Odwrócona genetyka Odzyskiwanie zakaźnego mysiego norowirusa

Ogólnym celem tej procedury jest odzyskanie zakaźnego neurowirusa oka przy użyciu dwóch odwróconych systemów genetycznych. Cześć, nazywam się Armando Arias i pracuję na wydziale wirusologii w Imperial College of London. W naszej grupie jesteśmy zainteresowani analizą mechanizmów molekularnych leżących u podstaw replikacji neurowirusów.

Norowirusy są główną przyczyną zapalenia żołądka i jelit. Ogólnoświatowe techniki molekularne do ich charakteryzacji są wciąż stosunkowo nowe. Identyfikacja podejść neowirusowych i wgląd w cykl życiowy neurowirusów były ograniczone ze względu na ich niezdolność do zakończenia produktywnej infekcji w hodowli komórkowej.

Niedawna izolacja leku przeciwwirusowego zdolnego do infekowania myszy i rozmnażania hodowli komórkowej, a mianowicie neurowirusa lustrzanego, otworzyła nowe możliwości badania tych ważnych patogenów. W tym raporcie przedstawimy dwie strategie, które pozwalają na generowanie genetycznie zdefiniowanych izolatów neuroneurowirusa w hodowli komórkowej. Obie strategie opierają się na generowaniu transkryptów wirusowych ograniczonych na pięciu pierwszych końcach.

Pierwsza z nich polega na syntezie w czapeczce wirusowego RNA in vitro przed transfekcją do komórek. Drugie podejście polega na transkrypcji fiolki nerwowej MI, CDNA wewnątrz komórek eksprymujących polimerazę T siedem RNA Przegląd procedury. Protokół odzyskiwania neuronorowirusa z ograniczonych transkryptów RNA jest inicjowany przez liniowe narastanie.

Plazmid zawierający MV CD NA dla mmv jeden. Odbywa się to za pomocą enzymu restrykcyjnego NHE one. DNA jest następnie transkrybowane in vitro na RNA przy użyciu polimerazy T seven RNA.

Następnie M-M-V-R-N-A jest zamykany in vitro i jest transfekowany do komórek, aby umożliwić odzyskanie zakaźnego MMV bezpośrednie odzyskanie zakaźnego MNV przy użyciu wirusa FAL PX eksprymującego polimerazę T 7RNA w celu odzyskania MMV z bezpośrednio transfekowanych klonów cDNA, komórki są najpierw zakażone rekombinowanym wirusem FAL PX wykazującym ekspresję polimerazy T siedem RNA Zakażenie FAL PX spowoduje ekspresję polimerazy T siedem RNA, a także wirusowego RNA enzymy ograniczające, które mogą zamykać część zsyntetyzowanego RNA. M-M-V-C-D-N-A jest następnie transfekowany do komórek zakażonych FPV za pośrednictwem transfekcji za pośrednictwem lipidów. Polimeraza T seven RNA wytwarza następnie M-M-V-R-N-A, z których część może być następnie zamknięta przez maszynerię zamykającą F-P-V-R-N-A.

Sekwencja zymu rybo-zymowego gwarantuje, że każdy transkrypt RNA zawiera zdefiniowane trzy pierwsze końce. Zamknięte transkrypty MMV zostaną następnie przetłumaczone na białko przed replikacją, co doprowadzi do wytworzenia nowych cząstek zakaźnych. Protokół transkrypcji i cappingu RNA w celu odzyskania zakaźnej syntezy MMV zakaźnych transkryptów MMV z czapeczką.

Po pierwsze, wymieszaj następujące odczynniki, transkrypcję, nukleotydy buforowe, wodę i zlinearyzowany plazmid zawierający M-M-V-C-D-N-A. Następnie dodaj RNA i polimerazę T siedem RNA do mieszaniny reakcyjnej. W tym celu dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów, które zapewniają powtarzalną metodę syntezy RNA.

Reakcję transkrypcji przeprowadza się przez inkubację mieszaniny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Przeanalizuj niewielką zawartość tej reakcji transkrypcji na niedenaturującym żelu agrosowym. Najpierw wyczyść sprzęt żelowy detergentem i umyj go wodą wolną od RNA przed użyciem.

Upewnij się, że żele agros przygotowane przy użyciu odczynników wolnych od RNA. M-V-R-N-A będzie działać na około trzech zabójczych zasadach na niedenaturującym żelu z róży rolniczej. Ponadto bioanalizator Agilent może być używany do zapewnienia szybkiej metody analizy integralności RNA.

RNA należy następnie oczyścić w celu usunięcia nieinkorporowanych nukleotydów. Dostępnych jest wiele metod, jednak w tym protokole oczyszczamy RNA przez wytrącanie chlorku litu jako opłacalną alternatywę granulek RNA przez wirowanie z maksymalną prędkością przez 15 minut. Usuń sklarowany osad, uważając, aby nie naruszyć półprzezroczystego osadu i umyj go 70% etanolem.

Ponownie zawiesić transkrypt MMV w roztworze do przechowywania RNA i upewnić się, że jest całkowicie rozpuszczony. Podgrzanie RNA do 65 stopni C może później wspomóc ten proces. Określ ilościowo RNA za pomocą spektrometrii.

Przeanalizuj integralność RNA, uruchamiając małą porcję na 1% niedenaturującym żelu agrosowym. Jak widać, integralność RNA po wytrąceniu chlorku litu powinna pozostać taka sama, aby poprawić skuteczność zamykania. Podgrzewać podwielokrotność RNA w temperaturze 65 stopni przez 10 minut.

Umieść probówkę natychmiast na lodzie. Aby uniknąć degradacji lub ponownego fałdowania, należy przygotować mieszaninę reakcyjną zamykania zgodnie z sugestią producenta. Zazwyczaj dodajemy około 60 mikrogramów M-N-V-R-N-A do końcowej reakcji 100 mikrolitrów.

Chociaż reakcję można zmniejszyć, dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 stopni przez godzinę, oczyścić RNA przez wytrącanie chlorku litu, jak poprzednio. Konieczne jest ponowne sprawdzenie integralności RNA przed przystąpieniem do transfekcji. Protokół etapowy odzyskiwania MMV przez elektroporację RNA do surowych komórek. Resus.

Zawiesić kolbę z surowymi komórkami w DMEM. Upewnij się, że tworzysz zawiesinę jednokomórkową. Określ stężenie żywotnych komórek w hemocytometrze za pomocą wykluczenia błękitu trianowego.

Zdepluj komórki i ostrożnie zregeneruj. Zawieś je w świeżych, wolnych od antybiotyków pożywkach o podwielokrotnościach 8 milionów komórek na transfekcję i umieść je w mikro fuge. Usuń pożywkę i umyj komórki w 500 mikrolitrach wirówki PBS ponownie, a następnie usuń PBS, ponownie zawieś komórki w 130 mikrolitrach temperatury pokojowej.

Roztwór zawiesiny neonowej resus. Dodaj odpowiednią ilość zakrytego RNA, zwykle 1,3 mikrograma na 130 mikrolitrów komórek, co odpowiada jednemu mikrogramowi RNA na 6 milionów komórek. Komórki zmieszane z transkryptami są zbierane w 100-mikrolitrowej końcówce do transfekcji neonu.

Należy zachować dużą ostrożność, aby na tym etapie nie wprowadzać bąbelków. Następnie działanie elektryczne za pomocą pojedynczego impulsu o napięciu 1700 woltów przez 25 milisekund. Uwolnij komórki do probówki eend orph zawierającej jeden mil pożywki wolnej od antybiotyków.

Rozprowadź komórki z probówki do niezależnych studzienek zawierających wolny od antybiotyków DMEM z 10% FCS, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni przez 24 do 72 godzin. Odzyskiwanie MMV przez doskonałość warg RNA do siedmiu komórek BSR T, tak jak wcześniej CAP, transkrypty MMV są generowane przez plazmid MMV, CD nna, LINEARYZACJA, polimeraza T siódemka, transkrypcja in vitro i transkrypty cappingu in vitro są następnie dotknięte wargami do siedmiu komórek BS RT. Trypsyna jest monowarstwą siedmiu komórek bsrt i zasiewa się 7,5 razy 10 do pięciu żywotnych komórek w sześciu dołkowych szalkach talerzowych.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni przez noc. Usuń pożywkę z komórek i zastąp ją trzema mililitrami świeżej pożywki pozbawionej antybiotyków. Aby zapewnić maksymalną skuteczność transfekcji, zmieszaj od jednego do dwóch mikrogramów zakrytego M-M-V-R-N-A ze 100 mikrolitrami optimum.

Wymieszaj również cztery mikrolitry lipektomii 2000 ze 100 mikrolitrami optimum. Połączyć próbki zawierające RNA i lipektomię i dokładnie je wymieszać, pipetując w górę i w dół 15 razy. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 20 minut.

Następnie dodaj kompleksy transfekcyjne zawierające zakryte transkrypty MMV w sposób kroplowy do monowarstwy komórki. Potrząśnij płytką w prostopadłych kierunkach. Inkubować komórki przez 24 do siedmiu dwóch godzin.

Protokół bezpośredniego odzyskiwania zakaźnego MMV z CDNA w komórkach eksprymujących polimerazę T 7 RNA, jak opisano wcześniej. Protokół ten opiera się na ekspresji polimerazy T seven RNA i enzymów zamykających wirusa oxx w komórkach zakażonych za pomocą wirusa oxx. M-N-V-C-D-N-A pod kontrolą promotora T 7 jest następnie transfekowany do komórek.

Po pierwsze, usuń pożywkę do hodowli komórkowych i dodaj do każdej studzienki 700 mikrolitrów wirusa ospy F rozcieńczonego w pożywce wolnej od antybiotyków. Zwykle stosuje się wielokrotność infekcji około 0,5 PFU na komórkę, kształtuje płytki prostopadle i inkubuje przez godzinę w temperaturze 37 stopni. Potem. Dodać dwa posiłki z pożywką wolną od antybiotyków i inkubować komórki przez dodatkową godzinę w temperaturze 37 stopni, aby umożliwić transfekcję ekspresji polimerazy T siedem RNA MNV CG NNA, usunąć pożywkę z zakażonych komórek i dodać trzy młyny świeżej pożywki bez antybiotyków.

Przygotować mieszaninę jednego mikrograma M-M-V-C-D-N-A i lipektomii, jak wyjaśniono w poprzednim rozdziale. Dokładnie wymieszaj, przygotowując się do góry ido dołu. Trzymaj probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie ponownie wymieszaj i dodaj placki do monowarstwy komórek.

Delikatnie potrząśnij płytką w prostopadłych kierunkach. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni przez 24 do 72 godzin, aby potwierdzić odzyskanie zakaźnego MMV za pomocą różnych podejść genetyki odwrotnej pokazanych w trakcie tego filmu, uwalniaj zakaźną wariację z komórek przez wielokrotne zamrażanie, rozmrażanie. Oznaczyć w każdej próbce za pomocą standardowych procedur, takich jak TCID 50 lub reprezentatywne wyniki testu płytki nazębnej.

Dostępność tych odwróconych systemów genetycznych do badania neurowirusa mi zapewniła bezprecedensową możliwość analizowania roli sekwencji wirusowych w replikacji i patogenezie neurowirusów u naturalnego gospodarza. Oba podejścia do genetyki odwrotnej wyjaśnione w tym filmie są bardzo skuteczne w odzyskiwaniu zakaźnych neurowirusów i neurowirusów oraz hodowli komórkowych. Jak pokazano na tym rysunku.

Zakaźny MMV, tytuł przekracza 10 do pięciu TCID 50 na promil, są odzyskiwane po transfekcji ograniczonych transkryptów MM V do surowych komórek lub siedmiu komórek BS RT. Transfekcja MM V-C-D-N-A do siedmiu komórek BSRT wcześniej zakażonych za pomocą wirusa foul pops powoduje miana wirusa przekraczające 10 do czterech TCID 50 na promil. Miana wirusa uzyskane metodą genetyki odwrotnej są podobne do Titusa uratowanego w transfekcie z RNA, wyizolowanego z zakaźnego wirusa, co podkreśla wysoką skuteczność opisywanych tutaj odwrotnych systemów genetycznych.