metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu i 252,5 mililitra etanolu.
Gdy roztwór będzie gotowy, przenieś go do naczynia krystalizującego. Weź okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 24 milimetrów, wyczyść je precyzyjną chusteczką i włóż do specjalnie wykonanego stojaka teflonowego. Następnie zanurz go w roztworze i inkubuj przez 15 minut.
Weź stojak i opłucz go etanolem. Wysuszyć szkiełka pokrywy pod przepływem powietrza. Metakrylowane szkiełka nakrywkowe można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze pokojowej.
Weź 15-milimetrowe okrągłe szkiełko nakrywkowe i połóż je na szalce Petriego. Użyj pisaka diamentowego, aby zaznaczyć górną stronę szkiełka nakrywkowego. Następnie przystąp do czyszczenia za pomocą plazmy tlenowej.
Szkiełko nakrywkowe jest czyste przy ciśnieniu 0,4 milibara i mocy 200 watów przez dwie minuty. Odpipetować 100 mikrolitrów 0,01% roztworu poli-L-lizyny na powierzchnię szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe 10-milimolowym HEPES o pH 8,5.
Usuń nadmiar płynu, ale utrzymuj powierzchnię mokrą. Odpipetować 100 mikrolitrów po 50 miligramów na mililitr mPEG-SVA w 10-milimolowym roztworze HEPES o pH 8,5 na powierzchnię szkiełka nakrywkowego i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie spłucz szkiełka nakrywkowe 10-milimolowym filtrem HEPES o pH 8,5.
Następnie dodaj dwa mikrolitry żelu PLPP, a następnie 40 mikrolitrów etanolu na powierzchnię. Delikatnie przechyl szalkę Petriego, aby homogenizować roztwór. Odczekać pięć minut, aż roztwór zacznie polimeryzować.
Umieść szkiełko nakrywkowe w 35-milimetrowej szalce Petriego z dolnym otworem. Umieścić szalkę Petriego zawierającą szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu. Dostosuj ostrość na powierzchni szkła.
Załaduj i zablokuj wstępnie narysowany wzór. Rozpocznij wzór od dawki UV wynoszącej 30 milidżuli na milimetr kwadratowy. Po zakończeniu etapu tworzenia wzoru wyjmij szkiełko nakrywkowe i spłucz powierzchnię PBS.
Inkubować próbkę ze 100-mikrolitrową mieszaniną 25 mikrogramów na mililitr fibronektyny i 25 mikrogramów na mililitr fibrynogenu sprzężoną z Alexa 488 rozpuszczoną w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Aby przygotować podłoże hydrożelowe, należy rozpocząć od umieszczenia metakrylonego szkiełka nakrywkowego na szalce Petriego. Na początek przygotuj świeży utleniony roztwór HEA, dodając 9,55 mililitra podwójnie destylowanej wody do 15-mililitrowej probówki Falcon.
Następnie dodaj 0,5 mililitra HEA. Następnie dodaj 42 miligramy metapirogronianu sodu do roztworu. Umieść roztwór na shakerze na cztery godziny.
Następnie przygotować roztwór podstawowy, mieszając akrylamid, bis-akryloamid i wodę podwójnie destylowaną zgodnie z tabelą 1. Roztwór podstawowy można przechowywać do roku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotować roztwór roboczy dla dolnej warstwy, mieszając 99,3 mikrolitra roztworu podstawowego z 0,5 mikrolitra nadsiarczanu amonu 1% i 0,2 mikrolitra TEMED.
Pobrać 10 mikrolitrów z roztworu i pipetować kroplami na metakrylowane szkiełko nakrywkowe. Ostrożnie umieść 15-milimetrowe okrągłe szkiełko nakrywkowe na kropli i odczekaj 45 minut, aż się spolimeryzuje. Następnie odczep górną szkiełko nakrywkowe za pomocą skalpela.
Następnie przygotuj roztwór roboczy dla warstwy wierzchniej, mieszając 93,3 mikrolitra roztworu podstawowego z jednym mikrolitrem utlenionego HEA, pięcioma mikrolitrami kulek fluorescencyjnych, 0,5 mikrolitra nadsiarczanu amonu 1% i 0,2 mikrolitra TEMED. Weź pięć mikrolitrów z roztworu i odpipetuj go kroplami na dolną warstwę hydrożelu. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem na kropli.
Poczekaj 45 minut, aż się zpolimeryzuje. Delikatnie odczep szkiełko nakrywkowe skalpelem. I przyklej szkiełko nakrywkowe do spodu niestandardowej wywierconej płytki sześciodołkowej.
Dodaj PBS do studzienek. Aby zobaczyć komórki, odessaj PBS z płytki sześciodołkowej. W przypadku fibroblastów dodaj DMEM o wysokim poziomie glukozy zawierający L-glutaminę i uzupełnij go 10% FBS i 1% penicyliny oraz streptomycyny.
Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Włącz CO2 i ogrzewanie dla stolika mikroskopowego. Następnie włącz mikroskop i umieść płytkę studzienki na stoliku.
Ustaw wzór oświetlenia i zaznacz interesujące Cię komórki. Ponownie skup się na powierzchni hydrożelu. Uzyskaj obraz komórek w kanale jasnego pola.
Aby zrobić obraz koralików w stanie zdeformowanym, przełącz się na kanał Cy5. Następnie przełącz się na kanał laserowy i oświetlaj ogniwo zgodnie ze wzorem przez trzy minuty. Odpowiada to dawce 6 000 milidżuli na milimetr kwadratowy.
Następnie przełącz kanał i uzyskaj obraz koralików w stanie niezdeformowanym. Aby obliczyć siły uciągu, otwórz obrazy koralików fluorescencyjnych, które zostały już skorygowane o dryf boczny. Pełna analiza sił trakcyjnych jest szczegółowo opisana w załączonym skrypcie.
Aby zweryfikować selektywną adhezję komórek do mikrowzorcowych obszarów na powierzchni hydrożeli, próbki zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu wstępnie znakowanych białek matrycowych oraz za pomocą mikroskopii szerokokątnej w celu wizualizacji komórek. Właściwości mechaniczne hydrożeli poliakrylamidowych zmieniały się poprzez mieszanie różnych ilości akrylamidu i bis-akrylamidu. Sztywność hydrożelu oceniano za pomocą eksperymentów z nanotwardością za pomocą mikroskopii sił atomowych.
Pomiary siły pociągowej przeprowadzono po zastosowaniu przestrzennego, kontrolowanego czasowo oświetlenia wiązką lasera ultrafioletowego w celu selektywnego oświetlenia mikronowych obszarów hydrożelu poliakrylamidowego. Siły trakcyjne zostały zrekonstruowane przy użyciu regularyzowanego FTTC z parametrem regularyzacji wybranym przez uogólnioną walidację krzyżową. Nasze modułowe podejście oparte na mikroskopii sił trakcyjnych w połączeniu z indukowanym światłem uwalnianiem komórek mikrowzorcowych jest wszechstronne i może być dalej wykorzystywane z innymi mikroskopami i obrazowaniem w celu poprawy rozdzielczości i czułości.

control-cell-adhesion-using-hydrogel-patterning-techniques-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Tradycyjne techniki wytwarzania żeli poliakrylamidowych (PA) zawierających sondy fluorescencyjne polegają na umieszczaniu żelu pomiędzy przylegającą powierzchnią a szkiełkiem. Tutaj pokazujemy, że pokrycie tego szkiełka poli-D-lizyną (PDL) i sondami fluorescencyjnymi lokalizuje sondy z dokładnością do 1,6 μm od powierzchni żelu.

Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych

Mechaniczna sztywność w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w napędzaniu złośliwych zachowań poprzez zwiększanie aktywności inwadopodii i kurczliwości aktomiozyny. Za pomocą żeli poliakrylamidowych (PAA), testy inwadopodiów i siły trakcyjnej można wykorzystać do badania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek rakowych w odpowiedzi na sztywność matrycy.

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące implementacji litografii wielofotonowej do wytwarzania trójwymiarowych matryc fluorescencyjnych znaczników referencyjnych osadzonych w hydrożelach na bazie poli(glikolu etylenowego) do wykorzystania jako platformy mikroskopii siły pociągowej bez odniesień. Korzystając z tych instrukcji, pomiar odkształcenia materiału 3D i obliczanie trakcji komórkowych jest uproszczone, aby ułatwić pomiary siły pociągowej o wysokiej przepustowości.

Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.

Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Poznaj metodę mikroskopii sił trakcyjnych z wykorzystaniem hydrożeli poliakrylamidowych i litografii UV. Technika umożliwia precyzyjne pomiar sił komórkowych oraz wielokrotne pomiary z tej samej próbki.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Przeglądaj więcej filmów