Iteracyjna optymalizacja dupleksów DNA pod kątem krystalizacji kompleksów SeqA-DNA

W tym eksperymencie szczegółowo opisano, w jaki sposób uzyskać kryształy o jakości dyfrakcyjnej białka związanego z DNA zawierającego metylowany rąbek tandemowy. GATC. Powtórz tę czynność, aby sprzyjać upakowaniu kryształów kompleksu białkowego DNA. Zacznij od racjonalnego zaprojektowania długości DNA, odstępów GATC i końców DNA, przejdź do komplementarnych jednoniciowych oligonukleotydów, aby oczyścić DNA, a następnie anele w celu utworzenia dupleksu metylowanego DNA hemi, a następnie wymieszaj z oczyszczonym sekwencją A, aby utworzyć kompleks.

Następnie znajdź optymalne warunki do wyhodowania kryształów o jakości dyfrakcyjnej kompleksu białkowego DNA za pomocą prób krystalizacji przy użyciu komercyjnych rzadkich ekranów matrycowych. Wykazane wyniki. Podziel się wpływem różnej długości DNA, odstępów i końców GATC na jakość dyfrakcyjną kryształów CQ A DNA.

Celem tej pracy jest uzyskanie kryształów o jakości dyfrakcyjnej CK związanych z DNA, ale może również pomóc w zrozumieniu ogólnych zmiennych, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania dupleksów DNA do krystalizacji innych kompleksów białkowych DNA, demonstrując tę procedurę w Chang, A dla doktoranta z mojego laboratorium. W tym badaniu wykorzystano wariant białek regulatorowych replikacji DNA. Szukaj a, który tworzy stabilne dimery i ma skrócony region łącznikowy między jego domenami i domenami wiążącymi DNA.

Ten wariant ogranicza wiązanie DNA do tandemowych powtórzeń GATC oddzielonych wyłącznie jednym obrotem DNA, najpierw przekształcaj BBL 20 1D trzy komórki z plazmidem kodującym DEMETRIC seq A pod kontrolą płytki promotorowej T seven. Reakcja przemiany na płytkach agarowych LB zawierających 100 mikrogramów na mililitr, ampicylinę i umieścić na noc w inkubatorze bakteryjnym. Wybierz mieszane kolonie i rozpocznij hodowlę na małą skalę przez noc.

Następnego ranka zaszczepiacz jeden litr kultury z 10 mililitrami nocnego inokulum. Gdy hodowla jest w fazie logarytmicznej, dodaj dwa mililitry 0,5 molowego IPTG, aby indukować produkcję białka. Kontynuuj inkubację przez trzy godziny w wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 3,300 G przez 10 minut. Reese, zawiesić paletę komórek w oczyszczaniu, buforować kłamstwa przez sonikację i usunąć lizat przez odwirowanie w temperaturze 39 000 razy G przez 40 minut. Teraz załaduj supernatant S do kolumny z heparyną zrównoważoną buforem oczyszczającym.

Aby wymyć białko CK. Użyj gradientu liniowego do jednego molowego białka chlorku sodu CK, które wymywa się przy około 0,7 molowym chlorku sodu. Wyciągnąć frakcje zawierające CK i rozcieńczyć, aby obniżyć siłę jonową próbki.

Następnie załadować próbkę do kolumny E do chromatografii kationowymiennej, utożsamianej z buforem oczyszczającym. Zastosuj liniowy gradient soli, aby zapętlić czyste białko CK przy około 0,4 molowym chlorku sodu. Połączyć CK zawierający frakcje.

Skoncentruj się do trzech miligramów na mililitr i przechowuj w magazynie. Konstrukcja buforu komplementarnego niemetylowanego i metylowanego oligonukleotydu. Przygotuj próbki po jednym mikromolu każdej liofilizowanej pojedynczej nici DNA w 800 mikrolitrach autoklawu, podwójnie destylowanym wirze wodnym i odstaw na 15 minut i 800 mikrolitrów.

Po dwukrotnym podgrzaniu buforu ładującego do każdej próbki dla 20 do 30 oligonukleotydów nukleotydowych o długości przygotuj duży 10% żel denaturujący. Po polimeryzacji wyjmij grzebień i dokładnie spłucz studzienkę. Zmontuj żel, napełniając górny i dolny zbiornik jednorazowym buforem do pracy TBE.

Uruchom żel pod napięciem 750 woltów, aby rozgrzać żel do 55 stopni Celsjusza. Następnie zatrzymaj bieg i dokładnie przepłucz studzienki pracującym buforem. Teraz podgrzej oligonukleotydy do 90 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Wiruj i wiruj. Próbki natychmiast przystępują do załadowania żelu. Uruchom żel pod napięciem około 700 woltów, aż oligonukleotyd będzie migrował.

W połowie drogi na 10% żelu poliakrylamidowym błękit fenolowy alph co migruje z oligonukleotydami o długości około 20 zasad i ksylem ff o długości około 60 zasad. Zdemontuj żel z aparatu i usuń przekładki na płaskiej powierzchni. Wyjmij jedną szklaną płytkę i przykryj żel folią.

Następnie odwróć żel, wyjmij drugą szklaną płytkę i przykryj żel folią. Następnie oznacz pasma za pomocą światła UV i fluorescencyjnej płytki za żelem. Aby zobaczyć cień DNA za pomocą żyletki, odetnij opaskę i pokrój ją na małe kawałki.

Przenieś każdą próbkę do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodać dziewięć mililitrów buforu elucjańskiego i rozcieńczyć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem. Ostrożnie przenieś roztwór do probówki wirówkowej autoklawu za pomocą końcówki pipety z żelem.

Aby uniknąć przenoszenia kawałków akrylamidu, dodaj jeden mililitr trzech milioctanu sodu o pH siedem plus 25 mililitrów schłodzonego 100% etanolu inkubuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny. Odwirować wytrącone DNA. Następnie wysuszyć granulki na odkurzaczu speed vac na średnim ogniu, ponownie zawiesić każdą granulkę w 400 mikrolitrach autoklawu, podwójnie destylowanej wody i przenieść do świeżej probówki.

Dodać 40 mikrolitrów trzech molowych octanów sodu o pH siedem i jeden mililitr wiru 100% etanolu i inkubować przez 30 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza po odwirowaniu przez 15 minut po 18 000 razy. G, przepłucz granulki DNA 100 mikrolitrami 70% zimnego etanolu, aby usunąć resztki soli przez sześć minut po 18 000 razy. G następnie wyrzuć etanol i wysusz granulki w odkurzaczu szybkoobrotowym.

Teraz ponownie wyślij każdą granulkę w 100 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody w autoklawie. Określić stężenie oligonukleotydów za pomocą spektrometrii. Aby przygotować dupleksy metylowanego DNA hemi, najpierw wymieszaj równe stężenia molo komplementarnych pojedynczych nici.

Następnie podgrzej mieszaniny do 95 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez pięć minut, aby anilować pasma. Pozwól próbkom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej Wewnątrz łaźni wodnej. Połącz równe objętości 81 mikromolowego oczyszczonego białka CQ a i 81 mikromolowego hem metylowanego DNA.

Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia sita do krystalizacji przy użyciu komercyjnych ekranów z rzadką matrycą. Po zidentyfikowaniu początkowych przewodów krystalizacji zoptymalizuj warunki do wzrostu kryształów o jakości dyfrakcyjnej, aby płakać i chronić powstałe kryształy DNA CK.

Albo zwiększyć ilość PEG 400 obecnego w roztworze krystalizacyjnym do końcowego stężenia 25%, albo dodać 20% glicerolu do roztworu krystalizacyjnego. Zgarnij pojedyncze kryształy za pomocą nylonowej pętli błyskowej. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie.

Teraz przetestuj granicę dyfrakcji każdego kryształu w temperaturze 100 k. Aby uzyskać strukturę krystaliczną skróconego mutanta CK związanego z metylowanym DNA Hemi, kolejno optymalizujemy trzy parametry DNA, odstępy między sekwencjami GATC metylowanymi Hemi, długość dupleksu oraz brak lub obecność pięciu nawisów pierwotnych. W tym badaniu wykorzystano wariant DME seek a z mutacją punktową w domenie końcowej, która zapobiega dalszej więzadłości i skróconemu łącznikowi, który ogranicza wiązanie DNA do tandemu.

Powtórzenia GATC oddzielone wyłącznie jednym zwojem w testach przesunięcia elektromobilności DNA wskazują, że zmodyfikowane białko CK preferencyjnie wiąże powtórzenia GATC oddzielone od dziewięciu do 10 par zasad. Dlatego początkowe ekrany wykorzystują dupleksy o długości od 23 do 24 par zasad zawierających dwie metylowane rąbki. Powtórzenia GATC oddzielone dziewięcioma lub dziesięcioma parami zasad.

Trzy dupleksy dały ładnie ukształtowane kryształy. Podczas gdy żaden z kryształów nie odchylił się do wysokiej rozdzielczości. Dane wskazały, że separacja dziewięciu par zasad A-G-A-T-C była preferowana do krystalizacji, nieoczekiwanie wzmacniając interakcje szkieletu rowka poprzez włączenie dinukleotydu CG między dwoma miejscami GATC, co nie zmieniło limitu dyfrakcji kryształów.

W przeciwieństwie do tego, optymalizacja długości nawisów radykalnie zmieniła kontakty molekularne i morfologię kryształów. Struktura krystaliczna tego białka CK związana z hem metylowanego dupleksu DNA potwierdziła, że wolna powierzchnia dupleksu DNA nie angażuje się w kontakty kryształów pomimo względnej wielkości białka i DNA, większość interakcji między kolegami symetrii odbywa się za pośrednictwem białek, białek i białek DNA. Co ciekawe, w tym konkretnym przypadku korzystny wpływ nawisu pięciu pierwszych dinukleotydów nie wynika z tworzenia pseudo ciągłego DNA.

Zamiast tego pięć głównych końców metylowanej nici wystaje z osi DNA i oddziałuje z proksymalną cząsteczką CK kompleksu, co wyjaśnia, dlaczego dwa nukleotydy były ściśle wymagane do zmiany upakowania kryształów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyszczać białka i projektować dupleksy DNA do krystalizacji kompleksu białek DNA. Ważne jest, aby pamiętać, że chociaż protokół ten był urządzeniem do krystalizacji kompleksu DNA CK, racjonalna optymalizacja sekwencji długości i końców DNA zapewnia ogólne ramy dla projektowania dupleksów DNA do krystalizacji innych kompleksów białkowych DNA.