Obrazowanie zmian morfologicznych u bakterii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek

Zacznij od posiewy bakteryjnej unieruchomionej pod agarozową płytą w misce ze szklanym dnem.

Błony bakteryjne są oznakowane barwnikami fluorescencyjnymi.

Bakterie są również zaprojektowane tak, aby wyrażać antysensowne RNA, które celuje w konkretne mRNA, hamując produkcję istotnego białka podziału komórkowego.

Dodaj kroplę oleju immersyjnego do obiektywu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

Włóż talerz do metalowej obudowy i zabezpiecz ją na scenie mikroskopu.

Podnieś obiektyw do momentu, gdy olej dotknie się naczynia, potem skup się na komórkach.

Użyj oprogramowania do obrazowania, aby ustawić stosy Z, aby przechwytywać obrazy na różnych głębokościach.

Zacznij robić zdjęcia poklatkowe fluorescencyjne.

W miarę jak komórki reagują na ekspresję antysensowego RNA, nie dzielą się i rozwijają opuchnięte kształty.

Organizacja błony ulega zaburzeniom, co prowadzi do nierównomiernej i ogniskowej fluorescencji, co wskazuje na wadliwy podział komórkowy.

Aby obrazować próbkę, użyj pokrętła ostrości do regulacji grubej, aby upewnić się, że obiektyw jest całkowicie opuszczony przed zainicjowaniem mikroskopu w oprogramowaniu mikroskopu. Włóż kroplę oleju o współczynniku załamania 1,517 do obiektywu zanurzającego 100X, a szklaną miskę z próbką przenieś do metalowej trumny.

Delikatnie wsuń talerz do zacisku scenicznego i użyj grubego pokrętła regulacji, aby podnieść obiektyw, aż olej dotknie szklanego dna talerza. Użyj okularu i pokrętła do precyzyjnej regulacji, aby ustawić próbkę w ostrości, a następnie przełączyć się na tryb aparatu. W oprogramowaniu obrazującym w oknie Resolve 3D wybierz ikonę Projekt/Uruchom Eksperyment.

Pojawi się nowe okno dialogowe zatytułowane Eksperyment projektowy/Biegnij. Otwórz zakładki Projekt i Przekrojowanie w oknie dialogowym, aby ustawić liczbę stosów Z i grubość próbki. Aby zmierzyć grubość komórek w próbce, stopniowo dostosowuj płaszczyznę Z, używając strzałek w górę i w dół w oknie dialogowym Resolve 3D, ustalając miejsce, w którym komórki się rozmywają, jako górne i dolne granice dla akwizycji obrazu.

Po dostosowaniu procentowej transmisji natężenia światła oraz czasu trwania ekspozycji dla wybranych kanałów w oknie dialogowym Resolve 3D, kliknij Listę punktów, aby otworzyć Listę punktów. W zakładkach Design i Time Lapse zaznacz pole Time Lapse i wprowadź parametry timelapse. Wybierz opcję listy Visit Point i wpisz punkty do zdjęcia w polu tekstowym, rozdzielając je przecinkami lub łącznikami, aby uzyskać kompletne sekwencje.

Następnie edytuj nazwy plików i lokalizacje plików na zakładce Uruchom i wybierz Odtwór w oknie dialogowym Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć eksperyment.