Wizualizacja oporności bakterii za pomocą fluorescencyjnych sond antybiotykowych

Przygotowanie antybiotyków fluorescencyjnych pozwala na ocenę lokalizacji tych odczynników terapeutycznych w bakteriach za pomocą wygodnych technik analitycznych, takich jak spektrofotometria i mikroskopia. Główną zaletą tej techniki jest łatwość, z jaką można określić lokalizację antybiotyku. Ta lokalizacja jest istotna dla wielu zjawisk, w tym wypływu.

Aby przeprowadzić procedurę reakcji kliknięcia A, umieść interesujący nas antybiotyk azydkowy w kolbie okrągłodennej i dodaj do kolby 25 mililitrów tert-butanolu i 25 mililitrów wody na milimol azydku. Do roztworu dodać przygotowany alkin fluoroforowy i podgrzać reakcję do 50 stopni Celsjusza. Następnie dodać do kolby 0,6 równoważnika siarczanu miedzi i 2,4 równoważnika kwasu askorbinowego.

Mieszać reakcję przez jedną godzinę lub do momentu, gdy analiza LCMS wykaże zakończenie reakcji. Następnie schłodzić i oczyścić reakcję zgodnie z rusztowaniem antybiotykowym. W tym miejscu przedstawiono kluczową reakcję chemiczną kliknięcia do przygotowania antybiotyków fluorescencyjnych z przykładami struktury zsyntetyzowanej z odpowiednich antybiotyków za pośrednictwem azydku pośredniego na bazie cyprofloksacyny, linezolidu i trimetoprimu.

W tych śladach spektrometrii mas chromatografii cieczowej z azydku cyprofloksacyny i reakcji kliknięcia alkinowego NBD, azydek eluowano po 3,2 minuty, a produkt eluowano po 3,8 minuty. Po postępie reakcji kliknięcia może nastąpić zanik piku azydku. W tych widmach wpływ oczyszczania można uwidocznić z zanikaniem błędnych pików.

Aby ocenić aktywność przeciwdrobnoustrojową zsyntetyzowanego antybiotyku, należy rozprowadzić zapasy glicerolu szczepów bakteryjnych odpowiednich dla rusztowania antybiotykowego na płytkach agarowych LB i hodować kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka wybierz pojedynczą kolonię z każdej płytki i hoduj kolonie przez noc w pięciu mililitrach CAMHB na kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia rozcieńczyć kultury około 40-krotnie w świeżym CAMHB i wyhodować bakterie do środkowej fazy logarytmicznej o gęstości optycznej 600 nanometrów między 0,4 a 0,8.

Następnie przygotuj roztwory podstawowe każdego antybiotyku fluorescencyjnego w stężeniu 1,28 miligrama na mililitr w 20% dimetylosulfotlenku w sterylnej wodzie i dodaj 10 mikrolitrów antybiotyku do każdej studzienki pierwszej kolumny 96-dołkowej płytki. Dodaj 90 mikrolitrów CAMHB do każdej studzienki pierwszej kolumny i 50 mikrolitrów do wszystkich pozostałych studzienek. Następnie wykonaj seryjne dwukrotne rozcieńczenie na płytce.

Po dokładnym wymieszaniu rozcieńczyć kultury środkowej fazy logarytmicznej do około jednego razy 10 do szóstych jednostek tworzących kolonię na mililitr i dodać 50 mikrolitrów każdej kultury do studzienek rozcieńczania, aby uzyskać końcowe stężenie około pięć razy 10 do piątych jednostek tworzących kolonię na mililitr. Gdy wszystkie bakterie zostaną platerowane, umieść pokrywki na płytkach i inkubuj kultury przez 18 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Następnego dnia sprawdź wzrokowo płyty.

Minimalne stężenie inhibicyjne będzie najniższym stężeniem studni bez widocznego wzrostu. W celu analizy akumulacji sondy, rozprowadź zapasy glicerolu szczepów bakteryjnych na płytkach agarowych LB w celu inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka wybierz pojedynczą kolonię z talerza do hodowli przez noc w bulionie lizogenicznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego ranka rozcieńczyć nocną kulturę około 50-krotnie w świeżej pożywce. Gdy kultura osiągnie środkową fazę logarytmiczną, należy granulować bakterie przez odwirowanie i zdekantować pożywkę. Ponownie zawiesić bakterie w jednym mililitrze PBS i ponownie odwirować bakterie.

Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić przemyty osad w PBS do gęstości optycznej 600 nanometrów dwóch. Dodaj 10,1 mikrolitra 10 milimolowego CCCP w PBS do jednego mililitra bakterii i inkubuj bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Pod koniec inkubacji zebrać bakterie przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 10 do 100 mikromolowych fluorescencyjnych roztworów antybiotyku w PBS.

Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza umyć komórki przez odwirowanie cztery razy w jednym mililitrze zimnego PBS na pranie. Po umyciu poddać bakterie lizie za pomocą 180 mikrolitrów buforu do lizy i 70 mikrolitrów lizozymu. Po 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza trzykrotnie zamroź i rozmroź bakterie w temperaturze minus 78 stopni Celsjusza przez pięć minut i 34 stopnie Celsjusza przez 15 minut.

Po ostatniej rundzie zamrażania i rozmrażania, sonikować próbkę przez 20 minut, a następnie 30-minutową inkubację w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zebrać zlizowaną próbkę przez odwirowanie i przecedzić zawartość probówki przez membranę filtracyjną o mocy 10 kilodaltonów. Umyj filtr cztery razy 100 mikrolitrami wody na pranie i porcjuj każde płukanie do indywidualnych dołków czarnej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem.

Następnie zmierz natężenie fluorescencji na czytniku płytkowym o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednich dla fluoroforu. Te typowe wyniki oceny akumulacji wewnątrzkomórkowej za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej w obecności i bez wypływu pokazują, że fluorescencja wewnątrzkomórkowa bakterii jest znacznie wyższa po wstępnym traktowaniu CCCP, co wskazuje, że wypływ zmniejsza akumulację w obrębie bakterii. Na tych reprezentatywnych obrazach mikroskopii konfokalnej bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych można uwidocznić lokalizację antybiotyku w bakteriach po leczeniu CCCP.

Zjawisko to nie jest obserwowane, gdy nie dodaje się CCCP. Stosując antybiotyki fluorescencyjne, należy pamiętać o tym, jakie informacje chcesz zebrać i zastanowić się, który protokół będzie najbardziej przydatny podczas uzyskiwania tych danych. Po ich syntezie antybiotyki fluorescencyjne mogą być stosowane do badania wielu procesów bakteryjnych, w tym interakcji docelowych leków i modyfikacji oporności.