Name: Wizualizacja odpowiedzi indukowanych toksynami bakteryjnymi za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji odpowiedzi komórek odpornościowych na toksyny bakteryjne przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek. Technika ta umożliwia badanie kinetyki aktywacji inflamazomów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Richardowi Restowi za hojny dar antrolizyny O, Michaelowi Caparonowi za hojny dar plazmidu SLO oraz Jonathonowi Franksowi za pomoc techniczną. Praca ta była finansowana z grantów NIH T32CA82084 (PAK) oraz R01AI072083 (RDS).

1. Oczyszczanie streptolizyny O (SLO)
<ol>
	<li>Zaszczepić 20 ml nocnej hodowli komórek BL21 GOLD zawierających plazmid pBADgIII-SLOhis9 do 0,5 L bulionu LB i dodać 500 μl ampicyliny o stężeniu 50 mg/ml. Inkubować hodowlę z wytrząsaniem przy 225 rpm w temperaturze 37 °C aż do uzyskania OD600 = 0,6, co zwykle zajmuje ~1,5 h. Odwirować 1 ml bakterii (przyjęto jako T0) przy 10 000 x g przez 5 min, rozpuścić osad w 140 μl 1x buforu do próbek SDS / 1 OD i poddać sonikacji w celu rozbicia DNA do analizy czystości białka.</li>
	<li>Indukować bakterie poprzez dodanie do hodowli 5 ml 20% arabinozy i inkubować z wytrząsaniem przy 225 rpm w temperaturze pokojowej przez 3 h. Pobrać 1 ml bakterii, odwirować i rozpuścić w 1x buforze do próbek SDS w sposób opisany powyżej dla punktu czasowego T3 do analizy czystości.</li>
	<li>Zebrać pozostałe bakterie do 500 ml butelki wirówkowej, wirować przy 12 000 x g przez 12 min w temperaturze 4 °C (rotor Sorvall GS-3, 8 500 rpm). Odlać nadsącz, a osad przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc lub dłużej, jeśli jest to konieczne.</li>
	<li>Resuspendować zamrożony osad na lodzie w 10 ml buforu do lizy i płukania (Lyse/Wash buffer; 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu, pH 8,0) uzupełnionego o 400 μl 25% Triton X-100, 100 μl lizozymu o stężeniu 100 mg/ml oraz 50 μl 200 mM fluorku fenylometylosulfonylowego (PMSF). Przenieść resuspendowany osad do probówki Oak Ridge o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Sonikować lizat 5 razy po 30 s na lodzie w odstępach 30 s. Wirować sonikowany lizat w probówce Oak Ridge przy 39 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C (rotor Sorvall SS-34, 18 000 rpm).</li>
	<li>Podczas wirowania lizatu przemyć 1 ml agarozy Ni-NTA 10 ml buforu do lizy i płukania, a następnie wirować przy 1 200 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C (wszystkie kolejne etapy płukania i elucji należy przeprowadzać w tych samych warunkach wirowania). Odessać płuczkę.</li>
	<li>Dodać nadsącz bakteryjny z kroku 1.5 do agarozy Ni-NTA i delikatnie mieszać przez 2,5 h w temperaturze 4 °C. Wirować w celu zebrania nadsączu. Połączyć 30 μl nadsączu z 10 μl 4x buforu do próbek SDS i zachować do analizy czystości. Przemyć ziarna 4 razy buforem do lizy i płukania oraz raz buforem Tris/sól (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).</li>
	<li>Przeprowadzić elucję trzykrotnie poprzez dodanie do ziaren 1 ml buforu do elucji (250 mM imidazolu w buforze Tris/sól) oraz 5 μl 1 M ditiotreitolu (DTT), inkubować na lodzie przez 10 min, odwirować i zebrać nadsącz. SLO jest białkiem bardzo wrażliwym na utlenianie-redukcję i musi być przez cały czas przechowywane na lodzie. Po redukcji białko szybko traci aktywność w przypadku ogrzania do 37 °C, nawet przez krótki czas.</li>
	<li>Przemyć 500 μl agarozy sprzężonej z polimyksyną w buforze do elucji, wirować przy 10 000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C i resuspendować w 500 μl. Aby usunąć endotoksyny, dodać 200 μl ziaren do każdej frakcji elucyjnej i mieszać w temperaturze 4 °C przez 30 min. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C i zebrać nadsącz. Połączyć 30 μl każdej frakcji elucyjnej z 10 μl 4x buforu do próbek SDS do analizy SDS-PAGE.</li>
	<li>Sprawdzić czystość elucji za pomocą SDS-PAGE. Próbki zachowane do analizy żelowej gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min i nałożyć 10 μl na żel 10%. Barwić żel błękitem Coomassie, aby zwizualizować białko (Rysunek 2A). Masa SLO wynosi 69 kDa. Wykonać test Bradforda w celu oznaczenia stężenia białka (typowy uzysk dla dwóch pierwszych elucji wynosi 4 mg/ml, ale może się on różnić w zależności od szczepu bakteryjnego i użytego plazmidu).</li>
	<li>Przetestować aktywność hemolityczną każdej frakcji elucyjnej (patrz poniżej). Połączyć frakcje elucyjne, w których czystość, stężenie i aktywność hemolityczna są zadowalające. Rozdzielić SLO na jednorazowe alikwoty (zazwyczaj 5-10 μl), zamrozić na lodzie suchym i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Test hemolityczny
<ol>
	<li>Przemyć erytrocyty owcze (RBCs) w buforze do analizy RBC (0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 2 mM CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,4), wirować przy 1 200 rpm przez 5 min i resuspendować do stężenia 2,5% RBCs w 10 ml buforu do analizy RBC.</li>
	<li>Do każdego dołka płytki 96-dołkowej z wypukłym dnem (V-bottom) umieszczonej na lodzie dodać 10 μl buforu do analizy RBC. Wykonać rozcieńczenia szeregowe każdego eluatu w duplikacie. Typowe zakresy rozcieńczeń wynoszą od 1:1 000 do 1:512 000. Uwzględnić 3 dołki bez toksyny oraz 3 dołki z 10 μl 2% Triton X-100 jako odpowiednio kontrolę minimum i maksimum.</li>
	<li>Przykryć płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Wirować przy 1 200 rpm przez 5 min. Przenieść 70 μl supernatantu do płaskodennej płytki 96-dołkowej. Odczytać A405. Jedną jednostką jest rozcieńczenie toksyny wymagane do 50% lizy erytrocytów. Aktywność toksyny oblicza się jako 1 jednostka * czynnik rozcieńczenia / 0,01 ml.</li>
</ol>
3. Analiza lityczna komórek
<ol>
	<li>Zebrać komórki, policzyć i odwirować. Resuspendować w stężeniu 2x106/ml w buforze R/B (RPMI z 2 mM CaCl2, 0,5% BSA) i 20 μg/ml jodku propidyny. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenia szeregowe SLO do dwukrotności stężenia końcowego w buforze R/B, a następnie dodać 100 μl toksyny lub 100 μl buforu R/B do komórek. Inkubować przez 5 min w 37 °C. Typowe stężenia końcowe mieszczą się w zakresie od 2 000 U/ml do 31,25 U/ml.</li>
	<li>Przeanalizować komórki za pomocą cytometru przepływowego i zebrać dane przy użyciu filtrów dla fykoerytryny (PE). Przesunięcie o jedną logarytmiczną jednostkę oznacza komórki przejściowo permeabilizowane, natomiast przesunięcie o trzy jednostki logarytmiczne wskazuje na komórki martwe4. Obliczyć specyficzną lizę komórek, odejmując procent martwych komórek w kontroli (%PIhighctl) od wartości eksperymentalnej (%PIhighexp), zgodnie z wzorem: specyficzna liza= (%PIhighexp-%PIhighctl)/(100-%PIhighctl)*100</li>
</ol>
4. Podawanie toksyny do komórek w szalkach hodowlanych za pomocą mikropipety
<ol>
	<li>Na jeden dzień przed eksperymentem wysiać 2x105 makrofagi w szalce o średnicy 35 mm z dna szklanego pokrytego kolagenem.</li>
	<li>Włącz mikroskop i mikroinżektor. Odczekaj, aż podgrzewany stolik osiągnie temperaturę 37 °C. Wybór mikroskopu zazwyczaj zależy od dostępnego sprzętu w danym laboratorium. Mikroskop musi posiadać odwrócony stolik, system podgrzewania naczyń do 37 °C, kostki filtrów wzbudzenia/emisji odpowiednie dla wybranego barwnika oraz przestrzeń umożliwiającą fizyczne podłączenie mikroinżektora. Przydatna, choć nieobowiązkowa przy mikroiniekcji, jest soczewka Bertranda. Komputer sterujący mikroskopem musi posiadać wystarczającą pamięć do gromadzenia i przechowywania danych.</li>
	<li>Barwić komórki przez 30 min w temperaturze 37 °C. W zależności od analizy barwienie można przeprowadzić z użyciem 5 μl Fura2 AM w 1 ml PBS lub 2 μl kalceiny AM w 1 ml pełnej pożywki. W przypadku Fura2 rejestrowane jest wzbudzenie/emisja dla 340/510 nm oraz 380/510 nm, a stosunek sygnałów 340/380 określa przepływ jonów wapnia. Dla kalceiny wzbudzenie/emisja wynosi 495/515 nm, natomiast dla etydyny homodimera 525/620 nm i dla APC 650/660 nm. Można wybrać również inne znaczniki.</li>
	<li>Przemyć komórki buforem PBS i przenieść do 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej o 2 mM CaCl22Zamocuj na mikroskopie.</li>
	<li>Rozcieńczyć toksynę i dekstran w wodzie, a następnie odwirować przy 20 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Typowo 1 μl SLO i 4 μl dekstranu-555 o stężeniu 10 mg/ml rozcieńcza się w 6 μl wody. Dekstran lub inną fluorescencyjną cząsteczkę fazy płynnej stosuje się w celu weryfikacji, czy femto-tip nie jest zapchany, a następnie wykonuje wtrysk zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Napełnić femto-końcówkę od tyłu 0,07 μl rozcieńczonej toksyny za pomocą mikroladowarki.</li>
	<li>Załaduj femtopipetę (femto-tip) do mikroinjektora. Dostosuj kąt nachylenia injektora tak, aby końcówka znajdowała się nad centrum komórek, zachowując przestrzeń do ruchu we wszystkich kierunkach. Zresetuj limit osi Z. Parametry iniekcji powinny być ustawione na czas wtrysku 0,5 s przy ciśnieniu 120 psi i ciśnieniu wstecznym 20 psi. Obniżaj końcówkę, aż znajdzie się w medium.</li>
	<li>Używając soczewki Bertranda, wycentruj końcówkę i śledź ją podczas obniżania w kierunku komórek. Po utracie ostrości przełącz się z powrotem na optykę standardową. Cień igły powinien być widoczny w polu widzenia. Ustaw ostrość powyżej komórek i obniżaj igłę, aż stanie się ona widoczna. Ponownie ustaw ostrość na komórkach i ostrożnie zbliż igłę do komórki. Ustaw limit osi Z dla iniekcji. Rozpocznij obrazowanie, przesuń końcówkę do pożądanej pozycji i wykonaj iniekcję, aby uwolnić toksynę w wybranym punkcie czasowym. Podnieś igłę, przesuń ją do nowego obszaru komórek i wykonaj iniekcję. Przesuń igłę do pozycji domyślnej, aby zapobiec niezamierzonemu wyciekowi toksyny z igły.</li>
</ol>

<ol><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li>
<li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li>
<li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li>
<li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li>
<li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li>
<li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion%3A+Implications+for+inflammatory+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li>
<li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li>
<li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li>
<li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li>
<li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li>
<li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li>
<li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anthrolysin+O%2C+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Techniki opisane w niniejszym materiale pozwalają na badanie odpowiedzi komórek odpornościowych na toksyny bakteryjne. Najbardziej krytycznym etapem jest postępowanie z toksyną oraz jej dawkowanie. Aktywność toksyny może być niezwykle zmienna, nawet pomiędzy różnymi alikwotami tego samego preparatu, ze względu na jej nietrwałość. Wymaga to albo testowania każdego alikwotu toksyny na referencyjnej linii komórkowej lub RBC, albo zastosowania gradientów toksyny. Gradienty toksyny, podawane za pomocą mikropipety, pozwalają n...

<table><tbody><tr><td>agaroza Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>agaroza z polimyksyną</td><td>Sigma</td><td>P1411-5ML</td><td></td></tr><tr><td>kolumny Zeba Desalt Spin</td><td>Fisher</td><td>PI-89891</td><td></td></tr><tr><td>erytrocyty owcze</td><td>Fisher</td><td>50-415-688</td><td></td></tr><tr><td>pBADgIII-SLO</td><td>Brak danych</td><td>N/A</td><td>patrz ref.&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt; </td></tr><tr><td>Barwnik monoreaktywny Cy5</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM/ Homodimer etydyny</td><td>Life Technologies</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD11c-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550261</td><td></td></tr><tr><td>szalka z szklanym dnem pokryta kolagenem</td><td>Mattek</td><td>P35GCol-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>femto-tip II</td><td>Fisher</td><td>E5242957000</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta do dozowania</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>dekstran Alexa 555</td><td>Life Technologies</td><td>D34679</td><td></td></tr><tr><td>Injectman NI 2</td><td>Eppendorf</td><td>920000029</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Lista i źródła niezbędnych specyficznych odczynników i sprzętu. Wymieniono specyficzny sprzęt i odczynniki wykorzystane w tym protokole wraz z nazwą firmy oraz numerem katalogowym.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Bufor&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Skład&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Krok zastosowany&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Lizacja/Płukanie&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 300 mM NaCl&lt;br/&gt; 10 mM imidazol, pH 8,0&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.4&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;bufor Tris/sól&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM Tris, pH 8,0&lt;br/&gt; 300 mM NaCl&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.7&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Bufor elucyjny&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM Tris, pH 8,0&lt;br/&gt; 300 mM NaCl&lt;br/&gt; 250 mM imidazolu&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.8&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Bufor do testu z użyciem erytrocytów&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0,3% BSA&lt;br/&gt; 2 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 10 mM HEPES, pH 7,4&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2.1&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;bufor R/B&lt;/td&gt; &lt;td&gt;pożywka do hodowli komórkowej RPMI&lt;br/&gt;2 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 0,5% BSA&lt;/td&gt; &lt;td&gt;3.1&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Lista buforów wykorzystanych w niniejszym protokole. Wymieniono zastosowane bufory, ich skład oraz pierwszy krok protokołu, w którym zostały użyte.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

wizualizacja odpowiedzi indukowanych przez toksyny bakteryjne przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Toksyny bakteryjne wiążą się z cholesterolem w błonach, tworząc pory, które umożliwiają wyciek zawartości komórkowej oraz napływ materiałów z otoczenia zewnętrznego. W zależności od stopnia ekspozycji na toksynę oraz rodzaju komórki, komórka może albo dojść do siebie po tym uszkodzeniu, co wymaga aktywnych procesów naprawy błony, albo ulec śmierci1. Ponadto toksyny te indukują silne reakcje zapalne u zakażonych gospodarzy poprzez aktywację komórek odpornościowych, w tym makrofagów, które produkują szereg cytokin prozapalnych2. Wiele bakterii Gram-dodatnich produkuje toksyny wiążące cholesterol, o których wykazano, że przyczyniają się do ich wirulencji poprzez w dużej mierze nieopisane mechanizmy.
Zmiany morfologiczne w błonie plazmatycznej komórek eksponowanych na te toksyny obejmują ich sekwestrację w wzbogaconych w cholesterol wypukłości powierzchniowych, które mogą być odrzucane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, co sugeruje istnienie wewnętrznego mechanizmu obronnego komórki3,4. Proces ten zachodzi we wszystkich komórkach przy braku aktywności metabolicznej i może być wizualizowany za pomocą EM po fiksacji chemicznej4. W komórkach odpornościowych, takich jak makrofagi pośredniczące w zapaleniu w odpowiedzi na ekspozycję na toksyny, sugeruje się, że indukowane pęcherzyki błonowe zawierają cytokiny z rodziny IL-1 i mogą odpowiadać zarówno za usuwanie toksyny, jak i za rozprzestrzenianie tych prozapalnych cytokin5,6,7. Zasugerowano powiązanie między uwalnianiem IL-1β a specyficznym typem śmierci komórkowej, zwanym pyroptozą, ponieważ oba są procesami zależnymi od kaspazy-18. Aby wyjaśnić złożoność odpowiedzi makrofagów, która obejmuje wiązanie toksyn, odrzucanie pęcherzyków błonowych, uwalnianie cytokin, a potencjalnie śmierć komórkową, opracowaliśmy techniki znakowania i metody mikroskopii fluorescencyjnej, które pozwalają na wizualizację interakcji toksyna-komórka w czasie rzeczywistym, w tym na pomiary dysfunkcji i śmierci (Rysunek 1). Zastosowanie obrazowania żywych komórek jest konieczne ze względu na ograniczenia innych technik. Podejścia biochemiczne nie pozwalają na rozdzielenie efektów występujących w pojedynczych komórkach, natomiast cytometria przepływowa nie oferuje wysokiej rozdzielczości wizualizacji pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym. Opisane tutaj metody mogą zostać zastosowane do analizy kinetyki odpowiedzi indukowanych przez inne bodźce, wiążących się ze złożonymi zmianami fenotypowymi w komórkach.

Zazwyczaj można uzyskać stężenie SLO rzędu 107-108 U/ml przy stężeniu białka 4 mg/ml. Ilość toksyny wymagana do lizy komórek różni się w zależności od typu komórek, ale zazwyczaj wynosi 125-500 U/ml SLO (Rycina 2B). Niektóre typy komórek, takie jak makrofagi, mogą być bardziej odporne (4000 U/ml), podczas gdy inne (szczególnie linie komórek T) są bardziej wrażliwe. Wrażliwości te odpowiadają komercyjnie dostępnym preparatom SLO. Aktywność toksyny spada mniej więcej dwukrotnie przy k...

Opisano metody oczyszczania toksyny wiążącej cholesterol, streptolizyny O, z rekombinowanych E. coli oraz wizualizacji wiązania toksyny z żywymi komórkami eukariotycznymi. Lokalna dostawa toksyny indukuje szybkie i złożone zmiany w komórkach docelowych, ujawniając nowe aspekty biologii tej toksyny.

Wizualizacja odpowiedzi indukowanych przez toksyny bakteryjne przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Toksyny bakteryjne wiążą się z cholesterolem w błonach, tworząc pory, które umożliwiają wyciek zawartości komórkowej oraz napływ substancji z zewnątrz...

Celem niniejszej procedury jest wizualizacja odpowiedzi komórek odpornościowych na toksyny bakteryjne. Najpierw toksyna jest eksprymowana i oczyszczana z komórek BL 21 gold. Po potwierdzeniu aktywności i stężenia toksyny, zostaje ona dostarczona do komórek odpornościowych.Wykonano mikroiniekcję oraz szybką mikroskopię żywych komórek. Analiza uzyskanych obrazów ujawnia kinetykę odpowiedzi komórek odpornościowych na toksynę w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak mechanizm aktywacji inflamasomu.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat odpowiedzi komórek odpornościowych indukowanej przez toksyny, można ją zastosować również do innych bodźców, w tym do czynników chemotaktycznych. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas badania oddziaływań bakterii z hodowanymi komórkami odpornościowymi, kiedy zaobserwowano bardzo zróżnicowane interakcje między bakteriami a komórkami odpornościowymi. Oczyszczanie streptolizyny O lub SLO należy rozpocząć od namnożenia kultury komórek BL 21 gold zawierających pAG3 SLO.Hodować plazmid do gęstości optycznej OD wynoszącej około 0,6. Aby indukować ekspresję białka, dodać do hodo

visualization-bacterial-toxin-induced-responses-using-live-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wizualizacja reakcji wywołanych toksynami bakterii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Źródło: Brzozowski, R. S. i in. Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu badania lokalizacji białek podkomórkowych oraz zmian morfologii komórek u bakterii. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek, aby wizualizować zmiany morfologiczne bakterii w czasie rzeczywistym. Opisuje etapy związane z obrazowaniem, akwizycją poklatkową oraz dekonwolucją w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie zmian morfologicznych u bakterii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek

Źródło: Chetrit, D. i in. Zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz tomografii krioelektronowej w celu wyróżnienia cech przestrzenno-skroniowych systemu sekrecji kropkowej/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie bakterii patogennych znakowanych fluorescencjonie. Agarozowe podkładki są najpierw przygotowywane i umieszczane w ramie klejącej. Na podkład aplikowana jest zawiesina genetycznie modyfikowanych bakterii ekspresujących...

Przygotowanie próbek i obrazowanie bakterii znakowanych fluorescencją

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne.  W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi.

Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Fluorescencyjnie oznaczone antybiotyki są potężnymi narzędziami, które mogą być używane do badania wielu aspektów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W artykule opisano przygotowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie i ich zastosowanie do badania antybiotykooporności bakterii. Sondy mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów oporności bakterii (np. wypływu) za pomocą spektrofotometrii, cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Wizualizacja oporności bakterii za pomocą fluorescencyjnych sond antybiotykowych

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Poznaj metodę wizualizacji odpowiedzi komórek odpornościowych na toksyny bakteryjne przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek. Technika ta umożliwia badanie kinetyki aktywacji inflamazomów w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja odpowiedzi indukowanych przez toksyny bakteryjne przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Przeglądaj więcej filmów