Wizualizacja odpowiedzi indukowanych toksynami bakteryjnymi za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek

Celem tego zabiegu jest wizualizacja odpowiedzi komórek odpornościowych na toksyny bakteryjne. Po pierwsze, toksyna jest wyrażana i oczyszczana ze złotych komórek BL 21. Po potwierdzeniu aktywności i stężenia toksyny, toksyna jest dostarczana do komórek odpornościowych.

Za pomocą mikroiniektora przeprowadza się szybką mikroskopię żywych komórek. Analiza uzyskanych obrazów ujawnia kinetykę reakcji komórek odpornościowych na toksynę w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak mechanizm aktywacji inflamasomów.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w odpowiedzi komórek odpornościowych za pośrednictwem toksyn, można ją również zastosować do innych bodźców, w tym ciągników chemotaktycznych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, badając interakcję bakterii z hodowanymi komórkami odpornościowymi i obserwując bardzo zmienne interakcje między bakteriami a komórkami odpornościowymi. Rozpocznij oczyszczanie paciorkowca lizyny O lub SLO od hodowli złotych komórek BL 21 zawierających PAG trzy SLO.

Jego plazmid urósł do OD około 0,6. Aby wywołać ekspresję białka, dodaj pięć mililitrów 20% OSes do kultury i wstrząsaj z prędkością 2 25 obr./min w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Następnie przenieś bakterie do 500-mililitrowej butelki wirówkowej.

Następnie wiruj kulturę w temperaturze 12 000 razy G przez 12 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza po wirowaniu dekantacji. Supinat przechowuje osad w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc lub dłużej, jeśli to konieczne. W celu oczyszczenia wyrażonego SLO dodać 10 mililitrów lybuforu do przemywania uzupełnionego lizozymem Triton X 100 i fluorkiem fenylometylosulfoilu do pipety zamrożonych granulek w górę iw dół przez około 15 minut.

Do Resus zawiesić osad, utrzymując próbkę na lodzie. Przenieś zawieszony granulat do 50-mililitrowej rurki polipropylenowej z okrągłym dnem z dębowego grzbietu. Sonikować lizat za pomocą sondy sonikować przy 40% wydajności pięć razy po 30 sekund w odstępach 30-sekundowych z 30 sekundami na lodzie pomiędzy nimi.

Następnie obracaj lizat sonikatu w temperaturze 39 000 razy G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu dodaj supinat bakteryjny do jednego mililitra przemytego niklu NTA aros. Inkubować nikiel NTA aros i lizować razem przez 2,5 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając Po inkubacji.

Granuluj koraliki, wirując z prędkością 400 razy G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Należy pamiętać, że wszystkie dalsze płukanie i elucja są wykonywane przy tych ustawieniach wirowania i mniej zaznaczono inaczej. Po odwirowaniu.

Połączyć 30 mikrolitrów supinatu z 10 mikrolitrami czterokrotnego buforu próbki SDS w mikroprobówce wirówkowej i zachować na lodzie do analizy czystości. Następnie wyrzucić pozostałą część środka leżącego na wznak i umyć kulki czterokrotnie w buforze do płukania. I raz zainteresowanie bufor soli wirowanie między każdym myciem Od tego momentu należy zawsze przechowywać próbkę na lodzie.

SLO jest białkiem bardzo wrażliwym na redoks i szybko straci swoją aktywność, jeśli ogrzeje się do 37 stopni Celsjusza, nawet jeśli przez krótki czas. Aby wymyć białko SLO, dodaj jeden mililitr buforu elucyjnego i pięć mikrolitrów jednego molowego DTT do kulek, inkubuj na lodzie przez 10 minut. Następnie odwirować i zebrać supinat do probówki z fuge oznaczonej liczbą objaśnianą.

Powtórz ten proces trzy razy, a następnie aby usunąć endotoksynę z białka SLO, dodaj 200 mikrolitrów przemytych sprzężonych kulek agro z mieszaniem poli, zawieszonego buforu soli do próbki i wstrząsaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie wiruj z prędkością 10 000 razy G przez jedną minutę w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu zebrać supernatant do nowo oznakowanych mikroprobówek wirówkowych.

Połącz 30 mikrolitrów każdej elucji z 10 mikrolitrami, czterokrotnym buforem próbki SDS. W celu analizy strony SDS przechowuj rozwiązania SLO na lodzie. Określ stężenie białka i aktywność hemolityczną, jeśli jest zadowalająca, wyciągnij SLOE w pięciu do 10 mikrolitrowych kwatach, a następnie zamroź na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Następnie określ specyficzną lizę. Reese. Zawiesić ogniwa, które mają być badane dwa razy. Wyśrodkuj sześć komórek na mililitr w buforze RB z 20 mikrogramami na mililitr.

Jodek propydyny. Tutaj testowane są komórki T 27A. Dodaj 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V w oddzielnych probówkach do mikrowirówek.

Seryjnie rozcieńczyć SLO do dwukrotności końcowego stężenia w buforze rb. Następnie dodaj do komórek 100 mikrolitrów toksyny lub 100 mikrolitrów buforu RB i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Typowe stężenia końcowe wahają się od 2000 jednostek na mililitr do 31,25 jednostek na mililitr.

Uruchom komórki na cytometrze przepływowym i zbierz dane za pomocą filtrów dla fi, cetryny lub pe. Przesunięcie o jeden log oznacza przejściowo przepuszczalne komórki, podczas gdy przesunięcie o trzy logarytmy oznacza martwe komórki. Oblicz specyficzną lizę komórek, odejmując procent martwych komórek w kontroli od eksperymentu, korzystając z równania pokazanego tutaj na dzień przed płytką eksperymentalną, dwukrotnie wyśrodkuj pięć makrofagów na szkle pokrytym kolagenem.

Dolne naczynia o grubości 35 milimetrów. Mikroskop używany do dostarczania toksyn powinien być wyposażony w stolik odwrócony, stolik podgrzewany, odpowiednie kostki filtra emisji wzbudzenia oraz, jeśli jest dostępny, soczewkę Bertenda. Najtrudniejszą częścią tej procedury jest sprowadzenie igły w stanie nienaruszonym do komórek.

Aby zapewnić sukces, używamy soczewki Bertranda, która jest zwykle używana do ustawiania, aby uwidocznić igłę, gdy przesuwamy ją przez płaszczyzny ogniskowe. Mikroskop powinien być podłączony do mikrowtryskiwacza i powinien być sterowany przez komputer z wystarczającą pamięcią do zbierania i przechowywania danych, włączania mikroskopu i mikrowtryskiwacza oraz pozwalania, aby podgrzany stage rozgrzał się do 37 stopni Celsjusza, czekając, aż stolik się nagrzeje. Oznacz komórki przez 30 minut barwnikiem w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W zależności od testu znakowanie można wykonać za pomocą pięciu mikrolitrów, czterech lub 2:00 w nocy w jednym mililitrze, HBSS lub dwóch mikrolitrów wapnia am w jednym mililitrze pełnego podłoża, tutaj stosuje się cztery lub dwa. Usuń pożywkę komórkową i umyj komórki raz PBS. Odessać PBS i zastąpić go jednym mililitrem RPMI uzupełnionym dwoma milimolowymi chlorkami wapnia.

Zamontuj miskę na mikroskopie, ustaw ostrość komórek w jasnym polu, a następnie dostosuj, aby ustawić ostrość nieco nad komórkami. Następnie połącz jeden mikrolitr toksyny SLO cztery mikrolitry, 10 miligramów na mililitr, DEXTRA 5 55 i sześć mikrolitrów wody. Następnie odwiruj 20 000 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Dekstran służy do sprawdzenia, czy końcówka femto nie jest zatkana literą G. Użyj mikroładowarki, aby załadować dwa mikrolitry rozcieńczonej toksyny do końcówki femto od tyłu. Załaduj końcówkę femto na mikrowtryskiwacz.

Następnie dostosuj kąt wtryskiwacza tak, aby końcówka znajdowała się nad środkiem komórek z miejscem na ruch we wszystkich kierunkach, wyczyść poprzednie ustawienia dla limitu Z, który ogranicza, jak nisko może zejść końcówka mikrowtryskiwacza. Ustaw mikrowtryskiwacz tak, aby wstrzykiwał przez 0.5 sekundy przy ciśnieniu 120 PSI przy przeciwciśnieniu 20 PSI. Następnie opuść końcówkę, aż wejdzie w medium.

Korzystanie z obiektywu Bertranda. Wyśrodkuj końcówkę i podążaj za końcówką, gdy jest opuszczana bliżej komórek. Gdy igła przestanie być ostra, przełącz się z powrotem na normalną optykę.

Cień igły powinien być widoczny w terenie. Ustaw ostrość nad komórkami i opuść igłę, aż stanie się ostra. Następnie ustaw ostrość komórek i ostrożnie przyłóż igłę do komórki.

Po ustawieniu limitu Z do wstrzyknięcia należy rozpocząć obrazowanie i wstrzyknąć toksynę. Następnie podnieś igłę i przejdź do nowego obszaru komórek. Wstrzyknąć dodatkową toksynę i kontynuować obrazowanie po wstrzyknięciu.

Przesuń igłę do pozycji wyjściowej, aby zapobiec niepożądanemu wyciekowi toksyny z igły przy użyciu metody opisanej w tym filmie, 10 do siedmiu do 10 do ośmiu jednostek na mililitr. SLO jest zwykle uzyskiwany przy stężeniu białka wynoszącym cztery miligramy na mililitr. Ten żel na stronie SDS pokazuje próbki bakterii przed i po indukcji toksyny po oczyszczeniu, a każde z trzech niebieskich zabarwień ellucian kamasi ujawnia, że indukowane SLO zostało pomyślnie oczyszczone.

SLO to pasmo 69 kilodaltonów w celu określenia ilości toksyny wymaganej do lizy dwóch komórek T 27 A lub D. Komórki prowokowano różnymi stężeniami SLO przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności jodku propidyny i badano za pomocą cytometrii przepływowej. Specyficzną lizę oznaczono, jak pokazano tutaj.

250 jednostek na mililitr. SLO daje 50% lizy zarówno dwóch komórek T27A, jak i D. Sublityczna 10% dawka lizy toksyny wynosiłaby 62,5 jednostki na mililitr.

Wartości te są ważne dla wzorcowej aktywności toksyny w celu oceny śmierci komórki po ekspozycji na toksynę. Ludzkie fibroblasty skóry inkubowano z homodimerem wapnia i atherium przy użyciu żywego martwego zestawu firmy LIFE Technologies. Po miejscowej ekspozycji na toksynę bakteryjną, antro lizynę O.In tym obrazie, wapń jest pokazany na zielono, a bromek atherium w czerwonych obszarach blisko mikrobiomu, pokazuje śmierć komórki typową dla utraty wapnia i wychwytu homodimerów, podczas gdy obszary dalej od końcówki nie wykazują uszkodzeń.

Mikrodostarczanie toksyny pozwala również na badanie zdarzeń w czasie rzeczywistym, takich jak przepływ wapnia. Te ludzkie prądy stałe załadowane o godzinie 4:02 zostały wystawione na działanie SLO przy stałym natężeniu przepływu z jednoczesnym przesunięciem obrazowania na żywo z zielonego na niebieski. Pseudo kolor wskazuje na wzrost poziomu wapnia cytozolowego.

SLO indukuje szybki wzrost cytozolowego wapnia, który jest propagowany w okolicy naczynia w wyniku miejscowego dostarczania. Jednak tylko komórki znajdujące się w pobliżu końcówki mikrowtryskiwacza napotykają toksynę reaktora. Pokazuje to zarówno jedną reakcję komórkową na toksynę, jak i ograniczony przestrzennie obszar dostarczania toksyny w celu rozwiązania zdarzeń w wymiarze zdi.

Mikrodostarczanie połączono z szybką mikroskopią konfokalną 3D. Ten zestaw obrazów pokazuje komórki dendrytyczne po wstrzyknięciu toksyny. Zostały one wstępnie inkubowane z anty CD 11 C sprzężonym z PC pokazanym na zielono w celu oznaczenia błony plazmatycznej.

Jak widać tutaj, mikropęcherzyki uwalniają się po dostarczeniu toksyny. W ramach procesu naprawy komórkowej cząsteczki toksyny koncentrują się na pęcherzykach, które są zrzucane w celu wyeliminowania toksyny. Po opanowaniu mikroskopia może być wykonana w 45 minut.

Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby utrzymać toksynę w niskiej temperaturze przed zmieszaniem z komórkami i przetestować aktywność hemolityczną. Dobry. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć kinetykę odpowiedzi komórek odpornościowych na toksyny bakteryjne w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii żywych komórek.