Name: Odwrócona genetyka Odzyskiwanie zakaźnego mysiego norowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Poznaj dwie strategie odwróconej genetyki do odzyskiwania zakaźnego mysiego norowirusa w hodowli komórkowej. Te metody umożliwiają badanie replikacji wirusa i patogenezy norowirusów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały sfinansowane z grantu Wellcome Trust Senior Fellowship przyznanego Ianowi Goodfellowowi oraz grantu Marie Curie Intra European Fellowship (FP7 European Research Council) przyznanego Armandomu Ariasowi. Chcielibyśmy podziękować Io Hong Cheong, dr Rebecca Robey i dr Mike Skinner za udzielenie zgody na korzystanie z ich bioanalizatora Agilent oraz pomoc w analizie próbek RNA.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb.+Mortal.+Wkly.+Rep%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li>
<li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis%2C+Avon%2C+England%2C+2002-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li>
<li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li>
<li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5%27-end+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li>
<li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413(2011).</li>
<li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5%27+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li>
<li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase%3A+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li>
<li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs%3A+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li>
<li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
<li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li>
<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy przedstawiliśmy dwa różne podejścia genetyki odwrotnej, które umożliwiają odzyskanie zakaźnego MNV w hodowli komórkowej. Oba podejścia skutecznie omijają bezwzględny wymóg kowalencyjnego powiązania VPg z końcem 5' wirusowego genomu RNA poprzez generowanie kapszapkownych transkryptów MNV, które są następnie rozpoznawane przez rybosomy komórkowe. Transkrypcja in vitro z następującym po niej enzymatycznym kapszapkowniem jest bardziej wydajna w odzyskiwaniu zakaźnego MNV niż transkrypcja zakaźnych plazmidów w komórkach ekspresujących polimerazę RNA T7, w których transkrypty mogą być kapszapkownione przez enzymy kapszapkownie FPV. Miana wirusa odzyskane za pomocą tych systemów genetyki odwrotnej są zbliżone do tych uzyskanych poprzez transfekcję wirusowego RNA powiązanego z VPg, oczyszczonego z zakażonych hodowli komórkowych 17 (Rycina 5). Transfekcja kapszapkownych RNA MNV do podatnych komórek Raw264.7 daje miano wirusa jedynie o 1 log niższe niż w eksperymentach obejmujących transfekcję całkowitego RNA z zakażonych komórek zawierającego wirusowe RNA powiązane z VPg (Rycina 5). Fakt ten zachęca do dalszych badań w celu ustalenia, czy dodanie cząsteczki VPg do końca 5' transkryptów generowanych przez te systemy mogłoby doprowadzić do zwiększenia wydajności wirusa, co mogłoby ujawnić funkcjonalne aspekty zakaźności MNV w komórkach związane z VPg. Niemniej jednak uważamy ten system genetyki odwrotnej za wysoce wydajny i porównywalny z innymi obecnie stosowanymi systemami genetyki odwrotnej dla wirusów RNA, w których RNA transkrybowane in vitro pozwala na odzyskanie mian jedynie o 10–100 niższych niż w rzeczywistych infekcjach wirionami 19, 20.
Ogólnie rzecz biorąc, obecne metodologie stanowią znaczący krok naprzód w dziedzinie biologii molekularnej norowirusów i dostarczają narzędzi do badania funkcji białek oraz konserwowanych motywów RNA w genomach norowirusów. Podejścia te zostały już połączone z dostępnym obecnie modelem mysim, wykazując, że MNV odzyskany z infekcyjnego cDNA jest w stanie wywołać śmiertelną infekcję u &gt;80% myszy STAT1-/- w czasie krótszym niż 10 dni 4, 21. Wykorzystując ten system, odzyskano żywe mutanty mysiego norowirusa w obrębie białka kapsydu oraz odcinka polypirymidynowego uczestniczącego w wiązaniu różnych czynników gospodarza (PTB i PCBP), które wykazują nieco osłabiony fenotyp in vivo 21, 22. Ponadto niedawno wykazano, że wirusy pozbawione zdolności do efektywnej ekspresji białka VF1 z ORF4 namnażają się w hodowlach komórkowych, lecz ponownie wykazują zmniejszoną wirulencję u myszy w porównaniu z WT MNV 8. Badania te zachęcają do projektowania atenuowanych wersji ludzkich norowirusów w oparciu o studia nad MNV, które mogłyby zostać przebadane jako potencjalne kandydaty na szczepionki.

<table><tbody><tr><td>Roztwór do wytrącania chlorkiem litu</td><td>Ambion</td><td>AM9480</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do przechowywania RNA</td><td>Ambion</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>System cappingu ScriptCap m7G</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>SCCE0610</td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji Neon</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do systemu transfekcji Neon</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Agilent RNA 600 Nano</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr></tbody></table>

odzyskiwanie zakaźnego norowirusa mysiego za pomocą genetyki odwrotnej

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Ludzkie norowirusy odpowiadają za większość przypadków ludzkiego zapalenia żołądka i jelit (GE) na całym świecie i stanowią nawracający problem w środowiskach, w których nie można uniknąć bliskiego kontaktu z człowieka na człowieka 1, 2. W ciągu ostatnich kilku lat zgłaszano wzrost częstotliwości występowania ognisk zakażeń w szpitalach, co powoduje znaczne zakłócenia w ich zdolnościach operacyjnych, a także duże straty ekonomiczne. Identyfikacja nowych metod przeciwwirusowych była ograniczona z powodu niezdolności ludzkich norowirusów do przeprowadzenia produktywnej infekcji w hodowlach komórkowych 3. Niedawna izolacja mysiego norowirusa (MNV), ściśle spokrewnionego z ludzkim norowirusem 4, ale mogącego być propagowanym w komórkach 5, otworzyła nowe możliwości badania tych patogenów 6, 7.
Replikacja MNV prowadzi do syntezy nowych cząsteczek genomowego i subgenomowego RNA o polarności dodatniej, przy czym te drugie odpowiadają ostatniej jednej trzeciej genomu wirusa (Rysunek 1). MNV zawiera cztery różne otwarte ramki odczytu (ORF), z których ORF1 zajmuje większość genomu i koduje siedem białek niestrukturalnych (NS1-7) uwalnianych z prekursora poliproteiny. ORF2 i ORF3 znajdują się w obrębie regionu subgenomowego RNA i kodują białka kapsydu (odpowiednio VP1 i VP2) (Rysunek 1). Niedawno zidentyfikowano, że dodatkowa ramka ORF4, nakładająca się na ORF2, ale znajdująca się w innej ramce odczytu, jest funkcjonalna i koduje zlokalizowany w mitochondriach czynnik wirulencji (VF1) 8.
Replikacja wirusów RNA o dodatniej polarności, w tym norowirusów, zachodzi w cytoplazmie, co prowadzi do syntezy nowych, niekapsylowanych genomów RNA. Aby promować translację wirusową, wirusy wykorzystują różne strategie mające na celu rekrutację komórkowego aparatu syntezy białek 9-11. Co ciekawe, translacja norowirusa jest napędzana przez wielofunkcyjne białko-starter VPg, które jest kowalencyjnie powiązane z końcem 5' zarówno genomowych, jak i subgenomowych RNA 12-14. Ten złożony mechanizm translacji prawdopodobnie stanowi główny czynnik ograniczający wydajność odzyskiwania wirusa za pomocą konwencjonalnych metod genetyki odwrotnej.
W niniejszej pracy opisujemy dwie różne strategie oparte na generowaniu transkryptów norowirusa mysiego-1 (w dalszej części tekstu określanego jako MNV) z czapeczką na końcu 5'. Jedna z metod obejmuje syntezę in vitro oraz czapeczkowanie wirusowego RNA, natomiast drugie podejście polega na transkrypcji cDNA MNV w komórkach wykazujących ekspresję polimerazy RNA T7. Dostępność tych systemów genetyki odwrotnej do badania MNV oraz modelu małych zwierząt zapewniła bezprecedensową możliwość analizy roli sekwencji wirusowych w replikacji i patogenezie 15-17.

Norowirusy są główną przyczyną gastroenteritis, jednak techniki molekularne służące do ich charakterystyki są wciąż stosunkowo nowe. W niniejszej pracy przedstawiamy dwa różne podejścia genetyki odwrotnej w celu efektywnego odzyskiwania norowirusa mysiego (MNV), jedynego przedstawiciela tego rodzaju, który może być propagowany w hodowlach komórkowych.

Odzyskiwanie zakaźnego norowirusa mysiego za pomocą genetyki odwrotnej

Ludzkie norowirusy odpowiadają za większość przypadków ludzkiego zapalenia żołądkowo-jelitowego (GE) na całym świecie i stanowią powracający problem w środowiskach, w których występuje bliski...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest odzyskanie zakaźnego neurowirusa oka myszy przy użyciu dwóch systemów genetyki odwrotnej. Witam, nazywam się Armando Arias i reprezentuję sekcję wirusologii w Imperial College London. W naszej grupie zajmujemy się analizą molekularnych mechanizmów leżących u podstaw replikacji neurowirusa.Norowirusy są główną przyczyną nieżytów żołądkowo-jelitowych. Na całym świecie techniki molekularne służące do ich charakterystyki są wciąż stosunkowo nowe. Identyfikacja nowych podejść przeciwwirusowych oraz zrozumienie cyklu życiowego norowirusów były ograniczone z powodu ich niezdolności do przeprowadzenia produktywnej infekcji w hodowlach komórkowych.Niedawna izolacja wirusów zdolnych do infekowania myszy i propagacji w hodowlach komórkowych, a konkretnie neurowirusów, otworzyła nowe możliwości badania tych istotnych patogenów. W niniejszym raporcie zaprezentujemy dwie strategie umożliwiające generowanie genetycznie zdefiniowanych izolatów neurowirusów w hodowli komórkowej. Obie strategie opierają się na generowaniu transkryptów wirusowych z cappingiem na końcu 5'.Pierwsza metoda obejmuje syntezę i nakładanie czapeczki wirusowego RNA in vitro przed transfekcją do komórek. Druga metoda polega na transkrypcji cDNA neuronorowirusa wewnątrz komórek ekspresyjących polimerazę RNA T7. Przegląd procedury. Protokół odzyskiwania neuronorowirusa z RNA transkrypcyjnego z nakładką (capped RNA) rozpoczyna się od linearyzacji.Plazmid zawierający MV CD NA dla mmv one. Procedurę tę przeprowadza się przy użyciu enzymu restrykcyjnego NHE one. Następnie DNA jest transkrybowane in vitro na RNA z wykorzystaniem polimerazy RNA T seven.Następnie M-M-V-R-N-A poddaje się cappingowi in vitro i transfekuje do komórek w celu odzyskania zakaźnego MMV. Bezpośrednie odzyskanie zakaźnego MNV z wykorzystaniem wirusa FAL PX wykazującego polimerazę RNA T7 w celu odzyskania MMV z bezpośrednio transfektowanych klonów cDNA polega na uprzednim zainfekowaniu komórek rekombinowanym wirusem FAL PX wykazującym polimerazę RNA T7. Infekcja FAL PX doprowadzi do ekspresji polimerazy RNA T7, a także wirusowych enzymów cappingowych RNA, które mogą przeprowadzić capping części syntetyzowanego RNA. Następnie M-M-V-C-D-N-A jest transfektowane do zainfekowanych FPV komórek za pomocą transfekcji z użyciem lipidów. Polimeraza RNA T7 produkuje wówczas M-M-V-R-N-A, z którego część może zostać poddana cappingowi przez mechanizm cappingowy F-P-V-R-N-A.Sekwencja rybozymu gwarantuje, że każdy transkrypty RNA posiada zdefiniowany koniec 3'. Capped transkrypty MMV zostaną następnie przetłumaczone na białko przed replikacją, co doprowadzi do produkcji nowych cząstek zakaźnych. Protokół transkrypcji i cappingu RNA w celu odzyskania zakaźnego MMV oraz synteza zakaźnych capped transkryptów MMV.W pierwszej kolejności wymieszaj następujące odczynniki: bufor do transkrypcji, nukleotydy, wodę oraz zlinearyzowany plazmid zawierający M-M-V-C-D-N-A. Następnie dodaj do mieszaniny reakcyjnej RNA oraz polimerazę RNA T7. Do tego celu dostępnych jest wiele zestawów komercyjnych, które zapewniają powtarzalną metodę syntezy RNA.Reakcję transkrypcji przeprowadza się poprzez inkubację mieszaniny w temperaturze 37 °C przez co najmniej dwie godziny. Małą próbkę tej reakcji transkrypcji należy przeanalizować na niedenaturującym żelu agarozowym. Przed użyciem należy najpierw oczyścić sprzęt do elektroforezy detergentem, a następnie opłukać go wodą wolną od RNaz.Należy upewnić się, że żele agarozowe są przygotowywane przy użyciu odczynników wolnych od RNA. M-V-R-N-A będzie wędrować na poziomie około trzech kilobaz w niedenaturującym żelu agarozowym. Ponadto, w celu szybkiej analizy integralności RNA można zastosować bioanalizator Agilent.Następnie należy oczyścić RNA, aby usunąć niewbudowane nukleotydy. Dostępnych jest wiele metod, jednak w niniejszym protokole oczyszczamy RNA poprzez wytrącanie chlorkiem litu jako kosztowo efektywną alternatywę; RNA jest pelletowane przez wirowanie z maksymalną prędkością przez 15 minut. Usuń supernatant, uważając, aby nie naruszyć półprzezroczystego pelletu, a następnie przemyj go 70% etanolem.Resuspender transkrypcyjny produkt MMV w roztworze do przechowywania RNA i upewnić się, że jest on całkowicie rozpuszczony. Podgrzanie RNA do 65 °C może ułatwić ten proces w późniejszym etapie. Ilość RNA należy oznaczyć spektrometrycznie.Przeanalizuj integralność RNA, nakładając niewielką porcję na 1% nie denomaturujący żel agarozowy. Jak widać, integralność RNA po wytrąceniu chlorkiem litu powinna pozostać bez zmian, aby zwiększyć wydajność cappingu. Podgrzej porcję RNA w temperaturze 65 °C przez 10 minut.Natychmiast umieść probówkę na lodzie. Aby uniknąć degradacji lub refoldingowania, przygotuj mieszaninę do reakcji cappingu zgodnie z zaleceniami producenta. Zazwyczaj dodajemy około 60 µg M-N-V-R-N-A do końcowej objętości reakcji wynoszącej 100 µL.Choć reakcję można przeprowadzić w mniejszej skali, należy dokładnie wymieszać zawiesinę i inkubować w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, a następnie oczyścić RNA poprzez wytrącanie chlorkiem litu, jak opisano wcześniej. Przed przystąpieniem do transfekcji niezbędne jest ponowne sprawdzenie integralności RNA. Protokół etapowy odzyskiwania MMV poprzez elektroporację RNA do surowych komórek. Resus.Zawiesić kolbę z surowymi komórkami w DMEM. Upewnić się, że uzyskano jednorodne zawiesiny pojedynczych komórek. Określić stężenie żywych komórek za pomocą hemocytometru, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego.Odwiruj komórki, tworząc pellet, a następnie ostrożnie je resuspenderuj. Zawieś je w świeżej pożywce bez antybiotyków w aliquotach po 8 milionów komórek na jedną transfekcję i odwiruj je w mikrocentry fudze. Usuń pożywkę i przemyj komórki w 500 µL PBS, ponownie odwiruj i usuń PBS, a następnie resuspenderuj komórki w 130 µL roztworu o temperaturze pokojowej.Roztwór do resuspensji Neon. Dodać odpowiednią ilość zakrytego RNA, zazwyczaj 1,3 µg na 130 µl komórek, co odpowiada 1 µg RNA na 6 milionów komórek. Komórki wymieszane z transkryptami zbiera się w 100 µl końcówce do transfekcji Neon.Należy zachować szczególną ostrożność, aby na tym etapie nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Następnie przeprowadzić elektroporację, stosując pojedynczy impuls o napięciu 1700 V przez 25 ms. Przenieść komórki do probówki z końcówką typu eppendorf zawierającej 1 ml pożywki bez antybiotyków.Rozdziel komórki z probówki do osobnych studni zawierających pożywkę DMEM bez antybiotyków z dodatkiem 10% FCS i inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez 24 do 72 godzin. Odzyskiwanie MMV poprzez lipofekcję RNA do komórek BSR T7 jak wcześniej. Transkrypty CAP MMV są generowane przez linearyzację plazmidu MMV cDNA, transkrypcję in vitro za pomocą polimerazy T7 oraz capping in vitro; następnie transkrypty są wprowadzane do komórek BSR T7 poprzez lipofekcję. Potraktuj trypsyną monowarstwę komórek BSR T7 i zasiaj 7,5 × 10⁵ żywych komórek do płytek sześciodołkowych.Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez noc. Usunąć pożywkę z komórek i zastąpić ją 3 ml świeżej pożywki pozbawionej antybiotyków. Aby zapewnić maksymalną wydajność transfekcji, wymieszać od 1 do 2 µg zmodyfikowanego M-M-V-R-N-A ze 100 µl optymalizatora.Wymieszaj również 4 µL lipectomy 2000 ze 100 µL optimum. Połącz próbki zawierające RNA i lipectomy, a następnie dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 15 razy. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 20 minut.Następnie dodaj kompleksy do transfekcji zawierające czapeczkowane transkrypty MMV do monowarstwy komórek, aplikując je kroplami. Potrząśnij płytką w kierunku prostopadłym. Inkubuj komórki przez okres od 24 do 72 godzin.Protokół bezpośredniej regeneracji zakaźnego MMV z CDNA w komórkach wykazujących ekspresję polimerazy RNA T7, zgodnie z wcześniejszym opisem. Protokół ten opiera się na ekspresji polimerazy RNA T7 oraz wirusowych enzymów cappingowych oxx w komórkach zainfekowanych za pomocą wirusa oxx. Następnie do komórek transfekowane jest M-N-V-C-D-N-A pod kontrolą promotora T7.W pierwszej kolejności usunąć pożywkę do hodowli komórkowej, a następnie dodać do każdej studzienki 700 µL wirusa F pox rozcieńczonego w pożywce bez antybiotyków. Zazwyczaj stosuje się wielokrotność infekcji (MOI) na poziomie około 0,5 PFU na komórkę; ustawić płytki prostopadle i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie dodać 2 mL pożywki bez antybiotyków i inkubować komórki przez kolejną godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić ekspresję polimerazy RNA T7 MNV CG NNA transfection, usunąć pożywkę z zainfekowanych komórek i dodać 3 mL świeżej pożywki bez antybiotyków.Przygotować mieszaninę jednego mikrograma M-M-V-C-D-N-A oraz lipektomii zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół. Przechowywać probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie ponownie wymieszać i dodać kroplami do monowarstwy komórek.Delikatnie potrząśnij płytką w kierunkach prostopadłych. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez 24 do 72 godzin, aby potwierdzić odzyskanie zakaźnego MMV za pomocą różnych metod genetyki odwrotnej przedstawionych w tym materiale wideo; uwolnij zakaźne wiriony z komórek poprzez wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie. Określ miano w każdej próbce zgodnie ze standardowymi procedurami, takimi jak TCID 50 lub metoda płytkowa, aby uzyskać reprezentatywne wyniki.Dostępność tych systemów genetyki odwrotnej do badania neurowirusa zapewniła bezprecedensową możliwość analizy roli sekwencji wirusowych w replikacji i patogenezie neurowirusa u naturalnego gospodarza. Obie opisane w tym filmie metody genetyki odwrotnej są wysoce efektywne w odzyskiwaniu zakaźnego neurowirusa w hodowlach komórkowych. Jak pokazano na tej rycinie.W przypadku zakaźnego MMV, po transfekcji kapsylowanych transkryptów MMV do komórek surowych lub komórek BSRT7, odzyskano miana przekraczające 10⁵ TCID₅₀/ml. Transfekcja MMV-cDNA do komórek BSRT7 uprzednio zainfekowanych przy pomocy wirusa fowl pox skutkuje mianami wirusa przekraczającymi 10⁴ TCID₅₀/ml. Miana wirusa uzyskane za pomocą podejść genetyki odwrotnej są podobne do mian odzyskanych w transfekcjach RNA wyizolowanego z zakaźnego wirusa, co podkreśla wysoką wydajność opisanych tutaj systemów genetyki odwrotnej.

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Odzyskanie zakaźnego norovirusa mysiego przy użyciu odwrotnej genetyki

Opisano jednokrokowy test RT-PCR do detekcji i identyfikacji genogrup izolatów norowirusa z kałków dziecięcych, wykorzystujący primery i sondy TaqMan specyficzne dla regionu złącza otwartej ramki odczytu 1 (ORF1)-ORF2, który jest najbardziej konserwatywnym regionem genomu norowirusa. Szczegółowo przedstawiono niekomercyjną, kosztowo efektywną metodę ekstrakcji RNA.

Wykrywanie i genogrupowanie norowirusów z kału dzieci za pomocą jednoetapowej reakcji RT-PCR TaqMan

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowego oznaczania cząstek zakaźnych norowirusa mysiego (MNV), który jest jedynym norowirusem efektywnie replikującym się w hodowlach komórkowych. Metoda płytkowa wykorzystuje tropizm MNV do makrofagów mysich i może zostać dostosowana do analizy próbek biologicznych lub środowiskowych zawierających MNV.

Test plackowy dla mysiego norowirusa

Źródło: Leuthold, M. M., et al. Wytwarzanie ludzkich domen wystających norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej. J. Vis. Exp. (2016).Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanej domeny P ludzkiego norowirusa P za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, podkreślając oddzielenie białka docelowego od zanieczyszczeń o wyższej i niższej masie cząsteczkowej w oparciu o różnicową dostępność porów. Proces jest monitorowany za pomocą absorbancji UV i potwierdzany za pomocą analizy...

Oczyszczanie rekombinowanych białek domeny P pochodzących z bakterii ludzkiego norowirusa

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Ratowanie rekombinowanych arenawirusów ze sklonowanych cDNA, podejście określane jako genetyka odwrotna, pozwala badaczom badać rolę określonych produktów genowych wirusa, a także wkład ich różnych specyficznych domen i reszt, w wielu różnych aspektach biologii arenawirusa. Podobnie, techniki genetyki odwrotnej w zatwierdzonych przez FDA liniach komórkowych (Vero) do opracowywania szczepionek zapewniają nowe możliwości generowania skutecznych i bezpiecznych szczepionek do zwalczania ludzkich...

Generowanie rekombinowanego arenawirusa do opracowania szczepionki w komórkach Vero zatwierdzonych przez FDA

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV) był intensywnie badany w ciągu ostatnich kilku lat w celu opracowania nowych wektorów do szczepień i terapii, między innymi. Badania te były możliwe dzięki technikom ratowania rekombinowanego wirusa z cDNA, takim jak te, które tutaj opisujemy.

Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Generowanie rekombinowanych rotawirusów z plazmidowego DNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania replikacji i patogenezy rotawirusów oraz rozwoju wektorów ekspresyjnych rotawirusów i szczepionek. W niniejszym artykule opisano uproszczone podejście genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych rotawirusów, w tym szczepów eksprymujących fluorescencyjne białka reporterowe.

Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie wiązania eukariotycznego patogenu ludzkiego norowirusa z bakteriami. Po wykonaniu wstępnego testu przyłączenia wirusa-bakterii, cytometria przepływowa jest stosowana do wykrywania bakterii związanych z wirusem w populacji.

Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj dwie strategie odwróconej genetyki do odzyskiwania zakaźnego mysiego norowirusa w hodowli komórkowej. Te metody umożliwiają badanie replikacji wirusa i patogenezy norowirusów.

Odzyskiwanie zakaźnego norowirusa mysiego za pomocą genetyki odwrotnej

Przeglądaj więcej filmów