Badanie dodatniej i ujemnej selekcji grasicy za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie twojego rozwoju u myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z myszy, grasicy i śledziony. W drugim etapie tymocyty i cyty są barwione koktajlem przeciwciał w celu identyfikacji określonych populacji.

Ostatecznie częstość i liczbę różnych populacji limfocytów można ocenić za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju limfocytów T, takie jak to, które geny i szlaki są ważne dla generowania funkcjonalnego, ale tolerancyjnego repertuaru limfocytów T. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rozwój limfocytów T w grasicy, może być również stosowana w badaniu rozwoju innych komórek odpornościowych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności z zaprojektowaniem koktajli przeciwciał do cytometrii przepływowej. Przed rozpoczęciem sekcji umieść sterylne siatkowe sito stalowe na szalce Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów. Następnie dodaj pięć mililitrów HBSS do naczynia i przechowuj naczynie na lodzie, aby zebrać grasicę.

Najpierw użyj kleszczy, aby podnieść dolną końcówkę mostka i odsłonić przeponę. Następnie, omijając wątrobę, przetnij przeponę, aby odłączyć klatkę piersiową, a następnie przetnij klatkę piersiową w górę z każdej strony. Uważaj, aby omijać płuca i serce.

Teraz użyj kleszczy, aby delikatnie odciągnąć klatkę piersiową do tyłu. Grasica jest białym, dwupłatkowym narządem znajdującym się nad sercem. Użyj płaskiej krawędzi kleszczy, aby chwycić dolną część płatów.

Następnie delikatnie wyciągnij grasicę i umieść ją na jednym z przygotowanych wcześniej sitek siatkowych. Aby pobrać śledzionę, wykonaj nacięcie przez otrzewną, aby odsłonić jamę brzuszną. Śledziona to czerwony narząd w kształcie deski surfingowej znajdujący się po lewej stronie jamy brzusznej myszy poniżej wątroby.

Następnie użyj jednej pary kleszczy, aby wyciągnąć śledzionę, a drugiej, aby usunąć tkankę łączną. Następnie umieść wypreparowaną śledzionę na osobnym siatkowym sicie. Teraz użyj tłoka z trzymililitrowej strzykawki, aby zmielić każdy narząd na siatkę, aż pozostanie tylko tkanka łączna i tłuszcz, odpipetuj komórki i HBSS do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Następnie opłucz każdą siatkę świeżym HBS S3 razy. Następnie osadzaj komórki przez pięć minut w temperaturze 335 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Po odessaniu resusa supernatantu zawiesić cyty w 500 mikrolitrach buforu do lizy CK na 10 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy czerwone krwinki śledziony są leżakowane Resus.

Zawieś tymocyty w ilości 20 razy 10 do sześciu komórek na mililitr w buforze faksowym i odłóż je na lód. Teraz dodaj pięć mililitrów HBSS, aby przywrócić cyty do izotoniczności po ponownym odwirowaniu komórek, ponownie zawiesić wolne osady RBC na poziomie 20 razy 10 do szóstych komórek na mililitr w buforze faksu. Rozpocznij ten krok od Ali Wattinga.

Cztery razy od 10 do jednej szóstej zarezerwowanych THYMOCYTES na próbkę cytometrii przepływowej do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce. Następnie dodaj cyty do dołków 96-dołkowej płytki w celu kontroli kompensacji. Następnie zablokuj receptory FC w każdej z próbek komórkowych przez inkubację z anty CD 1632 przez 10 minut na lodzie.

Teraz odkręć talerz, a następnie rozproszyć płyn z dołków, przesuwając płytkę raz ekranem w dół do zlewu, a następnie ponownie zawieś każdą studzienkę w 200 mikrolitrach bufora faksu i powtórz mycie. Następnie inkubuj próbki eksperymentalne z 200 mikrolitrami koktajlu przeciwciał lub pojedynczych przeciwciał sprzężonych z fluorochromem do kontroli kompensacji. Wszystko w buforze faksu na lodzie w ciemności.

Po 30 minutach umyj komórki dwukrotnie buforem faksowym, a następnie po ponownym zawieszeniu komórek w buforze faksu przenieś próbki do probówek faksowych w fizjologicznych modelach transgenicznych TCR i myszach typu dzikiego. Selekcja pozytywna rozpoczyna się na podwójnym dodatnim etapie jasności, zanim przejdzie do podwójnie dodatniego etapu matowego. Po tym, jak antygen napotka podwójnie dodatnie tymocyty, a następnie wejdź w przejściowy CD cztery dodatnie CD osiem niski stopień, zanim stanie się CD cztery.

Pojedyncze dodatnie lub CD osiem pojedynczych dodatnich tymocytów dojrzałe pojedyncze dodatnie tymocyty charakteryzują się wysoką ekspresją TCR i utratą CD 24. Podczas gdy profil CD 8 przez CD 4 może ujawnić defekty w selekcji pozytywnej, badanie TCR beta za pomocą CD 69 lub CD 5 może dostarczyć dalszych informacji na temat tego, gdzie leży wada. Zarówno CD 69, jak i CD 5 są regulowane w górę po stymulacji TCR, a silniejsze interakcje napędzają wyższą ekspresję tych markerów.

Na tym wykresie TCR beta przez CD 69 u myszy typu dzikiego, ujemny chód TCR R beta o niskim CD 69 reprezentuje populację podwójnie dodatnich tymocytów przed selekcją. Podczas gdy ten międzyzaawansowany chód TCR beta CD 69 dodatni reprezentuje populację przejściową bezpośrednio po zaangażowaniu TCR i składa się z podwójnie dodatnich jasnych z kilkoma podwójnie dodatnimi matowymi i CD cztery dodatnie CD osiem niskich komórek. Tutaj chód TCR R beta o wysokim dodatnim CD 69 ilustruje populację komórek bezpośrednio po selekcji pozytywnej, która składa się z podwójnie dodatnich matowych komórek CD czterech dodatnich, CD ośmiu niskich i CD czterech pojedynczych dodatnich.

Wreszcie, ten chód TCR beta o wysokim ujemnym CD 69 pokazuje bardziej dojrzałą populację komórek, która składa się głównie z pojedynczych komórek dodatnich CD 4 i CD 8. Brak populacji TCR R beta średnio dodatnich na CD 69 i TCR R beta o wysokim dodatnim CD 69 może wskazywać na upośledzone zmiany selekcji pozytywnej w stosunku CD cztery pojedyncze dodatnie do CD osiem. Pojedyncze dodatnie komórki w populacji TCR beta o wysokim ujemnym CD 69 mogą sugerować zmiany w zaangażowaniu linii.

Utrata populacji TCR o wysokim poziomie CD 69 dodatnim i TCR beta o wysokim ujemnym wyniku CD 69 może odzwierciedlać problemy z przeżyciem po pozytywnej selekcji. Badanie TCR beta za pomocą CD 5 jest kolejną strategią identyfikacji populacji przed i po selekcji pozytywnej. Te pierwsze dwie populacje składają się głównie z podwójnie dodatnich jasnych tymocytów.

Populacja TCR beta low CD five low reprezentuje podwójnie dodatnie tymocyty preselekcyjne, a populacja pośrednia TCR beta CD five składa się z komórek, które inicjują selekcję pozytywną. Upośledzone pokolenie tej lub poprzedniej populacji sugeruje wadliwą selekcję pozytywną. Populacja TCR R beta o wysokiej zawartości CD 5 reprezentuje jednak tymocyty w procesie selekcji pozytywnej i składa się głównie z podwójnie dodatnich matowych i CD cztere-dodatnich.

CD osiem niskich tymocytów. Populacja TCR beta high CD five składa się głównie z selekcji postpozytywnej. Pojedyncze dodatnie tymocyty zmieniają stosunek CD cztery, pojedynczy dodatni do CD osiem.

Pojedyncze dodatnie komórki w tej populacji, pomimo normalnych poprzednich populacji, mogą sugerować zmiany w zaangażowaniu linii. Co więcej, brak tej populacji może wskazywać na zmniejszone przeżycie tymocytów po selekcji pozytywnej, ponieważ selekcja negatywna wiąże się z delecją małych populacji specyficznych dla antygenu. Defekty w tym procesie najlepiej zaobserwować przy użyciu myszy transgenicznych TCR w HY CD czterech myszach z ekspresją transgenicznego H-Y-T-C-R można wykryć za pomocą przeciwciała monoklonalnego T 3,7.

H-Y-T-C-R rozpoznaje męski specyficzny antygen HY prezentowany w MHC klasy pierwszej db. Tak więc samce myszy HY CD cztery przechodzą negatywną selekcję tymocytów H-Y-T-C-R dodatnich, na co wskazuje zmniejszenie podwójnie dodatniej liczby THYMOCYTES T 3 punkt 70 i bardziej dramatyczny spadek T 3,7 dodatniej liczby cytów CD osiem, pojedynczej dodatniej liczby cytów THY. W przeciwieństwie do tego, cztery samice myszy HY CD przechodzą pozytywną selekcję w celu wytworzenia T 3,7 dodatnich CD ośmiu pojedynczych dodatnich limfocytów T.

Podczas gdy zmniejszenie liczby podwójnie dodatnich tybocytów wskazuje na selekcję negatywną, brak pojedynczych dodatnich tymocytów specyficznych dla antygenu jest najdokładniejszą miarą. Dalsze badania kilku T trzy punkty 70 dodatnich CD ośmiu pojedynczych dodatnich tymocytów w HY CD czterech samcach myszy ujawnia, że większość z nich to niedojrzałe komórki CD 24 o wysokiej jakości. Podczas gdy większość T trzy punkt 70 dodatni CD osiem pojedynczych dodatnich tymocytów w HY CD cztery samice osiągnęły dojrzałość i są nisko CD 24, co zapewnia dalsze wsparcie, ta negatywna selekcja występuje u samców myszy HY CD cztery.

Jednym z zastrzeżeń modeli transgenicznych TCR jest to, że trudno jest dalej charakteryzować selekcję pozytywną poprzez identyfikację populacji na podstawie ekspresji TCR i CD 69 lub CD 5 ze względu na wysoką ekspresję TCR podczas rozwoju CYTE, samice myszy HY CD cztery mają dużą populację podwójnie dodatnich tymocytów T trzypunktowych 70 dodatnich, które przechodzą selekcję pozytywną. Jak wskazuje wzrost populacji CD 69 dodatniej w porównaniu z typem dzikim, selekcja negatywna wiąże się z wyższym powinowactwem do bodźca TCR niż selekcja pozytywna. Wskazuje na to wyższa ekspresja CD 69 na podwójnie dodatnich tymocytach T 3 punkt 70 u czterech samców myszy HY CD, co powoduje przesunięcie piku histogramu w prawo.

Podobne trendy obserwuje się w przypadku ekspresji CD 5 podczas analizy selekcji grasicy u genetycznie manipulowanych myszy. Badanie ekspresji CD 69 lub CD 5 może określić, czy defekt leży w sygnalizacji TCR, czy w dalszym wyniku stymulacji TCR. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu dwóch i pół godziny w celu przygotowania i barwienia komórek, a także dodatkowej godziny w celu zebrania danych z cytometru przepływowego.

Jeśli zostanie to wykonane poprawnie, każda dodatkowa mysz doda około 30 minut. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z tymocytami i upewnieniu się, że wcześniej zaplanowałeś strategię barwienia. Postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne testy, takie jak testy zabijania lub testy produkcji cytokin, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy eksportowane tymocyty działają prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować rozwój miejsca grasicy za pomocą cytometrii przepływowej.