Name: Iteracyjna optymalizacja dupleksów DNA pod kątem krystalizacji kompleksów SeqA-DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj metodę optymalizacji dupleksów DNA pod kątem krystalizacji kompleksów białko-DNA z wykorzystaniem białka SeqA z E. coli. Protokół obejmuje projektowanie długości DNA, odstępów GATC oraz końców.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować personelowi PXRR w NSLS (Brookhaven National Laboratory) za pomoc podczas gromadzenia danych oraz Monice Pillon za pomoc w oczyszczaniu DNA. Praca ta była wspierana przez Canadian Institutes of Health Research (MOP 67189).

1. Oczyszczanie białek
Elastyczny łącznik łączący domeny N-końcową (oligomeryzacji) i C-końcową (wiązania DNA) białka SeqA wspomaga rozpoznawanie hemimetylowanych powtórzeń GATC oddzielonych od siebie od jednego do trzech obrotów helisy DNA. W niniejszym badaniu wykorzystano dimeryczny wariant SeqA (SeqAΔ(41-59)-A25R) z mutacją punktową w domenie N-końcowej, która zapobiega dalszej oligomeryzacji, oraz skróconym łącznikiem, który ogranicza wiązanie DNA wyłącznie do tandemowych powtórzeń GATC oddzielonych jednym obrotem helisy DNA (Rysunek 1)2,8.
<ol>
 <li>Przeprowadzić transformację komórek BL21 (DE3) plazmidem kodującym SeqA pod kontrolą promotora T7,</li>
 <li>Przenieść reakcję transformacji na płytki z agarem LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny,</li>
 <li>Wybrać zmieszane kolonie w celu zaszczepienia małkoskalowej hodowli nocnej (pożywka LB z 100 μg/ml ampicyliny),</li>
 <li>Następnego dnia zaszczepić 1 L pożywki, stosując rozcieńczenie 1:100 hodowli nocnej,</li>
 <li>Hodować komórki do osiągnięcia OD600 ok. 0,7 i indukować produkcję białka poprzez dodanie izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do stężenia końcowego 1 mM,</li>
 <li>Kontynuować inkubację przez 3 hr w 37 °C przy wytrząsaniu orbitalnym, a następnie zebrać komórki poprzez wirowanie (10 min przy 3 300 g),</li>
 <li>Resuspender osad komórkowy w buforze do oczyszczania A i poddać lizie metodą sonikacji,</li>
 <li>Oczyścić lizat poprzez wirowanie (40 min przy 39 000 g) i nałożyć nadsącz na kolumnę z heparyną równoważoną buforem do oczyszczania,</li>
 <li>Eluować SeqA za pomocą gradientu liniowego do 1 M NaCl (SeqA eluuje przy ok. 0,7 M NaCl),</li>
 <li>Połączyć frakcje zawierające SeqA, rozcieńczyć w celu obniżenia siły jonowej próbki i nałożyć na kolumnę do chromatografii wymiany kationowej równoważoną buforem do oczyszczania,</li>
 <li>Przy zastosowaniu liniowego gradientu soli, czyste SeqA eluuje przy ok. 0,4 M NaCl,</li>
 <li>Połączyć frakcje zawierające SeqA, skoncentrować (3 mg/ml) i przechowywać w buforze do przechowywania.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie DNA
<ol>
 <li>Zamów komplementarne niezmetylowane i zmetylowane oligonukleotydy od preferowanego dostawcy,</li>
 <li>Rozpuść 1 μmol każdego liofilizowanego pojedynczego pasma DNA w 800 μl autoklawowanej ddH2O, wymieszaj w wirówce typu vortex i odstaw na 10-20 min,</li>
 <li>Dodaj 800 μl podgrzanego 2X buforu do nakładania do każdego oligonukleotydu,</li>
 <li>Dla oligonukleotydów o długości 20-30 nukleotydów przygotuj duży 10% żel denaturujący (160 x 250 x 1 mm): 
 * Na jeden żel dokładnie wymieszaj 80 ml 10% mieszaniny PAGE, 80 μl TEMED i 800 μl persiarczanu amonu, a następnie wlej do formy, 
 * Po polimeryzacji wyjmij grzebień i dokładnie wypłucz oczka ddH2O, 
 * Zamontuj żele w kasecie, w tym płytkę chłodzącą, a następnie wypełnij górny i dolny zbiornik buforem do elektroforezy (1X TBE), 
 * Przeprowadź wstępną elektroforezę przy 700-750 V, aby rozgrzać żel do 55 °C, 
 * Zatrzymaj bieg i dokładnie wypłucz oczka buforem do elektroforezy.</li>
 <li>Podgrzej oligonukleotydy do 90 °C przez 2 min,</li>
 <li>Wymieszaj w wirówce typu vortex i odwiruj próbki bezpośrednio przed nałożeniem na żel,</li>
 <li>Prowadź elektroforezę przy ~700 V i zatrzymaj ją, gdy oligonukleotyd przemieści się do połowy żelu. (Należy pamiętać, że na 10% żelu poliakrylamidowym błękit bromofenolowy migruje równolegle z oligonukleotydami o długości ~20 zasad, a xylene cyanol FF z oligonukleotydami o długości ~60 zasad),</li>
 <li>Zatrzymaj elektroforezę, wyjmij żel z kasety i usuń dystanse,</li>
 <li>Kładąc żel na płaskiej powierzchni, zdejmij jedną płytkę szklaną i przykryj żel folią spożywczą,</li>
 <li>Obróć żel, zdejmij drugą płytkę szklaną i również ją przykryj folią spożywczą,</li>
 <li>Zaznacz prążki przy użyciu światła UV i płyty fluorescencyjnej umieszczonej za żelem, aby zobaczyć cień DNA,</li>
 <li>Wytnij prążek żyletką na małe kawałki i przenieś je do sterylnej probówki 15 ml,</li>
 <li>Dodaj 9 ml buforu do elucji i eluuj przez noc w 37 °C przy wytrząsaniu,</li>
 <li>Ostrożnie przenieś roztwór do autoklawowanej probówki wirówkowej, używając końcówki do nakładania na żel, aby uniknąć przeniesienia fragmentów akrylamidu, a następnie dodaj 1 ml 3 M octanu sodu o pH 7 (rozcieńczenie 1:10) oraz 25 ml schłodzonego 100% etanolu (2,5 objętości),</li>
 <li>Inkubuj w -20 °C przez co najmniej 3 h,</li>
 <li>Odwiruj i przenieś nadsącz do osobnej probówki,</li>
 <li>Osusz osad w wirówce próżniowej (speed-vac) przy średniej temperaturze,</li>
 <li>Resuspenduj osad w 400 μl autoklawowanej ddH2O i przenieś do nowej probówki,</li>
 <li>Dodaj 40 μl 3 M octanu sodu o pH 7 i 1 ml 100% etanolu; dokładnie wymieszaj (vortex) i inkubuj 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie 30 min w -20 °C,</li>
 <li>Wiruj przez 15 min przy 18 000 g i odlej nadsącz,</li>
 <li>Przepłucz osad 100 μl zimnego 70% etanolu, aby usunąć pozostałe sole, i wiruj przez 6 min przy 18 000 g. Odlej etanol i osusz osad w wirówce próżniowej,</li>
 <li>Resuspenduj osad w łącznej objętości 100 μl autoklawowanej ddH2O. Zmierz stężenie oligonukleotydu,</li>
 <li>Aby zhybrydyzować hemimetylowane dupleksy DNA, wymieszaj ekimolarne stężenia komplementarnych pojedynczych pasm i podgrzej mieszaniny do 95 °C w łaźni wodnej przez 5 min, a następnie pozwól im powoli ostygnąć do temperatury pokojowej w łaźni wodnej.</li>
</ol>
3. Tworzenie i analiza kompleksów białko-DNA
<ol>
 <li>Wymieszać równe objętości oczyszczonego białka SeqAΔ(41-59)-A25 (81 μM) i hemimetylowanego DNA (81 μM),</li>
 <li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min i przechowywać w 4 °C do momentu użycia,</li>
 <li>Przeprowadzić screening warunków krystalizacji przy użyciu komercyjnych zestawów do screeningu rzadkiej macierzy (sparse-matrix),</li>
 <li>Po zidentyfikowaniu wstępnych warunków prowadzących do krystalizacji, zoptymalizować je w celu wyhodowania kryształów o jakości dyfrakcyjnej,</li>
 <li>Krioprotektować otrzymane kryształy kompleksu SeqA-DNA poprzez zwiększenie ilości PEG 400 w roztworze krystalizacyjnym do stężenia końcowego 25% (v/v) lub dodanie 20% glicerolu (v/v) do roztworu krystalizacyjnego,</li>
 <li>Pobrać poszczególne kryształy za pomocą pętli nylonowej i gwałtownie zamrozić je w ciekłym azocie,</li>
 <li>Przetestować limit dyfrakcyjny każdego kryształu w temperaturze 100 K.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Aby uzyskać strukturę krystaliczną kompleksu SeqAΔ(41-59)-A25R związanego z hemimetylowanym DNA, kolejno optymalizowano trzy parametry DNA: (i) odstęp między hemimetylowanymi sekwencjami GATC; (ii) długość dupleksu oraz (iii) brak lub obecność nawisów 5'.
Analizy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej wskazują, że SeqAΔ(41-59)-A25R wiąże preferencyjnie powtórzenia GATC rozdzielone przez 9-10 par zasad (Rysunek 1). W związku z tym w pierwszej kolejności przebadano dupleksy o długości 23-24 par zasad (bps) zawierające dwie hemimetylowane sekwencje GATC rozdzielone przez 9 lub 10 bps. Trzy dupleksy pozwoliły na uzyskanie dobrze uformowanych kryształów (Rysunek 2). Choć żaden z kryształów nie dyfrakował w wysokiej rozdzielczości, dupleks o długości 23 bps z dwiema witrynami GATC rozdzielonymi przez 9 bps dyfrakował promienie rentgenowskie lepiej niż pozostałe, co wskazuje, że dla krystalizacji preferowany był odstęp GATC wynoszący 9 bps. Dlatego w następnych badaniach ustalono odstęp między sekwencjami GATC na poziomie 9 bps.
Zazwyczaj krystalizacji DNA sprzyja długość dupleksu odpowiadająca pełnym obrotom helisy, ponieważ wiele cząsteczek DNA może układać się jeden za drugim, tworząc ciągłe B-DNA wewnątrz kryształu9. Dlatego skrócono całkowitą długość dupleksów do 21 bps (i.e. dwa obroty helisy). Podczas gdy dupleks o długości 21 bps z tępymi końcami nie pozwolił na uzyskanie kryształów nadających się do dyfrakcji (dane nie pokazano), dupleks o długości 21 bps z pojedynczym nukleotydowym nawisem 5' na każdym końcu pozwolił na uzyskanie kryształów, które w naszym źródle domowym dyfrakowały do 5 Å. Poprawa granicy dyfrakcji sugerowała, że asocjacja dupleksów koniec-do-końca rzeczywiście sprzyjała upakowaniu kryształów.
Ponieważ SeqA oddziałuje z sekwencjami GATC znajdującymi się po tej samej stronie DNA, przeciwległa strona dupleksu DNA powinna być wystawiona na działanie rozpuszczalnika. Aby dodatkowo poprawić jakość kryształów kompleksu, zmodyfikowaliśmy sekwencję dupleksu, wprowadzając dinukleotyd CG pomiędzy dwa miejsca GATC w celu promowania oddziaływań między bruzdą a szkieletem sąsiednich cząsteczek DNA w krysztale poprzez przeciwległą stronę dupleksu; jest to metoda stosowana w przeszłości w celu usprawnienia krystalizacji DNA10. Jednakże granica dyfrakcyjna kryształów wyhodowanych z dupleksem zawierającym CG była identyczna jak w przypadku kryształów wyhodowanych z podobnym dupleksem DNA, który nie zawierał dinukleotydu CG (Ryc. 3). Wynik ten wskazał, że oddziaływania między bruzdą a szkieletem nie były w tym przypadku istotne. Następnie zoptymalizowaliśmy długość nawisów, porównując kryształy wyhodowane z dupleksem DNA posiadającym dwa dodatkowe nukleotydy na każdym końcu 5'. Zmiana ta miała drastyczny wpływ na morfologię kryształów, a także na granicę dyfrakcyjną, co wskazuje, że dodatkowe nukleotydy znacząco zmieniły kontakty molekularne i poprawiły organizację kryształu (Ryc. 3).
Struktura krystaliczna białka SeqAΔ(41-59)-A25R związanego z tym ostatnim dupleksem DNA potwierdziła, że wolna powierzchnia dupleksu DNA nie bierze udziału w kontaktach krystalicznych, co było spodziewane ze względu na ograniczony efekt wprowadzenia dinukleotydu CG. Pomimo względnych rozmiarów białka i DNA, większość oddziaływań między partnerami symetrii jest zapośredniczona przez interakcje białko-białko oraz białko-DNA (Rycina 4). Co ciekawe, w tym konkretnym przypadku korzystny efekt 5'-nawisu dinukleotydowego nie wynika z utworzenia pseudo-ciągłego DNA. Zamiast tego koniec 5' zmetylowanej nici jest skierowany z dala od osi DNA i oddziałuje z proksymalną cząsteczką SeqA w kompleksie, co wyjaśnia, dlaczego do zmiany upakowania kryształów niezbędne były dokładnie dwa nukleotydy8,11.
<img alt="Analiza kompleksu SeqA-DNA; wyniki elektroforezy żelowej; oligomeryzacja, miejsca rozpoznawania GATC." src="/files/ftp_upload/4266/4266fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wiązanie SeqAΔ(41-59)-A25R z hemimetylowanym DNA. (A) Schemat domen białka SeqA pośredniczących w oligomeryzacji białka i wiązaniu DNA. (B) Analiza przesunięcia mobilności elektroforetycznej SeqAΔ(41-59)-A25R z cząsteczkami DNA zawierającymi dwie hemimetylowane sekwencje GATC rozdzielone rosnącą liczbą par zasad (X). Najlewsza ścieżka (oznaczona jako Blank) zawiera ekvimolarną mieszaninę DNA z 5, 7, 12, 21, 25 i 34 parami zasad między dwiema sekwencjami GATC w obecności SeqAΔ(41-59)-A25R. (C) Schemat przedstawiający trzy zmienne zoptymalizowane w dupleksach DNA w celu uzyskania kryształów o jakości dyfrakcyjnej.
<img alt="Tabela z danymi krystalograficznymi: sekwencje DNA, obrazy kryształów, wzory dyfrakcyjne, granice rozdzielczości." src="/files/ftp_upload/4266/4266fig2.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Efekt zmiany odległości między sekwencjami GATC. Podsumowanie użytych oligonukleotydów oraz uzyskanych kryształów dla dupleksów o długości 23-24 bp zawierających dwa hemimetylowane miejsca GATC oddzielone od siebie o 9 lub 10 par zasad. Wszystkie zdjęcia kryształów wykonano przy tym samym powiększeniu, a pasek skali wskazuje 100 μm. Granica rozdzielczości każdego kryształu SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA została określona na podstawie obrazów dyfrakcyjnych zebranych przy użyciu systemu generatora promieni rentgenowskich Rigaku RU-300. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
<img alt="Analiza sekwencji DNA, wyniki wzrostu kryształów, wzory dyfrakcyjne, granice rozdzielczości w angstremach." src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wpływ modyfikacji końców DNA. Podsumowanie użytych oligonukleotydów oraz otrzymanych kryształów dla dupleksów o długości 21 bp, zawierających dwa hemimetylowane miejsca GATC rozdzielone 9 parami zasad i obejmujących 0, 1 lub 2 nukleotydy nawisowe na końcu 5'. Wszystkie zdjęcia kryształów wykonano przy tym samym powiększeniu; pasek skali wskazuje 100 μm. Granica rozdzielczości każdego kryształu SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA została określona na podstawie obrazów dyfrakcyjnych zebranych na liniach wiązek X12C i X29 (NSLS, BNL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
<img alt="Schemat struktury kompleksu białko-DNA, przedstawiający modele oddziaływań molekularnych w różnych rzutach." src="/files/ftp_upload/4266/4266fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Upakowanie kryształu SeqAΔ(41-59)-A25R związanego z DNA z dinukleotydowym nawisem: Widok z góry (A) oraz z boku (B). Jednostka asymetryczna zawiera dwa kompleksy SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA, w których białko przedstawiono w kolorze szarym, a DNA w kolorze pomarańczowym. Cząsteczki SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA powiązane symetrią przedstawiono w kolorze białym dla białka i żółtym dla DNA. Rycina została przygotowana przy użyciu programu PyMOL12. Rycina ta odnosi się do Filmu 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę</a>.
Film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266movie1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić film</a>.

<ol><li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li>
<li>Guarné, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament%3A+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li>
<li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li>
<li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li>
<li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2%2FMCM1%2FDNA+ternary+complex%3A+general+methods+and+principles+for+protein%2FDNA+cocrystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li>
<li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex%3A+a+protein-induced+DNA+U-turn%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li>
<li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li>
<li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li>
<li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+self-fitting%3A+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li>
<li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li>
<li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeLano%2C+WL+%22The+PyMOL+Molecular+Graphic+Systems%22">The PyMOL Molecular Graphic Systems</a>. , DeLano Scientific. (2002).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Jednym z największych wyzwań w makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej jest uzyskanie kryształów o jakości dyfrakcyjnej. W przypadku białek lub kompleksów białko-DNA wyzwanie to jest potęgowane przez dodatkowe zmienne, które muszą zostać zoptymalizowane. Powszechnie uważa się, że głównymi parametrami do optymalizacji są długość DNA oraz obecność lepkich nawisów, które zwiększają asocjację sąsiednich cząsteczek DNA w dłuższym pseudo-dupleksie. Wykazaliśmy jednak, że natura i długość tych nawisów mogą mieć dodatkow...

<table><tbody><tr><td>TRIS</td><td>Bioshop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E478-500</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0058</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Caledon</td><td>5350-1</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.500</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sklep biotechnologiczny</td><td>URE001.5</td><td></td></tr><tr><td>40% bisakryloamid/akryloamid 29:1</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>A0007-500ml</td><td>Przechowywać w temperaturze 4°C &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>EMD</td><td>BX0865-1</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen cyanol FF</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0423</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Bioshop</td><td>BR0222</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny regulowany pionowy system elektroforezy żelowej</td><td>C.B.C. Scientific Company Inc.</td><td>DASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Ekran krystalizacji indeksowej</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>Przechowywać w temperaturze 4°C &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ekran krystalizacji Wizard I</td><td>Emerald BioSystems</td><td>EBS-WIZ-1</td><td>Przechowywać w temperaturze 4°C &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ekran krystalizacji Wizard II</td><td>Emerald BioSystems</td><td>EBS-WIZ-2</td><td>Przechowywać w temperaturze 4°C &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ekran krystalizacji Classics</td><td>Qiagen</td><td>130701</td><td>Przechowywać w temperaturze 4°C &amp;deg;C</td></tr><tr><td>płytki Intelliplate </td><td>Instrumenty Art Robbins</td><td>102-0001-00</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Roztwory&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę wprowadzić tekst źródłowy do tłumaczenia. Jestem gotowy do przetłumaczenia zawartości JoVE z zachowaniem najwyższych standardów naukowych, precyzji terminologicznej oraz akademickiego stylu języka polskiego.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Bufor do oczyszczania białek: &lt;/strong&gt;100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT i 5% glicerolu.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy z materiałów JoVE, który mam przetłumaczyć. Czekam na treść do tłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Bufor do przechowywania białek: &lt;/strong&gt;20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA i 5% glicerolu.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Mieszanina do ładowania żelu: &lt;/strong&gt;Do 70 ml autoklawowanej wody ddH dodać 20 g sacharozy, 25 mg błękitu bromofenolowego, 25 mg xylene cyanol FF, 1 ml 10% (m/v) SDS oraz 10 ml 10X TBE.&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Mieszać przy umiarkowanym podgrzewaniu do czasu rozpuszczenia sacharozy, a następnie uzupełnić objętość końcową do 100 ml za pomocą autoklawowanej wody ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Przechowywać w temperaturze 4°C &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;bufor do nakładania 2X:&lt;/strong&gt; Do 10 ml mieszaniny do ładowania żelu dodać 11 g mocznika. Mieszać na płycie grzejnej do czasu rozpuszczenia mocznika. Rozdzielić do probówek o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze 4°C. &amp;deg;C. &lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;mieszanina 10X PAGE:&lt;/strong&gt; Wymieszać 420,4 g mocznika, 100 ml 10X TBE (autoklawowanego) oraz 250 ml 40% bis-akryloamidu w stosunku 29:1 w ddH2O.&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Mieszaj do całkowitego rozpuszczenia i dopełnij objętość do 1 litra. Przechowywać w ciemnych butelkach w temperaturze 4°C. &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przetłumaczenia materiałów zgodnie z Twoimi wytycznymi, dbając o precyzję terminologiczną, akademicki rejestr języka polskiego oraz wierność protokołom badawczym.&quot;&gt;&lt;silny&gt;10X TBE: &lt;/strong&gt;Rozpuścić&lt;silny&gt; &lt;/strong&gt;108 g&lt;silny&gt; &lt;/strong&gt;TRIS, 55 g kwasu borowego i 9,3 g EDTA w 1 litrze ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Autoklawować i przechowywać w temperaturze pokojowej.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać treść do przetłumaczenia. Czekam na materiał źródłowy w języku angielskim, aby przygotować profesjonalne tłumaczenie na język polski zgodnie z Pana/Pani wytycznymi.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Bufor elucyjny: &lt;/strong&gt;Rozcieńczyć 8 ml 5 M NaCl, 2 ml 1 M TRIS pH 7,5 oraz 0,4 ml 0,5 M EDTA pH 8 w 200 ml ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Autoklawować i przechowywać w temperaturze pokojowej.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

iteracyjna optymalizacja dupleksów dna w celu krystalizacji kompleksów seqa-dna

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Escherichia coli SeqA jest negatywnym regulatorem replikacji DNA, który zapobiega przedwczesnym zdarzeniom reinicjacji poprzez sekwestrację hemimetylowanych klastrów GATC w obrębie miejsca inicjacji replikacji1. Poza miejscem inicjacji, SeqA znajduje się w widełkach replikacyjnych, gdzie organizuje nowo zreplikowany DNA w struktury wyższego rzędu2. SeqA wiąże się tylko słabo z pojedynczymi sekwencjami GATC, ale tworzy kompleksy o wysokim powinowactwie z dupleksami DNA zawierającymi wiele miejsc GATC. Minimalną jednostką funkcjonalną i strukturalną SeqA jest dimer, co wyjaśnia wymóg obecności co najmniej dwóch sekwencji GATC do utworzenia kompleksu o wysokim powinowactwie z hemimetylowanym DNA3. Dodatkowo architektura SeqA, z domenami oligomeryzacji i wiązania DNA rozdzielonymi elastycznym łącznikiem, umożliwia wiązanie powtórzeń GATC oddzielonych od siebie do trzech obrotów helisy. Dlatego zrozumienie funkcji SeqA na poziomie molekularnym wymaga analizy strukturalnej SeqA związanego z wieloma sekwencjami GATC. W krystalizacji kompleksów białko-DNA, DNA może nie mieć lub mieć wyjątkowy wpływ na oddziaływania upakowania, w zależności od względnych rozmiarów i architektury białka oraz DNA. Jeśli białko jest większe od DNA lub zakrywa większość nici DNA, upakowanie kryształu jest zapośredniczone głównie przez oddziaływania białko-białko. I odwrotnie, gdy białko jest tej samej wielkości lub mniejsze od DNA lub zakrywa tylko część DNA, w upakowaniu kryształu dominują oddziaływania DNA-DNA oraz DNA-białko. W związku z tym krystalizacja kompleksów białko-DNA wymaga systematycznego przesiewu długości DNA4 oraz końców DNA (tępych lub z nawisami)5-7. W niniejszym raporcie opisujemy sposób projektowania, optymalizacji, oczyszczania i krystalizacji hemimetylowanych dupleksów DNA zawierających tandemowe powtórzenia GATC w kompleksie z dimerycznym wariantem SeqA (SeqAΔ(41-59)-A25R) w celu uzyskania kryształów odpowiednich do wyznaczenia struktury.

Struktura krystaliczna kompleksów białko–DNA może dostarczyć informacji na temat funkcji i mechanizmu działania białka, a także charakteru specyficznej interakcji. W niniejszym materiale opisujemy sposób optymalizacji długości, sekwencji i końców dwuniciowego DNA w celu kokrystalizacji z białkiem SeqA z Escherichia coli, które jest negatywnym regulatorem inicjacji replikacji.

Iteracyjna optymalizacja dupleksów DNA w celu krystalizacji kompleksów SeqA-DNA

Białko SeqA Escherichia coli jest negatywnym regulatorem replikacji DNA, który zapobiega przedwczesnym zdarzeniom reinicjacji poprzez sekwestrację hemimetylowanych klastrów GATC ...

Niniejszy eksperyment szczegółowo opisuje sposób otrzymywania kryształów białka związanego z DNA zawierającym tandemowo półmetylowane sekwencje GATC o jakości dyfrakcyjnej. Powtórzenia mają na celu sprzyjanie upakowaniu kryształów kompleksu białko-DNA. Procedurę rozpoczyna się od racjonalnego zaprojektowania długości DNA, odstępów GATC oraz końców DNA, następnie wykorzystuje się komplementarne jednoniciowe oligonukleotydy do oczyszczenia DNA, a następnie przeprowadza anelowanie w celu utworzenia półmetylowanego dupleksu DNA, po czym dodaje się oczyszczone białko seq A w celu utworzenia kompleksu.Następnie należy dobrać optymalne warunki do hodowli kryształów kompleksu białko-DNA o jakości dyfrakcyjnej, przeprowadzając próby krystalizacji z użyciem komercyjnych ekranów matryc rzadkich (sparse matrix screens). Przedstawiono uzyskane wyniki. Omówiono wpływ zmiennej długości DNA, odstępów GATC oraz końców na jakość dyfrakcyjną kryształów CQ A DNA.Celem niniejszej pracy jest otrzymanie kryształów CK związanej z DNA o jakości dyfrakcyjnej, jednak może ona również pomóc w zrozumieniu ogólnych zmiennych, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania dupleksów DNA do krystalizacji inny

iterative-optimization-dna-duplexes-for-crystallization-seqa-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Iteracyjna optymalizacja dwuniciowych struktur DNA dla krystalizacji kompleksów SeqA-DNA

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Pakiet oprogramowania 3DNA jest popularnym i wszechstronnym narzędziem bioinformatycznym umożliwiającym analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły dla wybranych nowych i popularnych funkcji dostępnych w 3DNA, które można zastosować zarówno do pojedynczych struktur, jak i zespołów struktur powiązanych.

Analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych przy użyciu programu 3DNA

Tutaj opisujemy ogólną metodę losowego przesiewania matryc mikronasion. Wykazano, że technika ta znacznie zwiększa wskaźnik sukcesu eksperymentów przesiewowych krystalizacji białek, zmniejsza potrzebę optymalizacji i zapewnia niezawodne dostarczanie kryształów do zbierania danych i eksperymentów z moczeniem ligandów.

Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion

Kafelkowanie DNA jest skutecznym podejściem do tworzenia programowalnych nanostruktur. Opisujemy protokoły konstruowania złożonych dwuwymiarowych kształtów poprzez samoorganizację jednoniciowych płytek DNA.

Samoorganizacja złożonych dwuwymiarowych kształtów z jednoniciowych płytek DNA

Opisujemy tutaj test polegający na sprzężeniu identyfikacji metylotransferazy adeninowej DNA (DamID) z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (DamID-seq). Ta ulepszona metoda zapewnia wyższą rozdzielczość i szerszy zakres dynamiki oraz umożliwia analizowanie danych DamID-seq w połączeniu z innymi danymi sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takimi jak ChIP-seq, RNA-seq itp.

DamID-seq: Mapowanie interakcji białko-DNA w całym genomie poprzez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie fragmentów DNA metylowanych adeniną

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół ligacji T4 i denaturacji PAGE oczyszczania małych kolistych cząsteczek DNA, wyżarzania i natywnej analizy PAGE okrągłych płytek, montażu i obrazowania AFM nanostruktur DNA 1D i 2D, a także elektroforezy w żelu agarozowym i wirowania oczyszczania skończonych nanostruktur DNA.

Stabilne motywy DNA, nanostruktury 1D i 2D zbudowane z małych kolistych cząsteczek DNA

Celem tego artykułu jest dać widzowi solidne zrozumienie, jak przekształcić ich protokół małej objętości dyfuzji parowej, do hodowli dużych, pojedynczych kryształów białka, w metodę mikrokrystalizacji wsadowej o dużej objętości dla krystalografii szeregowej.

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych kondensatów biomolekularnych składających się z amfifilowych nanogwiazd DNA, zaczynając od ich składowych oligonukleotydów DNA. Kondensaty są wytwarzane z pojedynczego składnika nanogwiazdy lub dwóch składników i są modyfikowane w celu podtrzymania transkrypcji RNA in vitro z osadzonej matrycy DNA.

Syntetyczne kondensaty i architektury podobne do komórek z amfifilowych nanostruktur DNA

Struktura trójwymiarowa cząsteczki pozwala na unikalne zrozumienie sposobu jej funkcjonowania. Główną metodą wyznaczania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej jest krystalografia rentgenowska. W niniejszym materiale prezentujemy aktualne metody otrzymywania kryształów trójwymiarowych dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Poznaj metodę optymalizacji dupleksów DNA pod kątem krystalizacji kompleksów białko-DNA z wykorzystaniem białka SeqA z E. coli. Protokół obejmuje projektowanie długości DNA, odstępów GATC oraz końców.

Iteracyjna optymalizacja dupleksów DNA w celu krystalizacji kompleksów SeqA-DNA

Przeglądaj więcej filmów