Podejście do przetwarzania równoległego wielu celów w celu określenia gen-struktura podjednostki PB2 polimerazy grypy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zastosowanie podejścia wielocelowego do ustrukturyzowanego oznaczania białka docelowego za pomocą krystalografii rentgenowskiej, zaczynając od pojedynczego genu lub sekwencji genetycznej w przedstawionym tutaj przypadku. Białko docelowe to podjednostka PB dwóch polimerazy z grypy A, kluczowy składnik replikacji wirusa. Podejście wielocelowe osiąga się poprzez zaprojektowanie i sklonowanie serii konstruktów genetycznych równolegle w oparciu o pojedynczą sekwencję docelową i inne znane informacje o białku.

Drugim krokiem jest przetestowanie poziomów ekspresji dla każdego konstruktu i wybranie najlepszych do ekspresji białek na dużą skalę w hodowli komórkowej. Kolejnym krokiem jest rozbicie komórek w celu usunięcia docelowych białek z materiału ekspresyjnego i rafinacji każdego z nich do bardzo wysokiej czystości. Następnie przeprowadza się serię prób krystalizacji dla każdego białka, aby uzyskać formę krystaliczną odpowiednią do badań rentgenowskich.

Dane dyfrakcji rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości są następnie zbierane na jednym lub kilku kryształach i wykorzystywane do rozwiązania i udoskonalenia mapy gęstości elektronów przedstawiającej strukturę każdego docelowego białka. Wyniki te pozwalają na odwzorowanie trójwymiarowej struktury docelowego białka w oparciu o mapę gęstości elektronów. Przetwarzanie wielozadaniowe znacznie zwiększa prawdopodobieństwo powodzenia w ustrukturyzowanym oznaczaniu, zapewniając realne alternatywy dla każdej potencjalnej przeszkody na ścieżce.

Równoległa praca z wieloma celami jest również bardzo wydajna, co skraca czas i zmniejsza koszt w przeliczeniu na białko na każdym etapie. Potencjał zwiększenia tempa, w jakim odbywa się ustrukturyzowane oznaczanie celów leczniczych, pozwoli na opracowanie większej liczby możliwości rozwoju terapii w ciągu roku. Chociaż metoda ta może dostarczyć cennych informacji w dziedzinie biologii strukturalnej, wysokiej jakości białko uzyskane za pomocą tych metod może pomóc w każdym badaniu opartym na białkach.

Każda faza procesu ma swoją własną naukę i wymaga własnej wiedzy specjalistycznej, ale inwestycja w ludzi, oprzyrządowanie i know-how może się pięknie opłacić, gdy wszystkie elementy zostaną zmontowane. Po wybraniu docelowego genu i produktu genowego do badań, pierwszym krokiem jest zaprojektowanie wielu wariantów genetycznych lub konstruktów. Oprogramowanie do komponowania genów służy do projektowania tych konstruktów na poziomie białka wraz z powiązanym kodem na zmodyfikowanych syntetycznych sekwencjach genów.

Korzystając z modułu przeglądarki wyrównania i modułu projektowania konstrukcji, porównaj wyrównania sekwencji białek i zdefiniuj konstrukcję białkową, projektuj wstawianie starterów końcowych PCR i wektorowych PCR lub amperów. Następnie użyj algorytmu kompozytora genów z białka na DNA, aby wstecznie przetłumaczyć każdą sekwencję aminokwasów na kod w zmodyfikowanej sekwencji kwasu nukleinowego. Użyj odpowiedniego kodu w tabeli użycia, aby zoptymalizować sekwencję wyrażeń w określonej linii komórek.

W tym przypadku bakterie E. coli. Gdy docelowa sekwencja genu jest gotowa, wirtualnie sklonuj i wprowadź gen do odpowiedniego plazmidu wektorowego w celu ekspresji bakterii. W tym przypadku zmodyfikowany wektor PET 28.

Wektor ten zawiera pewne składniki niezbędne do ekspresji i oczyszczania białek. Gen docelowy jest modyfikowany w celu włączenia sekwencji znacznika histaminy na końcu N lub C białka oraz sekwencji rozszczepienia, aby umożliwić usunięcie znacznika podczas oczyszczania. Wektor posiada również gen oporności na antybiotyki do testowania ekspresji i fermentacji.

Każda sekwencja genetyczna białka docelowego jest następnie tworzona za pomocą standardowych metod syntezy genów w ramach przygotowań do klonowania rurowego, klonowania polimerazy z niekompletnym pierwotnym rozszerzeniem lub klonowania rur to strategia klonowania oparta na PCR, w której gen docelowy jest amplifikowany starterami, które są komplementarne do zamierzonego wektora. Metoda ta wykorzystuje niekompletny charakter późnego etapu PCR, który pozostawia produkty PCR ze zmiennymi jednoniciowymi końcami. Przygotowuję wkładkę PCR lub IPCR, dodając po pięć mikrolitrów starterów do przodu i do tyłu do każdej reakcji.

Na 96-dołkowej płytce zgodnie z mapą płytki dodaj dwa mikrolitry każdego syntetycznego genu o pełnej długości do odpowiedniego dołka zgodnie z mapą płytki. Po dodaniu 25 mikrolitrów głównej mieszanki PFU do każdego, dobrze cykl reakcji 25 razy, używając następujących warunków PCR. Denaturacja w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 30 sekund.

Anil w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 45 sekund i rozciągaj w temperaturze 68 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Amplifikacja fragmentów jest potwierdzona analizą żelową produktów IPCR metodą AGROS. Udane produkty IPCR są reprezentowane przez solidne pasma.

Mniej pożądane wyniki są często postrzegane jako słabe lub rozmazane pasma w oddzielnej reakcji. Ekspresja plazmidu jest amplifikowana przez wektorową amplifikację PCR lub fragmentu VPCR, co potwierdza analiza żelowa AROS produktów VPCR. Po amplifikacji produktów IPCR i VPCR dodaje się je do płytki łączącej i umieszcza w termocyklerze w celu przeprowadzenia reakcji łączenia.

Pomyślnie sklonowane konstrukty są następnie przekształcane w chemicznie kompetentne komórki E. coli i przechowywane w łodygach glicerolu, aby rozpocząć serię testów ekspresji. Niewielką ilość każdej próbki z zapasu glicerolu sklonowanego konstruktu umieszcza się na oddzielnej płytce agarowej. Płytka jest wykonana z bulionu składników odżywczych i markera antybiotykowego Kanamycyny zakodowanego w inkubacji wektora przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia.

Rozpocznij hodowlę wstępną dla każdej próbki, wybierając pojedynczą kolonię ze świeżo wyhodowanej płytki agarowej. Użyj tej kolonii do zaszczepienia 1,2 mililitra bulionu gruźlicy uzupełnionego mycyną w puszce i glukozą do równoległego przetwarzania. Każda kultura wstępna jest uprawiana w 96-dołkowym bloku o okrągłym dnie.

Rośnie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 220 obrotów na minutę. Po nocnym wzroście. Rozpocznij hodowle indukcyjne na małą skalę dla każdej próbki, używając 40 mikrolitrów kultury wstępnej do zaszczepienia.

1,2 mililitra bulionu TB. Uzupełniony o 50 miligramów na mililitr puszki mycyny i systemu ekspresowego novagen na noc. Po pierwsze, hoduj kultury indukcyjne w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 48 godzin, wytrząsając komórki zbiorcze z prędkością 220 obr./min przez wirowanie w temperaturze 4 000 jednostek GForce przez 15 minut.

Odlać sklarowany osad i przechowywać granulki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę przed dalszym przetwarzaniem po oczyszczeniu. Analizować białko z reakcją rozszczepienia i bez niej za pomocą elektroforezy kapilarnej przy użyciu systemu laboratoryjnego CHIP 90 zgodnie z protokołem producenta. W przypadku grypy podjednostka PB dwubiałkowa 14 z 34 konstruktów doprowadziła do rozpuszczalnego białka docelowego i weszła w kolejny etap: fermentację na dużą skalę.

Aby rozpocząć fermentację na dużą skalę, zaszczepij 100 mililitrów bulionu z kultur komórek bakteryjnych zawierających 50 miligramów na mililitr. Czy mycyna z glicerolu może rosnąć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza? Wstrząsając z prędkością 220 obr./min następnego dnia, rozszerz kulturę wstępną, używając 10 mililitrów do zaszczepienia.

Jeden litr bulionu zawierającego pożywkę do automatycznej indukcji i 50 miligramów na mililitr może zawierać mycynę w dwulitrowej kolbie z przegrodą. Wstrząśnij ekspandowanymi kulturami w temperaturze 37 stopni Celsjusza mniej więcej co 30 minut. Sprawdź gęstość optyczną hodowli, mierząc absorbancję UV przy długości fali 600 nanometrów.

Po osiągnięciu gęstości optycznej 0,6 zmień temperaturę inkubatora wytrząsającego na 20 stopni Celsjusza po pożądanym czasie wzrostu. Usuń reprezentatywny 10-mililitrowy quad Ali z każdego konstruktu w celu przetestowania wyrażenia. Zbieraj komórki przez odwirowanie w 5 000 jednostek GForce przez 15 minut.

Odlej supernatant i zamroź osad komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić i ponownie zawiesić pastę komórkową w buforze do lizy w stosunku objętości głównej od jednego do pięciu. Energicznie mieszać przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Użyj czystej szpatułki, aby oderwać kawałki od boku zlewki. Mechanicznie przetrzymuj komórki na lodzie za pomocą sonikatu masońskiego. Klarować surowy lizat przez odwirowanie w temperaturze 18 000 jednostek GForce przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zebrać supernatant i zachować małą porcję do analizy przed przystąpieniem do oczyszczania na dużą skalę. Potwierdź ekspresję białka na dużą skalę w każdej kulturze za pomocą analizy żelu na stronie SDS. Ten reprezentatywny wynik strony SDS pokazuje silną ekspresję białka, około 50% rozpuszczalności i około 50% rozszczepienia.

W tym przypadku znacznik histydyny został usunięty wraz z dodanym znacznikiem rozpuszczalności białka, który został zaprojektowany w oryginalnym konstrukcie. Żywica niklowa służy do oddzielania białka docelowego z unikalnym znacznikiem histaminowym od całego innego materiału komórkowego, w tym natywnych białek bakteryjnych. Niklową jedną kolumnę przygotowuje się przez przemycie czterema objętościami kolumny wody UE w celu usunięcia buforu magazynowego, a następnie jedną objętością kolumny buforu B i pięcioma objętościami kolumny buforu.

Równoległość równowagi A dla E odbywa się za pomocą producenta białka, który jest w stanie uruchomić wiele kolumn jednocześnie. Załadować każdy oczyszczony lizat zawierający rozpuszczone białko ze znacznikiem histaminy do oddzielnej kolumny z szybkością dwóch mililitrów na minutę, a następnie kilka przepłukań objętości kolumny buforem A, zebrać przepływ przez bufor i zachować do analizy. Eluuj związane białko w szeregu gradientów krokowych z A i B w stosunku 95 do pięciu 60 do 40, a na końcu 100% buforem B. Składniki buforu B konkurują z histaminą o żywicę niklową i w ten sposób usuwają białko z kolumny w danym stosunku.

Zebrać każdą frakcję elucji oddzielnie. Przedstawiono tutaj reprezentatywny wynik chromatogramu z serii na jednej kolumnie niklu. Przeanalizuj frakcje niklu wymykające się, lizat surowy, oczyszczony lizat i nikiel przepływający przez stronę SDS i porównaj z absorbancją UV przy 280 nanometrach zebraną podczas oczyszczania kolumny.

Ten krok określa, czy oczyszczanie zakończyło się pomyślnie. Wybrać i połączyć frakcje zawierające białko docelowe do przekazania do dalszego przetwarzania. Obliczyć całkowitą ilość białka na tym etapie z teoretycznym współczynnikiem ekstynkcji białka, mierząc absorbancję UV przy 280 nanometrach i uwzględniając całkowitą objętość połączonych frakcji.

Zapisz małą próbkę do analizy. Gen białka docelowego został zakodowany za pomocą specyficznej sekwencji, która jest rozpoznawana przez ULP one jako miejsce rozszczepienia, w ten sposób dodanie ULP one powoduje rozszczepienie między znacznikiem histydyny a białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj jeden mikrolitr proteazy podobnej do ubikwityny, jeden na każde pięć miligramów białka obecnego w połączonych frakcjach.

W tym momencie rozszczepione białko przenosi się z buforu B do buforu A w celu dalszego przetwarzania za pomocą rurki do dializy, dializuje białko na dwóch litrach buforu A przez cztery godziny w czterech stopniach Celsjusza z mieszaniem. Użyj wartości granicznej masy cząsteczkowej 10 kilodaltonów dla PB dwa po dializie. Uruchom kolejną stronę SDS żelu białka docelowego z obecnym ULP i bez niego.

Pozwoli to określić, czy rozszczepienie ULP one zakończyło się sukcesem i pozwoli wybrać najlepsze frakcje do dalszego przetwarzania. Pokazane tutaj nasze reprezentatywne wyniki strony SDS dla trzech konstruktów polimerazy pb. Dwa markery masy cząsteczkowej podjednostki znajdują się na pierwszym pasie.

Pasy drugi, szósty i dziesiąty to białka zbiorcze z jednej kolumny niklu. Pasy trzeci, siódmy i jedenasty zawierają przepływ rozszczepionego białka w buforze A z niklu drugiego oraz pasów czwartym, ósmym i dwunastym. Wykazać usunięcie znacznika histaminy w buforze B z niklu dwa.

Po usunięciu histaminy frakcje zbiorcze z niklu dwa są zagęszczane. Aby rozpocząć SEC, należy ponownie wybrać odpowiednią żywicę na podstawie masy cząsteczkowej celu W takim przypadku stosuje się kolumnę acere S 110 ponad 30 GL i równoważy ją 200 mililitrami buforu SEC przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę za pomocą pięciomililitrowej strzykawki, załadować próbkę do pętli próbki o pojemności 10 mililitrów i rozpocząć pracę kolumny SEC. Monitoruj chromatogram absorbentu UV przy 280 nanometrach podczas zbierania małych frakcji objętościowych.

Uruchom wszystkie odpowiednie frakcje SEC za pośrednictwem strony SDS. Standardowe podejście do prób krystalizacji białek przeprowadza się metodą siedzącej kropli obejmującą dyfuzję pary. Nierzadko zdarza się, że na samym początku dla każdego białka docelowego tworzy się dwa lub więcej rzadkich badań przesiewowych macierzy

Aby rozpocząć ten proces, należy wstępnie napełnić każdy zbiornik 96-dołkowej kompaktowej płytki krystalizacyjnej juniorem 80 mikrolitrami w każdym warunku na wybranym sicie krystalizacji, dozować 0,4 mikrolitra białka z buforu SEC do każdej z 96 studzienek. Następnie dodaj 0,4 mikrolitra sita krystalizacyjnego, zapewniając całkowite wymieszanie kropli w każdym. Dobrze przykryj cały banał krystalicznie czystą taśmą sufitową, zapewniając pełne uszczelnienie na każdej studzience, przechowuj płytę w temperaturze 16 stopni Celsjusza w niezakłóconym miejscu wolnym od wibracji otoczenia.

Sprawdzaj krystalizację białek okresowo w ciągu najbliższych kilku tygodni pod mikroskopem preparacyjnym. Jeśli kryształy białka się nie pojawią, ustaw nowe płytki w różnych warunkach i zmieniaj stężenie białka w ostatniej kropli, aby zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu przed zbiorem. Ostudź krążek w stylu A LS w doer wypełnionym ciekłym azotem i przykryj pokrywką, aby rozpocząć zbiory.

Przeciąć przezroczystą taśmę pokrywającą studzienkę z docelowym kryształem białka do pobliskiego pustego miejsca. Dobrze dodać 1,6 mikrolitra odpowiednich warunków krystalizacji i połączyć go z 0,4 mikrolitra glikolu etylenowego. Roztwór 20% glikolu etylenowego w stanie krystalizacji chroni kryształ białka.

Podczas zamrażania kriogenicznego przeanalizuj kryształ pod mikroskopem i wybierz odpowiednią pętlę kriokrograficzną do zbioru, dopasowując wewnętrzną średnicę pętli do maksymalnej szerokości kryształu. Przymocuj pętlę kriogeniczną do magnetycznej kryształowej różdżki i zapętl kryształ bezpośrednio z roztworu studzienki. Natychmiast zanurz pętlę kriogeniczną z zebranym kryształem w krioprotektantze, a następnie zanurz w krążku w stylu LS.

Aby flashować, zamroź kryształ, powtórz dla żądanej liczby kryształów. Po zakończeniu zbioru użyj różdżki krążkowej, aby umieścić magnetyczną pokrywkę na krążku zawierającym błyskawicznie zamrożone kryształy z wygiętymi językami. Odwróć krążek do góry nogami, aby wykonać następny krok.

Przykręć popychacz krążka do krążka, a następnie przenieś krążek do aktora KU i użyj go do wybicia pokrywy. Kryształy w krążku pozostają zamrożone w kąpieli ciekłego azotu do czasu, gdy będą gotowe do badań dyfrakcji rentgenowskiej przy użyciu oprogramowania do akwizycji obrazu J Director. Ustaw następujące parametry dla szczeliny wiązki ekranującej kryształy w odległości 0,5 stopnia, odległości detektora 50 milimetrów, kroku obrazu pod kątem 70 stopni i długości ekspozycji 30 sekund.

Oto przykładowy zrzut ekranu z oprogramowania do akwizycji obrazu, podczas gdy kryształ jest przesiewany, środkowy panel pokazuje obserwowaną dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego z reprezentatywnego kryształu, zbierając wystarczającą ilość obrazów w wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać pełny zestaw danych potrzebnych do określenia struktury trójwymiarowej. Strategie klonowania i oczyszczania białek zademonstrowane w tym filmie zaowocowały 14 oczyszczonymi PB, dwiema próbkami, z których dziewięć dało kryształy nadające się do badań dyfrakcyjnych. Wewnętrzny zestaw danych dyfrakcji rentgenowskiej został zebrany na pięciu z dziewięciu konstruktów z promieniowaniem alfa QK przy użyciu super jasnego generatora promieniowania rentgenowskiego rigaku FRE plus z obrotową anodą, wyposażonego w ossec variax hf, optykę HF i detektor Saturn 944 plus CCD.

Pokazano tutaj obraz dyfrakcji rentgenowskiej podjednostki polimerazy PB dwóch. Każdy zestaw danych został przetworzony i określono łącznie cztery struktury podjednostki PB dwa. Każda struktura została zrecenzowana i przesłana do banku danych o białkach w celu publicznego dostępu.

Rysunek ten przedstawia diagramy wstęgowe cząsteczek w krystalograficznej jednostce asymetrycznej. Z czterech dwóch struktur PB, struktury drugorzędowe są pokolorowane w tęczowy wzór z odpowiednimi kodami PDB. W tej tabeli przedstawiono analizę wyników dla dwóch celów PB grypy za pomocą metod opisanych w tym artykule wideo.

Wielozadaniowy potok przetwarzania równoległego do określania gen-struktura jest zilustrowany w pięciu krokach: klonowanie, rozpuszczalność, oczyszczanie, krystalizacja i określanie struktury. Wyniki naszej linii produkcyjnej w dziedzinie biologii strukturalnej nie tylko stanowią podstawę do badań opartych na strukturze, ale także zasilają dodatkowe badania, takie jak testy funkcjonalne w celu potwierdzenia funkcji białek lub biofizyczne badania przesiewowe nowych związków za pomocą MAR lub SPR w celu zidentyfikowania nowych punktów wyjścia do opracowywania leków. Technika ta i wynalezione wraz z nią narzędzia pomogły biologom strukturalnym utorować drogę do wykrywania wielu rodzajów badań opartych na odkryciach, w tym projektowania leków opartych na strukturze, które miały ogromny wpływ na ludzkie zdrowie i choroby.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób przetwarzanie równoległe z wieloma celami może znacznie zwiększyć sukces ustrukturyzowanego określania. Nie zapominaj, że praca w laboratorium biologii strukturalnej może być niezwykle niebezpieczna, a odpowiednie środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania czynności laboratoryjnych.