Badanie pozytywnej i negatywnej selekcji w grasicy metodą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest badanie rozwoju grasicy u myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z grasicy i śledziony myszy. W drugim kroku tymocyty i limfocyty są barwione koktajlem przeciwciał w celu identyfikacji specyficznych populacji komórek grasicy.

W ostateczności częstotliwość i liczebność różnych populacji limfocytów można ocenić za pomocą analizy cytometrycznej przepływowej. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju limfocytów T, takie jak to, które geny i szlaki sygnałowe są istotne dla generowania funkcjonalnego, a jednocześnie tolerancyjnego repertuaru limfocytów T. Chociaż metoda ta umożliwia wgląd w rozwój limfocytów T w grasicy, może być ona również zastosowana w badaniu rozwoju innych komórek odpornościowych.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności podczas projektowania koktajli przeciwciał do cytometrii przepływowej. Przed przystąpieniem do sekcji umieść sterylną stalową siatkę w płytce Petriego o wymiarach 60 by 15 mm. Następnie dodaj do płytki 5 mL HBSS i przechowuj ją w lodzie w celu pobrania grasicy.

W pierwszej kolejności za pomocą pęsety unieś dolny brzeg mostka, aby odsłonić przeponę. Następnie, unikając wątroby, przetnij przeponę, aby oddzielić klatkę piersiową, a następnie przetnij klatkę piersiową w kierunku górnym po obu stronach. Należy przy tym uważać, aby nie uszkodzić płuc i serca.

Teraz za pomocą pęsety delikatnie odciągnij klatkę piersiową. Grudraszka jest białym, dwupłatowym organem znajdującym się nad sercem. Użyj płaskiej krawędzi pęsety, aby chwycić dół płatów.

Następnie delikatnie wyciągnij grasicę i umieść ją na jednym z wcześniej przygotowanych sitkach. Aby pobrać śledzionę, wykonaj nacięcie przez otrzewną, aby odsłonić jamę brzuszną. Śledziona to czerwony narząd w kształcie deski surfingowej, znajdujący się po lewej stronie jamy brzusznej myszy, poniżej wątroby.

Następnie za pomocą jednej pary pęsety wyciągnij śledzionę, a drugą oddziel tkankę łączną. Następnie umieść wypreparowaną śledzionę na oddzielnym sicie mesh. Teraz użyj tłoka z strzykawki 3 ml, aby rozetrzeć każdy organ na sicie, aż pozostanie jedynie tkanka łączna i tłuszcz; pobierz komórki wraz z HBSS do probówki stożkowej 15 ml.

Następnie każdą siatkę należy wypłukać świeżym HBS S trzykrotnie. Dalej, komórki należy odwirować przez pięć minut przy 335 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odessaniu supernatantu, zawiesinę komórkową należy resuspender w 500 µL buforu do lizy CK przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby doszło do lizy erytrocytów śledzionowych.

Zawiesić tymocyty w stężeniu 20 × 10⁶ komórek na ml w buforze FACS i odstawić na lód. Następnie dodać 5 ml HBSS, aby przywrócić izotoniczność komórek, po czym ponownie odwirować zawiesinę. Osad wolny od erytrocytów ponownie zawiesić w stężeniu 20 × 10⁶ komórek na ml w buforze FACS. Rozpocząć ten etap od alikwotowania.

Do każdej studzienki płytki 96-dołkowej należy przenieść 4×10⁶ zarezerwowanych TYMOCYTÓW na próbkę do cytometrii przepływowej. Następnie do studzienek płytki 96-dołkowej należy dodać cytes w celu przygotowania kontroli kompensacji. Po tym zablokować receptory FC w każdej z próbek komórek poprzez inkubację z przeciwciałem anty-CD 1632 przez 10 minut w lodzie.

Następnie odwiruj płytkę, a potem usuń ciecz z dołków poprzez jednokrotne energiczne potrząśnięcie płytką odwróconą do góry dnem nad zlewem. Po tym resuspenduj zawartość każdego dołka w 200 µL buforu FACS i powtórz etap płukania. Następnie inkubuj próbki eksperymentalne z 200 µL koktajlu przeciwciał lub pojedynczymi przeciwciałami koniugowanymi z fluorochromami w przypadku kontroli kompensacji. Wszystkie etapy należy przeprowadzać w buforze FACS, w ciemności i w temperaturze 0-4 °C.

Po 30 minutach przemyj komórki dwukrotnie buforem FACS, a następnie, po ponownym zawieszeniu komórek w buforze FACS, przenieś próbki do probówek do FACS w przypadku fizjologicznych modeli transgenicznych TCR oraz myszy typu dzikiego. Selekcja pozytywna rozpoczyna się na etapie DP bright (podwójnie pozytywnych jasnych), przed przejściem do etapu DP dull (podwójnie pozytywnych ciemnych). Po kontakcie z antygenem tymocyty DP dull wchodzą w przejściowy etap CD4+ CD8low, zanim przekształcą się w komórki CD4+.

Tymocyty pojedynczo dodatnie (single positive) lub pojedynczo dodatnie pod kątem CD8; dojrzałe tymocyty pojedynczo dodatnie charakteryzują się wysoką ekspresją TCR oraz utratą CD24. Podczas gdy profil CD8 względem CD4 może ujawnić defekty w selekcji pozytywnej, analiza TCR beta względem CD69 lub CD5 może dostarczyć dalszych informacji na temat lokalizacji defektu. Zarówno CD69, jak i CD5 ulegają nadekspresji po stymulacji TCR, przy czym silniejsze interakcje prowadzą do wyższej ekspresji tych markerów.

Na tym wykresie TCR beta względem CD 69 u myszy typu dzikiego, bramka TCR beta low CD 69 negative reprezentuje populację podwójnie dodatnich tymocytów przed selekcją. Z kolei bramka TCR beta intermediate CD 69 positive reprezentuje populację przejściową bezpośrednio po zaangażowaniu TCR i składa się z komórek double positive bright, częściowo double positive dull oraz CD 4 positive CD 8 low. Tutaj bramka TCR beta high CD 69 positive ilustruje populację komórek bezpośrednio po selekcji pozytywnej, która składa się z komórek double positive dull, CD 4 positive, CD 8 low oraz komórek pojedynczo dodatnich CD 4.

Wreszcie, ta bramka TCR beta high CD 69 negative wykazuje bardziej dojrzałą populację komórek, która składa się głównie z komórek CD4 i CD8 pojedynczo dodatnich. Brak populacji TCR R beta intermediate CD 69 positive oraz TCR R beta high CD 69 positive może wskazywać na upośledzoną selekcję pozytywną. Zmiany w stosunku komórek CD4 pojedynczo dodatnich do komórek CD8 pojedynczo dodatnich w obrębie populacji TCR beta high CD 69 negative mogą sugerować zaburzenia w determinacji linii komórkowej.

Utrata populacji TCR beta high CD 69 positive oraz TCR beta high CD 69 negative może odzwierciedlać problemy z przeżywalnością po selekcji pozytywnej. Analiza TCR beta względem CD five jest kolejną strategią identyfikacji populacji sprzed i po selekcji pozytywnej. Te dwie pierwsze populacje składają się głównie z jasnych tymocytów podwójnie pozytywnych.

Populacja TCR beta low CD five low reprezentuje przedselekcyjne tymocyty podwójnie dodatnie, natomiast populacja TCR beta intermediate CD five intermediate składa się z komórek inicjujących selekcję pozytywną. Zaburzenie generowania tej lub poprzedniej populacji sugeruje wadliwą selekcję pozytywną. Z kolei populacja TCR R beta intermediate CD five high reprezentuje tymocyty w procesie selekcji pozytywnej i składa się głównie z komórek podwójnie dodatnich dull oraz CD four dodatnich.

Tymocyty CD8 low. Populacja TCR beta high CD5 high składa się głównie z komórek po selekcji pozytywnej. Pojedynczo pozytywne tymocyty zmiany w stosunku CD4 pojedynczo pozytywnych do CD8.

Pojedyncze komórki dodatnie w tej populacji, mimo prawidłowego stanu poprzednich populacji, mogą sugerować zmiany w determinacji linii komórkowych. Ponadto, brak tej populacji może wskazywać na obniżoną przeżywalność tymocytów po selekcji pozytywnej, ponieważ selekcja negatywna wiąże się z usuwaniem niewielkich populacji specyficznych dla antygenu. Defekty w tym procesie najlepiej obserwować z wykorzystaniem myszy transgenicznych TCR; w tymocytach myszy HY CD four wykazujących ekspresję transgenicznego H-Y-T-C-R można je wykryć za pomocą przeciwciała monoklonalnego T 3.7.

H-Y-T-C-R rozpoznaje antygen HY specyficzny dla samców, prezentowany w obrębie MHC klasy I db. W związku z tym u samców myszy HY CD4 zachodzi selekcja negatywna tyreocytów H-Y-T-C-R dodatnich, co objawia się zmniejszeniem liczby dwudodatnich tyreocytów T 3.70 dodatnich oraz znacznie bardziej gwałtownym spadkiem liczby pojedynczo dodatnich tyreocytów CD8 T 3.7 dodatnich. Z kolei u samic myszy HY CD4 zachodzi selekcja pozytywna w celu wygenerowania pojedynczo dodatnich limfocytów T CD8 T 3.7 dodatnich.

Podczas gdy zmniejszenie liczby tyreocytów podwójnie dodatnich świadczy o selekcji negatywnej, najdokładniejszym miernikiem jest brak antygenowo swoistych tyreocytów pojedynczo dodatnich. Dalsza analiza nielicznych tyreocytów CD8 pojedynczo dodatnich, wykazujących ekspresję T3.70, u samców myszy HY CD4 wykazuje, że większość z nich to niedojrzałe komórki CD24 high. Tymczasem większość tyreocytów CD8 pojedynczo dodatnich wykazujących ekspresję T3.70 u samic HY CD4 osiągnęła dojrzałość i wykazuje niski poziom CD24 (CD24 low), co stanowi dodatkowy dowód na to, że w organizmach samców myszy HY CD4 zachodzi selekcja negatywna.

Jednym z zastrzeżeń dotyczących transgenicznych modeli TCR jest trudność w dalszej charakterystyce selekcji pozytywnej poprzez identyfikację populacji na podstawie ekspresji TCR oraz CD69 lub CD5, ze względu na wysoką ekspresję TCR w trakcie rozwoju tyreocytów; samice myszy HY CD4 wykazują dużą populację podwójnie pozytywnych tyreocytów T3.70+, które przechodzą selekcję pozytywną. Jak wskazuje wzrost populacji CD69+ w porównaniu z typem dzikim, selekcja negatywna wymaga silniejszego bodźca TCR o wyższym powinowactwie niż selekcja pozytywna. Świadczy o tym wyższa ekspresja CD69 na podwójnie pozytywnych tyreocytach T3.70+ u samców myszy HY CD4, co skutkuje przesunięciem piku histogramu w prawo.

Podobne tendencje obserwuje się w przypadku ekspresji CD5 podczas analizy selekcji grasiczkowej u myszy modyfikowanych genetycznie. Badanie ekspresji CD69 lub CD5 pozwala ustalić, czy defekt wynika z sygnalizacji TCR, czy jest wynikiem procesów następujących po stymulacji TCR. Po opanowaniu metody, przygotowanie komórek i barwienie zajmuje dwie i pół godziny, plus dodatkowa godzina na gromadzenie danych za pomocą cytometru przepływowego.

Jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo, każda dodatkowa mysz zajmie około 30 minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z tymocytami oraz upewnić się, że strategia barwienia została zaplanowana z wyprzedzeniem. Postępuj zgodnie z poniższą procedurą.

W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy wyeksportowane tymocyty funkcjonują prawidłowo, można przeprowadzić inne testy, na przykład testy cytotoksyczności lub testy produkcji cytokin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat analizy rozwoju obszarów grasicy z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.