Name: Badanie dodatniej i ujemnej selekcji grasicy za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do badania rozwoju limfocytów T w grasicy myszy. Technika ta umożliwia identyfikację populacji komórek i analizę genów kluczowych dla generowania repertoaru TCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Bing Zhang za pomoc techniczną. Praca ta była finansowana przez Canadian Institutes for Health Research (MOP-86595). T.A.B jest laureatem stypendium CIHR New Investigator oraz AHFMR Scholar. Q.H. otrzymuje wsparcie z CIHR Canada Graduate Scholarship - Doctoral oraz AIHS Full-time Studentship. S.A.N. otrzymuje wsparcie z Queen Elizabeth II Graduate Scholarship. A.Y.W.S. otrzymuje wsparcie z NSERC Postgraduate Scholarship - Doctoral.

Ogólny schemat protokołu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 1.
1. Disekcja
<ol>
 <li>Umieść sterylną stalową siatkę w szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm. Jedna jednostka jest potrzebna na jedną próbkę tkanki.</li>
 <li>Do każdej szalki dodaj 5 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS). Szalki należy przechowywać w lodzie.</li>
 <li>Uśmierć myszy za pomocą CO2.</li>
 <li>Przymocuj mysz do powierzchni sekcyjnej stroną brzuszną do góry. Spryskaj mysz 70% etanolem w celu sterylizacji i aby zapewnić przyleganie futra.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych rozpocznij sekcję, wykonując nacięcie brzuszne skóry brzucha tuż powyżej narządów płciowych. Przedłuż nacięcie w górę aż do podbródka.</li>
 <li>Od linii środkowej przedłuż nacięcie w dół wzdłuż wszystkich kończyn. Odciągnij luźną skórę i przypnij ją do powierzchni sekcyjnej.</li>
 <li>Pobierz grasicę:
 <ol>
 <li>Unieś dolną końcówkę mostka, aby wykonać nacięcie.</li>
 <li>Omijając wątrobę, przetnij przeponę, aby oddzielić klatkę piersiową, a następnie przetnij klatkę piersiową po obu stronach. Przetnij klatkę piersiową w górę z każdej strony, uważając, aby nie uszkodzić płuc i serca.</li>
 <li>Delikatnie odciągnij klatkę piersiową pęsetą. Grasica jest białym, dwupłatowym narządem znajdującym się nad sercem. Używając płaskiej krawędzi pęsety do uchwycenia dołu płatów, delikatnie wyciągnij grasicę i umieść ją na siatce.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Pobierz śledzionę:
 <ol>
 <li>Śledziona jest czerwonym narządem w kształcie deski surfingowej, znajdującym się po lewej stronie jamy brzusznej myszy, poniżej wątroby.</li>
 <li>Wykonaj nacięcie w jamie brzusznej. Delikatnie wyciągnij śledzionę jedną pęsetą, używając drugiej pęsety do oddzielenia tkanki łącznej. Umieść śledzionę na oddzielnej siatce.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
 <li>Za pomocą tłoka z strzykawki 3 ml rozetrzeć organy na sicie aż do momentu, gdy pozostanie jedynie tkanka łączna i tłuszcz. Przepłukać sito trzy razy za pomocą HBSS z naczynia. Dla każdej próbki tkanki należy użyć nowego tłoka.
 <ol>
 <li>Zamiast tej metody można zastosować inne sposoby homogenizacji tkanek.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Policzyć komórki przy użyciu hemocytometru.</li>
 <li>Ubić komórki poprzez wirowanie przy 335 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Resuspender splenocyty w 500 μl buforu lizującego ACK (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHC03, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2) na 10 min w temperaturze pokojowej. Resuspender tymocyty w stężeniu 20 x 106 cells/ml w buforze FACS (PBS, 1% FCS, 0.02% azydku sodu) i odstawić na lód.</li>
 <li>Przywrócić izotoniczność splenocytom, dodając 5 ml HBSS. Ubić splenocyty poprzez wirowanie i resuspender w stężeniu 20 x 106 cells/ml w buforze FACS. Jeśli komórki muszą pozostać sterylne, można użyć sterylnego RPMI + 10% FCS.</li>
</ol>
3. Barwienie komórek do cytometrii przepływowej
Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie strategii analizy selekcji pozytywnej i negatywnej z wykorzystaniem myszy typu dzikiego (WT) oraz HYcd4. W kwestiach ogólnych dotyczących planowania eksperymentów, akwizycji i analizy w cytometrii przepływowej odsyłamy czytelników do znakomitego przeglądu opracowanego przez Tung et al.11
<ol>
 <li>Do każdego dołka płytki 96-dołkowej nanieś 4 x 106 tymocytów na próbkę do cytometrii przepływowej, a dla kontroli kompensacji 1 x 106 splenocytów WT. W przypadku użycia myszy transgenicznych w eksperymencie należy uwzględnić mysz WT jako kontrolę.</li>
 <li>Zablokuj receptory Fc, inkubując komórki z przeciwciałem anty-CD16/32 (klon 2.4G2) przez 10 min w lodzie.</li>
 <li>Wiruj płytkę przy 335 x g w 4 °C przez 5 min. Zdejmij pokrywkę i usuń ciecz z dołków, energicznie potrząsając płytką raz, odwróconą stroną do dołu nad zlewem. Resuspenduj zawartość każdego dołka w 200 μl buforu FACS. Powtórz etap przemywania.</li>
 <li>Przygotuj koktajle przeciwciał zgodnie z poniższą listą, stosując optymalne stężenie każdego przeciwciała w oparciu o rozcieńczenie w 200 μl buforu FACS na dołek. Optymalne stężenie każdego przeciwciała definiuje się jako najniższe stężenie wymagane do uzyskania największego rozdzielenia populacji pozytywnych i negatywnych. Jeśli dla danego przeciwciała nie występuje populacja negatywna, należy dołączyć przeciwciało izotypowe. Całkowita objętość na dołek może zostać zmniejszona (np. do 100 μl na dołek), jeśli jest to pożądane.
 <ol>
 <li>grasica WT: anty-TCRβ, anty-CD4, anty-CD8, anty-CD69 lub anty-CD5, anty-CD24</li>
 <li>grasica HYcd4: anty-HY TCR (T3.70), anty-CD4, anty-CD8, anty-CD69 lub anty-CD5, anty-CD24 
Aby uzyskać lepsze rozdzielenie populacji CD69lo i CD69hi w tymocytach, zaleca się stosowanie biotynjlowanego przeciwciała pierwszorzędowego anty-CD69, a następnie barwienia drugorzędowego z użyciem streptawidyny sprzężonej z fluorochromem. Tą samą strategię stosujemy w przypadku barwienia CD5.
 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Inkubuj komórki z 200 μl koktajlu przeciwciał w buforze FACS przez 30 min w lodzie i w ciemności.</li>
 <li>Równolegle z barwieniem koktajlem przeciwciał, zabarw każdą kontrolę kompensacji pojedynczym przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem. Idealnie barwienie kompensacyjne powinno obejmować te same przeciwciała, które zostały użyte w koktajlu. Jednak w przypadku większych eksperymentów z analizą wielu antygenów barwienie każdego antygenu z osobna może być niewykonalne. Dlatego, ze względu na wysoką ekspresję tych antygenów, zaleca się barwienie anty-CD4 lub anty-CD8, bądź użycie kulek kompensacyjnych. Barw w buforze FACS przez 30 min w lodzie i w ciemności. Jedną kontrolę kompensacji pozostaw niezabarwioną.</li>
 <li>Przemyj komórki dwukrotnie buforem FACS.</li>
 <li>Resuspenduj komórki w buforze FACS i przenieś do probówek do FACS.</li>
 <li>Przeanalizuj próbki na cytometrze przepływowym. Uwzględnij pomiar FSC-A i FSC-W w celu umożliwienia dyskryminacji dubletów.</li>
</ol>
4. Analiza danych z cytometrii przepływowej - myszy nietransgeniczne pod kątem TCR
Do analizy danych z cytometrii przepływowej wykorzystujemy oprogramowanie FlowJo. Strategię bramkowania dla myszy nietransgenicznych pod kątem TCR przedstawiono na Rysunku 2A.
<ol>
 <li>Wykorzystując FSC-A względem SSC, wyznacz elektronicznie bramkę dla populacji „limfocytów”.</li>
 <li>W obrębie populacji „limfocytów” użyj FSC-A względem FSC-W, aby elektronicznie wyznaczyć bramkę dla populacji FSC-Wlo w celu wykluczenia dubletów i agregatów komórek. Jest to bramka „singletów”.</li>
 <li>Wykorzystując zdarzenia w bramce „singletów”, nanieś wykres CD8 względem CD4. Wyznacz bramki dla populacji DN, DPdull, DPbright, CD4+CD8lo, CD4SP oraz CD8SP, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 2B.</li>
 <li>W obrębie bramek CD4SP i CD8SP stwórz wykresy TCRβ względem CD24. Użyj narzędzia bramkowania kwadrantowego, aby wyznaczyć bramki zgodnie z przedstawionym na Rysunku 2C.</li>
 <li>Stwórz nowy wykres z bramki „singletów”: TCRβ względem CD69. Wyznacz bramki A, B, C, D, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 2D.</li>
 <li>Stwórz kolejny wykres z bramki „singletów”: TCRβ względem CD5. Wyznacz bramki i, ii, iii, iv, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 2E. Jest to alternatywna strategia badania selekcji pozytywnej.</li>
 <li>Zastosuj bramki DN, DPdull, DPbright, CD4int, CD4SP i CD8SP z poziomu „singletów” do bramek i, ii, iii, iv, A, B, C, D (Rysunek 2D, E).</li>
 <li>Oblicz liczbę komórek w danej podgrupie, mnożąc cellularity narządu przez częstotliwość każdej kolejnej bramki, aż do osiągnięcia docelowej populacji. Na przykład liczbę tymocytów TCRβhiCD69- CD8SP oblicza się jako cellularity grasicy x %TCRbhi CD69- (frakcja D) x %CD8SP.
 <ol>
 <li>Liczenie uwzględnia już komórki żywe i martwe, więc nie należy włączać bramki „limfocytów” do obliczeń.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Analiza danych z cytometrii przepływowej - myszy transgeniczne TCR
Strategię bramkowania dla myszy transgenicznych TCR przedstawiono na Rysunku 3A.
<ol>
 <li>Postępuj zgodnie z krokami 4.1 i 4.2 opisanymi w poprzedniej sekcji.</li>
 <li>W obrębie bramki „singlet” utwórz wykres T3.70 względem SSC i wyznacz bramkę na populację komórek T3.70+, aby przeanalizować limfocyty T swoiste dla antygenu (Rycina 3B). W niektórych przypadkach może być zasadne porównanie tej populacji z populacją limfocytów T nieswoistych dla antygenu (T3.70-).</li>
 <li>W obrębie populacji T3.70+ wyznacz bramki DN, DP, CD4SP i CD8SP (Rycina 3C).
 <ol>
 <li>W przypadku próbek kontrolnych WT wyznacz te bramki w obrębie bramki „singlet” lub utwórz bramkę T3.70-, ponieważ liczba komórek T3.70+ będzie bardzo mała.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>W obrębie bramki CD8SP utwórz wykres T3.70 względem CD24. Użyj narzędzia do bramkowania kwadrantowego, aby podzielić komórki na cztery populacje (Rycina 3F).</li>
 <li>Utwórz nałożone na siebie histogramy przedstawiające ekspresję CD69 w kompartmencie DP myszy WT oraz w kompartmencie T3.70+ DP myszy HYcd4 (Rycina 4A). Powtórz procedurę, aby zbadać ekspresję CD5 (Rycina 4B).</li>
 <li>Oblicz bezwzględną liczbę komórek w każdej interesującej podgrupie, analogicznie do kroku 4.8.</li>
</ol>

<ol><li>Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire+regulates+negative+selection+of+organ-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Aire regulates negative selection of organ-specific T cells.</a> Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).</li>
<li>Liston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+dosage--limiting+role+of+Aire+in+thymic+expression%2C+clonal+deletion%2C+and+organ-specific+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).</li>
<li>Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+learning+self-control+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: learning self-control in the thymus.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).</li>
<li>Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+association+of+partial+T-cell+immunodeficiency+and+immune+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+what+have+we+learned+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: what have we learned from mice.</a> Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).</li>
<li>Zhan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Without+peripheral+interference%2C+thymic+deletion+is+mediated+in+a+cohort+of+double-positive+cells+without+classical+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).</li>
<li>Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocyte+apoptosis+induced+by+T+cell+activation+is+mediated+by+glucocorticoids+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo.</a> J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).</li>
<li>Martin, S., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+and+nonspecific+deletion+of+immature+cortical+thymocytes+caused+by+antigen+injection%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection.</a> European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).</li>
<li>Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+TCR+alpha+expression+critically+influences+T+cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection.</a> J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).</li>
<li>Tung, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+flow+cytometry%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+laboratory+medicine%22%5BJournal%5D)">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).</li>
<li>Aliahmad, P., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+all+CD4+T+lineages+requires+nuclear+factor+TOX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX.</a> J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).</li>
<li>Kastner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11b+represses+a+mature+T-cell+gene+expression+program+in+immature+CD4%28%2B%29CD8%28%2B%29+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes.</a> Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).</li>
<li>Albu, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL11B+is+required+for+positive+selection+and+survival+of+double-positive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes.</a> J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).</li>
<li>Van De Wiele, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytes+between+the+beta-selection+and+positive+selection+checkpoints+are+nonresponsive+to+IL-7+as+assessed+by+STAT-5+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation.</a> J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).</li>
<li>Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+signals+are+essential+for+cortex-medulla+migration+of+developing+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes.</a> J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).</li>
<li>Saini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science signaling. 3, ra23(2010).</li>
<li>Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bim-mediated+apoptosis+is+not+necessary+for+thymic+negative+selection+to+ubiquitous+self-antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens.</a> J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).</li>
<li>Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+in+T-cell-receptor+transgenic+mice+involves+deletion+of+nonmature+CD4%2B8%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.</a> Nature. 333, 742-746 (1988).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+deletion+of+thymocytes+can+occur+in+the+cortex+with+no+involvement+of+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla.</a> J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).</li>
<li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li>
<li>Anderson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298, 1395-1401 (2002).</li>
<li>Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).</li>
<li>Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7-mediated+migration+of+developing+thymocytes+to+the+medulla+is+essential+for+negative+selection+to+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).</li>
<li>Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+negative+selection+on+the+T+cell+repertoire+reactive+to+a+self-peptide%3A+a+large+fraction+of+T+cell+clones+escapes+clonal+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion.</a> Immunity. 13, 829-840 (2000).</li>
<li>Gallegos, A. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance+to+tissue-specific+antigens+mediated+by+direct+and+indirect+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation.</a> J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Bouillet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+Bcl-2+family+member+Bim+is+required+for+apoptosis+of+autoreactive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes.</a> Nature. 415, 922-926 (2002).</li>
<li>Suen, A. Y., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+protein+Bim+is+differentially+required+during+thymic+clonal+deletion+to+ubiquitous+versus+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li>
<li>Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+orphan+steroid+receptor+Nur77+in+apoptosis+accompanying+antigen-induced+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection.</a> Immunity. 3, 273-282 (1995).</li>
<li>Zhou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Nur77%2FNurr1+leads+to+inefficient+clonal+deletion+of+self-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells.</a> J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).</li>
<li>Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+analysis+of+clonal+deletion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo.</a> J. Immunol. 179, 837-844 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do badania selekcji pozytywnej i negatywnej u myszy nietransgenicznych oraz transgenicznych pod kątem TCR. Niniejszy protokół opisuje barwienie antygenów powierzchniowych. W celu dalszej analizy mechanizmów molekularnych często konieczne jest przeprowadzenie barwienia wewnątrzkomórkowego. Do większości białek wewnątrzkomórkowych stosujemy zestaw BD Biosciences Cytofix/Cytoperm, a do czynników transkrypcyjnych zestaw BD Biosciences Foxp3 Staining Kit. Próbki analizujemy z...

<table><tbody><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa HyClone</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30030.02</td><td></td></tr><tr><td>Sita z siatki metalowej</td><td>Cedarlane</td><td>CX-0080-E-01</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (60 x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>877221</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki (3 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe (15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss - Primo Star</td><td>415500-00XX-000</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>82.1582.001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Fisherbrand</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>PAA</td><td>A15-701</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025802</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>IT Baker Chemical Co.</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR</td><td></td><td></td><td>Klon 2.4G2</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie przeciwko HY TCR</td><td>eBioscience</td><td>XX-9930-YY*</td><td>Klon T3.70</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie przeciwko CD4</td><td>eBioscience</td><td>XX-0042-YY*</td><td>Klon RM4-5</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie przeciwko CD8&amp;alpha;</td><td>eBioscience</td><td>XX-0081-YY*</td><td>Klon 53-6.7</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie przeciwko CD24</td><td>eBioscience</td><td>XX-0242-YY*</td><td>Klon M1/69</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie przeciwko TCR&amp;#946;</td><td>eBioscience</td><td>XX-5961-YY*</td><td>Klon H57-597</td></tr><tr><td>Biotynilowane przeciwciało anty-mysie przeciwko CD69</td><td>eBioscience</td><td>13-0691-YY*</td><td>Klon H1.2F3</td></tr><tr><td>Biotynilowane przeciwciało anty-mysie przeciwko CD5</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-YY*</td><td>Klon 53-7.3</td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>eBioscience</td><td>XX-4217-YY*</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences - FACS Canto</td><td>338962</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka HyClone RPMI - 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">*XX zależy od fluorochromu, a YY od wielkości fiolki.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

badanie pozytywnej i negatywnej selekcji w grasicy metodą cytometrii przepływowej

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Zdrowy układ odpornościowy wymaga, aby limfocyty T reagowały na antygeny obce, pozostając jednocześnie tolerancyjnymi wobec antygenów własnych. Losowe przetasowania locus α i β receptora limfocytów T (TCR) generują repertuar limfocytów T o ogromnej różnorodności w specyficzności antygenowej, zarówno wobec własnych, jak i obcych antygenów. Selekcja repertuaru podczas rozwoju w grasicy jest kluczowa dla generowania bezpiecznych i użytecznych limfocytów T. Defekty w selekcji grasicowej przyczyniają się do rozwoju schorzeń autoimmunologicznych i niedoborów odporności1-4.
Progenitory komórek T wnikają do grasicy jako tymocyty podwójnie negatywne (DN), które nie wykazują ekspresji koreceptorów CD4 ani CD8. Ekspresja αβTCR oraz obu koreceptorów następuje na etapie podwójnie pozytywnym (DP). Interakcja αβTCR z kompleksem pMHC (peptyd własny-MHC) prezentowanym przez komórki grasicy determinuje los tymocytu DP. Interakcje o wysokim powinowactwie prowadzą do selekcji negatywnej i eliminacji tymocytów autoreaktywnych. Interakcje o niskim powinowactwie skutkują selekcją pozytywną i rozwojem pojedynczo pozytywnych (SP) komórek T CD4 lub CD8, zdolnych do rozpoznawania obcych antygenów prezentowanych przez własny MHC5.
Selekcję pozytywną można badać u myszy z poliklonalnym (dzikim) repertuarem TCR, obserwując powstawanie dojrzałych limfocytów T. Nie są one jednak idealne do badania selekcji negatywnej, która wiąże się z usuwaniem niewielkich, swoistych dla antygenu populacji. Do badania selekcji negatywnej wykorzystano wiele systemów modelowych, które różnią się jednak zdolnością do odtworzenia zdarzeń fizjologicznych6. Na przykład stymulacja tymocytów in vitro nie uwzględnia środowiska grasicy, które bierze czynny udział w selekcji, natomiast podawanie egzogennego antygenu może prowadzić do nieswoistej delecji tymocytów7-9. Obecnie najlepszymi narzędziami do badania selekcji negatywnej in vivo są myszy wykazujące ekspresję transgenicznego TCR swoistego dla endogennego autoantygenu. Jednak wiele klasycznych modeli transgenicznych TCR charakteryzuje się przedwczesną ekspresją transgenicznego łańcucha TCRα na etapie DN, co skutkuje przedwczesną selekcją negatywną. Nasze laboratorium opracowało model HYcd4, w którym transgeniczny TCRα HY jest wyrażany warunkowo na etapie DP, co pozwala na zajście selekcji negatywnej podczas przejścia z etapu DP do SP, tak jak ma to miejsce u myszy typu dzikiego10.
W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do badania selekcji pozytywnej i negatywnej w grasicy w modelu mysim HYcd4. Chociaż selekcja negatywna u myszy HYcd4 ma charakter wysoce fizjologiczny, metody te można zastosować również do innych transgenicznych modeli TCR. Przedstawimy również ogólne strategie analizy selekcji pozytywnej w poliklonalnym repertuarze, które można zastosować u dowolnych myszy poddanych modyfikacjom genetycznym.

W fizjologicznych modelach myszy transgenicznych z TCR oraz u myszy WT selekcja pozytywna rozpoczyna się na etapie DPbright, a po spotkaniu z antygenem przechodzi w etap DPdull. Tymocyty DPdull wchodzą następnie w przejściowy etap CD4+CD8lo, zanim przekształcą się w tymocyty CD4SP lub CD8SP (Rysunek 2B). Dojrzałe tymocyty SP charakteryzują się wysoką ekspresją TCR i utratą CD24 (Rysunek 2C). Podczas gdy profil CD8 w stosunku do CD4 m...

Przedstawiamy metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania rozwoju limfocytów T in vivo z wykorzystaniem myszy modyfikowanych genetycznie na tle typu dzikiego lub transgenicznych pod kątem receptora limfocytów T.

Badanie pozytywnej i negatywnej selekcji w grasicy metodą cytometrii przepływowej

Zdrowy układ odpornościowy wymaga, aby limfocyty T reagowały na antygeny obce, pozostając jednocześnie tolerancyjnymi wobec autoantygenów. Losowe przearanżowanie limfocytów T...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest badanie rozwoju grasicy u myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z grasicy i śledziony myszy. W drugim kroku tymocyty i limfocyty są barwione koktajlem przeciwciał w celu identyfikacji specyficznych populacji komórek grasicy.W ostateczności częstotliwość i liczebność różnych populacji limfocytów można ocenić za pomocą analizy cytometrycznej przepływowej. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju limfocytów T, takie jak to, które geny i szlaki sygnałowe są istotne dla generowania funkcjonalnego, a jednocześnie tolerancyjnego repertuaru limfocytów T. Chociaż metoda ta umożliwia wgląd w rozwój limfocytów T w grasicy, może być ona również zastosowana w badaniu rozwoju innych komórek odpornościowych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności podczas projektowania koktajli przeciwciał do cytometrii przepływowej. Przed przystąpieniem do sekcji umieść sterylną stalową siatkę w płytce Petriego o wymiarach 60 by 15 mm. Następnie dodaj do płytki 5 mL HBSS i przechowuj ją w lodzie w celu pobrania grasicy.W pierwszej kolejności z

examination-thymic-positive-negative-selection-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie dodatniego i ujemnego selekcji tymocytów za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Opisujemy przygotowanie wycinków grasicy, które w połączeniu z cytometrią przepływową mogą być użyte do modelowania pozytywnej i negatywnej selekcji rozwijających się limfocytów T. Plastry grasicy można również przystosować do analizy in situ migracji, lokalizacji i sygnalizacji tymocytów za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii dwufotonowej.

Przygotowanie i zastosowanie organotypowych kultur grasicy w warstwach

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Tutaj opisany jest protokół izolacji i charakterystyki podzbiorów limfocytów T CD4+ z ludzkiej krwi obwodowej. Oczyszczone limfocyty T CD4 + są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia proporcji podzbiorów komórek pomocniczych mieszków T.

Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania pojedynczych komórek z mysiej grasicy, węzła chłonnego drenującego trzustkę i śledziony do dalszego badania tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto protokół ten wykorzystano do określenia podzbiorów regulatorowych limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej.

Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu tylko dwóch fluorochromów zamiast siedmiu. Dzięki takiemu podejściu na większości cytometrów przepływowych można zarejestrować pięć dodatkowych markerów.

Dyskryminacja siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą dwufluorochromowej cytometrii przepływowej

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Ten protokół opisuje izolację podwójnie ujemnych tymocytów z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę w systemie kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego z ekspresją delta 4 (OP9-DL4) w celu dalszej analizy funkcjonalnej.

Współhodowla i transdukcja mysich tymocytów na komórkach zrębowych z ekspresją 4 podobną do delta w celu badania onkogenów w białaczce z komórek T

Opisujemy protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki nabłonka grasicy myszy oraz barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrycznej przepływowej.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do badania rozwoju limfocytów T w grasicy myszy. Technika ta umożliwia identyfikację populacji komórek i analizę genów kluczowych dla generowania repertoaru TCR.

Badanie pozytywnej i negatywnej selekcji w grasicy metodą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów