Name: Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj metodę izolacji i oczyszczania mysich komórek nabłonkowych grasicy przy użyciu cytometrii przepływowej oraz sortowania komórek aktywowanych fluorescencją. Technika ta umożliwia badanie rozwoju limfocytów T i funkcji grasicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (dla K.A.H.). Dziękujemy również zasobowi cytometrii przepływowej Uniwersytetu Minnesoty.

W tym badaniu wykorzystano dorosłe (6 - 8 tygodni) samice myszy C57Bl/6. Myszy zakupiono od National Cancer Institute i utrzymywano w określonych warunkach wolnych od patogenów. Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Minnesoty (IACUC) zatwierdził wszystkie eksperymenty na zwierzętach.
1. Przygotowanie instrumentów i
<ol>
	<li>Przygotować roztwór enzymatyczny (pożywka RPMI1640 z 0,05% [w/v] Liberazy TH i 100 U/ml DNazy I), bufor bogaty w albuminy (1X PBS [Ca2+/Mg2+-free] z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej i 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym [EDTA]), bufor FACS (1X PBS [Ca2+/Mg2+-free] zawierający 1% płodowej surowicy bydlęcej [FBS] i 0,02% NaN3), Bufor sortujący FACS (1X PBS [Ca2+/Mg2+-free] zawierający 2% FBS) oraz pożywka RP10 (pożywka RPMI-1640 dostarczana z 10% FBS).</li>
	<li>Przygotuj 10 talerzy do panowania. Przygotować 40 ml roztworu powlekającego (0,01 mg/ml koziej anty-szczurzej IgG w 0,1 M buforzeNaHCO3) i dodać 4 ml roztworu powlekającego do każdej płytki o wymiarach 100 x 15 mm, zawirować i inkubować w temperaturze 4 °C O/N. Odlać roztwór przeciwciała i przepłukać płytkę za pomocą 5 ml 1x PBS 2 razy, Energicznie wirować między płukaniami. Przygotowane płytki przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanki grasicy
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji w komorze CO2. Połóż zwierzę na plecach na macie preparcyjnej, przypnij stopy do maty i zwilż futro, spryskując je 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę, zaczynając od góry otworu cewki moczowej prosto do dolnej szczęki nożyczkami i przedłuż nacięcie w dół do kolan po obu stronach. Nacięcie wygląda jak odwrócone do góry nogami "Y". Odciągnij luźną skórę z powrotem po bokach i przypnij ją do maty preparcyjnej.</li>
	<li>Nakłuj przeponę od mieczykowatej, przetnij żebra z każdej strony aż do obojczyka, a następnie podnieś żebra kleszczami i przypnij je do maty preparcyjnej. Grasica znajduje się tuż pod żebrami i wygląda jak dwa cienkie białe płaty pokrywające serce (ryc. 1). Odłącz tkankę łączną otaczającą grasicę, delikatnie pociągnij i usuń parę płatów grasicy za pomocą zakrzywionych ząbkowanych kleszczy. Umieść płatki grasicy w 6-dołkowej płytce zawierającej 5 ml RPMI-1640.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek zrębu grasicy
<ol>
	<li>Odciąć otaczający tłuszcz i tkankę łączną i przenieść płaty grasicy do nowego dołka na płytce 6-dołkowej zawierającej 5 ml świeżo przygotowanego roztworu enzymu. Wykonać małe nacięcia w płatach grasicy cienkimi nożyczkami i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować trawiąc tkankę grasicy w górę i w dół 2-3 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml w celu dysocjacji tkanek. Zebrać frakcję sklarowanego osadu w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml zimnego buforu bogatego w albuminy w celu zneutralizowania enzymów. Probówkę z hydromasażem należy przechowywać na lodzie. Dodać 2,5 ml roztworu enzymatycznego do pozostałej tkanki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Przeprowadzić delikatne mieszanie mechaniczne za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i igły 18 G w celu rozdrobnienia kruszyw. Umieścić supernatant w puli do probówki zbiorczej. Dodać 2,5 ml roztworu enzymatycznego do pozostałej tkanki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Powtórzyć delikatne mieszanie mechaniczne za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i igły 25 G, a następnie inkubować płytkę przez dodatkowe 5 - 10 minut.</li>
	<li>Po całkowitym roztwarzeniu umieścić supernatant w probówce zbiorczej. Odwirować probówkę zbiorczą o sile 400 x g, 4 °C przez 8 minut, aby zebrać komórki. Odessać ciecz i zawiesić granulowane komórki w 10 ml buforze bogatym w albuminy i przefiltrować próbkę przez oczka o średnicy 100 mm. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie wykonaj analizę cytometyczną przepływu (sekcja 4) lub wzbogacenie TEC (sekcja 5).</li>
</ol>
4. Identyfikacja TEC za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przygotować komórki do końcowego stężenia 4 x 106 komórek na 100 μl w buforze FACS do barwienia na 96-dołkowej płytce testowej z okrągłym dnem i utrzymywać płytkę na lodzie. Dodać 20 μl roztworu blokowego Fc (przeciwciało anty-CD16/CD32 o stężeniu 10 μg/ml w buforze FACS) do komórek i inkubować komórki przez 10 minut na lodzie. Obracać płytkę w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 3 min. Wylej płyn ze studzienek, wrzucając talerz do zlewu ekranem do dołu.</li>
	<li>Zawiesić granulowane komórki w koktajlu przeciwciał o stężeniu 100 μl (przeciwciała anty-CD45, -EpCAM, -MHC klasy II i -Ly51 oraz lektyna UEA-1 znakowana różnymi fluorochromami w zalecanych przez producenta lub przetestowanych optymalnych stężeniach każdego przeciwciała w buforze FACS) i inkubować komórki na lodzie przez 20 minut w ciemności. Aby to skompensować, zabarwić 1 x 106 komórek każdym pojedynczym fluorochromem.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu FACS do każdego dołka i obracać płytkę w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 3 min. Powtórzyć etap płukania jeden raz, a następnie ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforze FACS. Przenieść komórki do okrągłej probówki FACS o wymiarach 12 x 15 mm wypełnionej buforem FACS o pojemności 300 μl. Pobieraj próbki za pomocą cytometru przepływowego i analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy FACS. Strategia bramkowania TEC jest pokazana na rysunku 2.</li>
</ol>
5. Wzbogacanie TEC przez panoramowanie
<ol>
	<li>Odwirować komórki grasicy (przygotowane w sekcji 3) w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 5 minut. Odessać ciecz i zawiesić granulowane komórki w buforze sortującym FACS w stężeniu 2 x10,8 komórek na ml w probówce stożkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml. Dodać przeciwciało anty-CD90.2 (klon 30-H12) (lub anty-CD45) o końcowym stężeniu 2,5 μg/ml zawiesiny komórkowej i delikatnie inkubować komórki na mieszalniku obrotowym w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po inkubacji przemyć 5 - 10 razy większą objętością pożywki RP10 i odwirować probówkę o sile 400 x g, 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać ciecz i ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce RP10 o stężeniu 1 x 10,7 na ml. Dodać 5 ml zawiesiny komórek do każdej powlekanej płytki do płukania (przygotowanej w kroku 1.3), obracać i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Energicznie obracać; przenieść supernatanty do stożkowej probówki. Przepłukać płytkę dwa razy za pomocą pożywki RP10 i umieścić supernatanty w probówce zbiorczej.</li>
	<li>Odwirować probówkę zbiorczą o sile 400 x g, 4 °C przez 5 minut. Zassać ciecz i ponownie zawiesić granulowane komórki w 5 ml pożywki RP10. Dodać zawiesinę komórek do nowej płytki do wytaczania, obracać i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać komórki, przepłukać płytkę i umieścić je w stożkowej probówce. Po wzbogaceniu TEC należy odwirować komórki w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 5 minut i zawiesić komórki w 5 ml buforze sortującym FACS.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie TEC przez sortowanie komórek
<ol>
	<li>Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru i przygotować zawiesinę komórek w stężeniu 4 x 107 komórek w buforze sortującym FACS. Dodać przeciwciała opisane w sekcji 4.4 do roztworu komórkowego i delikatnie inkubować komórki na mieszalniku obrotowym w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po barwieniu przemyć i zawiesić komórki do stężenia 10 x 106 komórek na ml buforu sortującego FACS.</li>
	<li>Sortuj podzbiory TEC przez dyszę 100 μM za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Posortowane komórki są zbierane w 30% (v/v) FBS w RPMI-1640). Po zakończeniu sortowania komórek należy odwirować komórki w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 5 minut i przygotować do dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).</li>
<li>Anderson, G., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%3A+working+class+heroes+for+T+cell+development+and+repertoire+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection.</a> Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).</li>
<li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta5t-containing+thymoproteasome%3A+specific+expression+in+thymic+cortical+epithelial+cells+and+role+in+positive+selection+of+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22T+cells.+Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8.</a> T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).</li>
<li>Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+subunit+G5PR+that+regulates+the+JNK-mediated+apoptosis+signal+is+essential+for+the+survival+of+CD4+and+CD8+double-positive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes.</a> Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).</li>
<li>Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treg+cells%2C+life+history%2C+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Treg cells, life history, and diversity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021(2012).</li>
<li>Pobezinsky, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+deletion+and+the+fate+of+autoreactive+thymocytes+that+survive+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection.</a> Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).</li>
<li>Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selection of self-reactive T cells in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).</li>
<li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+tolerance%3A+central+and+peripheral%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell tolerance: central and peripheral.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).</li>
<li>Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+intrathymic+microenvironments+to+establish+T-cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).</li>
<li>Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoproteasome+subunit-beta5T+generates+peptide-MHC+complexes+specialized+for+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).</li>
<li>Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoned+out%3A+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).</li>
<li>Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+and+molecular+overview+of+the+thymus+as+site+for+T-cells+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).</li>
<li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus organogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).</li>
<li>Griffith, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+thymic+stromal+microenvironments+reveals+unique+features+influencing+T+lymphoid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunit%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation.</a> Immunit. 31, 999-1009 (2009).</li>
<li>Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+processing+of+self-antigens+by+subsets+of+thymic+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).</li>
<li>Hogquist, K. A., Xing, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+CD8%2B+T+cells+need+diversity+when+growing+up%5BTitle%5D)+AND+%22Immunit%22%5BJournal%5D)">Why CD8+ T cells need diversity when growing up.</a> Immunit. 32, 5-6 (2010).</li>
<li>Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+ability+of+thymic+epithelial+cells+to+mediate+positive+selection+does+not+require+expression+of+the+steroidogenic+enzyme+p450scc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc.</a> J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).</li>
<li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD8%2B+T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316, 1349-1353 (2007).</li>
<li>Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adult+thymic+stromal-cell+suspension+model+for+in+vitro+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection.</a> Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).</li>
<li>Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+reveals+unexpected+shared+antigens+between+histologically+defined+populations+of+thymic+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells.</a> Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).</li>
<li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJenkinson%2C+EJ+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 176, 845-853 (1992).</li>
<li>Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+of+the+autoreactive+T-cell+repertoire+by+a+splice+variant+of+self+protein+expressed+in+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells.</a> Nat. Med. 6, 56-61 (2000).</li>
<li>Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+the+thymocytes+associated+with+dendritic+cells+and+macrophages+in+thymic+rosettes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes.</a> Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).</li>
<li>Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+cells+in+the+thymus+that+can+negatively+select+MHC+class+II-restricted+T+cells+recognizing+a+circulating+self+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen.</a> J. Immunol. 158, 693-706 (1997).</li>
<li>Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+subpopulations+of+thymic+epithelial+cells+by+flow+cytometry+using+a+new+specific+thymic+epithelial+marker%2C+Ly110%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Method%22%5BJournal%5D)">Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110.</a> J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).</li>
<li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).</li>
<li>Gray, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+analysis%2C+enrichment+and+purification+of+thymic+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Method%22%5BJournal%5D)">Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells.</a> J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).</li>
<li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+complex+thymus+stromal+cell+populations%3A+rapid+thymic+epithelia+preparation+characterizes+radiation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury.</a> Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).</li>
<li>Kanof, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+T+cell+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Purification of T cell subpopulations.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).</li>
<li>Mage, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+T+cells+and+B+cells+using+panning+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fractionation of T cells and B cells using panning techniques.</a> Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).</li>
<li>Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+nurse+cells.+Lymphoepithelial+cell+complexes+in+murine+thymuses%3A+morphological+and+serological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicin%22%5BJournal%5D)">Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization.</a> The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).</li>
<li>Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoepithelial+interactions+in+the+mouse+thymus%3A+phenotypic+and+kinetic+studies+on+thymic+nurse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immuno%22%5BJournal%5D)">Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells.</a> J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+alpha+rearrangement+in+cortical+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).</li>
<li>McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Method%22%5BJournal%5D)">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+method%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W protokole krytycznymi etapami są przygotowanie komórek zrębu grasicy (sekcja 3) i wzbogacenie TEC (sekcja 4). Zdecydowanie zaleca się, aby za każdym razem przygotowywany był świeży roztwór enzymu, a tkanka była traktowana tak szybko, jak to możliwe. W przypadku grasicy zbiorczej wymagana jest optymalizacja objętości roztworu enzymatycznego w zależności od liczby grasicy. Jeśli po przetworzeniu pozostaną jakiekolwiek pozostałości tkanek, dodanie większej ilości roztworu enzymatycznego i wydłużenie czasu inkubacji może z...

Na wczesnym etapie rozwoju limfocytów T, multipotencjalni progenitorzy pochodzący z hematopoetycznych komórek macierzystych szpiku kostnego są rekrutowani do kory grasicy, przechodzą zobowiązanie do linii T i stają się prekursorami limfocytów T1. W korze mózgowej podwójnie ujemne (DN) tymocyty CD4 i CD8 prekursorowe limfocytów T rozszerzają się i różnicują w niedojrzałe podwójnie dodatnie (DP) tymocyty CD4 i CD8, tworząc dużą pulę komórek progenitorowych z wysoce zmiennymi receptorami limfocytów T1. Tylko wybrany podzbiór komórek DP ograniczony przez MHC stanie się tymocytami CD4 lub CD8 pojedynczymi dodatnimi (SP), migruje do rdzenia grasicy i różnicuje się w funkcjonalnie kompetentne dojrzałe limfocyty T, co jest określane jako selekcja pozytywna2-6. Natomiast klony autoreaktywnych tymocytów przechodzą selekcję negatywną i są usuwane przez apoptozę, przekształcane w regulatorowe limfocyty T w celu samotolerancji lub kierowane do limfocytów śródnabłonkowych do celów, które nie są jeszcze jasne3,7-10.
W grasicy, komórki zrębu grasicy tworzą unikalne mikrośrodowisko dostarczające sygnałów dla tych różnych losów rozwoju limfocytów T5,11,12. Komórki zrębu grasicy składają się z komórek nabłonka grasicy (TEC) - w tym TEC korowych (cTEC) i rdzeniastych TEC (mTEC), komórek dendrytycznych, makrofagów, fibroblastów, komórek śródbłonka, perycytów pochodzących z grzebienia nerwowego i innych komórek mezenchymalnych13-15. Wśród nich TEC mają kluczowe znaczenie na różnych etapach rozwoju limfocytów T1,2,16,17. Brak solidnego sposobu izolowania TEC utrudnia jednak pełne zrozumienie ich funkcji16. W szczególności cTEC, które tworzą trójwymiarową sieć otaczającą przodków w korze mózgowej, są niezbędne dla selekcji pozytywnej13,18,19 z powodów, które nie są jeszcze jasne. Wcześniejsze badania dostarczyły wskazówek co do niejednorodności i roli TEC, opierając się głównie na narzędziach morfologicznych i histologicznych13. Ostatnio unikalne role podzbiorów TEC zostały omówione za pomocą podejść genetycznych w modelach mysich12,20. Solidny i powtarzalny sposób izolowania TEC ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia bezstronnej charakterystyki podzbiorów TEC, ilościowej i jakościowej oceny funkcji TEC oraz wyjaśnienia mechanizmów, w jaki sposób cTEC wspierają selekcję pozytywną.
Ze względu na rzadkość występowania TEC w grasicy i ścisłe interakcje, które tworzą w nienaruszonym organie, izolacja TEC była wyzwaniem. Opisany tutaj protokół oparty jest na wcześniejszych odkryciach, obecnie dostępnych odczynnikach, technikach oraz wiedzy na temat struktury grasicy i składu zrębu. Prawie dwie dekady temu opisano kilka procedur dezagregacji tkanek grasicy21-27, w których podczas trawienia stosowano różne enzymy, w tym trypsynę, kolagenazę i dyspazę. Gray i wsp. porównali te enzymy w ich poprzedniej fazie28 i opisali ulepszoną metodę z wieloetapowym trawieniem koktajli enzymatycznych29, która stała się szeroko stosowana20,30. Jednak metoda ta wymaga długiego czasu przygotowania i złożonych etapów trawienia, a w rezultacie uzyskuje się zmienną końcową liczbę komórek i proporcje TEC nawet w tej samej kohorcie myszy29,30. Kilka lat temu w dysocjacji tkanek grasicy zaczęto stosować enzym badawczy Liberazy, zawierający wysoko oczyszczoną kolagenazę i neutralną proteazę30. W tym miejscu opisujemy protokół trawienia oparty na Liberazie, ze zoptymalizowanymi procedurami separacji mechanicznej, który daje dużą liczbę żywotnych TEC z tkanek grasicy myszy.
Aby wzbogacić zdysocjowane komórki zrębu, poprzednie badania wykorzystywały albo gradienty gęstości, albo separację magnetycznych kulek21,29. Jednak obie metody powodują poważne straty niektórych populacji komórek zrębu grasicy, w szczególności populacji cTECs29. Techniki cytotoksycznej eliminacji i płukania31,32 są szeroko stosowane do zubożenia lub separacji limfocytów w polu immunologicznym12,31. Po porównaniu tych technik ustaliliśmy obecny protokół panoramowania w celu wzbogacenia TEC. Łagodny stan podczas procedury wzbogacania prowadzi do mniejszej śmierci komórek oraz bezstronnego i zwiększonego odzyskiwania TEC.
Izolowana zawiesina komórek grasicy opisana w sekcji 3 może być bezpośrednio zastosowana do analizy cytometrycznej przepływowej w celu identyfikacji i charakterystyki podzbiorów TEC i komórek dendrytycznych. W sekcji 4 opisano prosty i użyteczny sposób identyfikacji podzbiorów TEC za pomocą wieloparametrowego cytometru przepływowego. W przypadku eksperymentów, które mają na celu uzyskanie oczyszczonych cTEC lub mTEC, procedury wzbogacania TEC i sortowania komórek można znaleźć w sekcjach 5 i 6.

<table><tbody><tr><td>Przeciw myszom EpCAM</td><td>eBioscience</td><td>XX-5791-YY*</td><td>Klon G8.8</td></tr><tr><td>Anty-mysz MHC II</td><td>eBioscience</td><td>XX-5321-YY*</td><td>Klon M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Anty-mysz Ly51</td><td>eBioscience</td><td>XX-5891-YY*</td><td>Klon 6C3</td></tr><tr><td>UEA-1</td><td>Vector Laboratory</td><td>FL-1061</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Sortownik przepływowy</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Probówki FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>*XX różni się w zależności od fluorochromu, a YY różni się w zależności od wielkości fiolki.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Grasica jest ważnym organem do rozwoju limfocytów T. Spośród komórek zrębu grasicy, komórki nabłonkowe grasicy (TEC) są szczególnie ważne na wielu etapach rozwoju limfocytów T: zaangażowaniu limfocytów T, selekcji pozytywnej i selekcji negatywnej. Jednak funkcja TEC w grasicy pozostaje nie w pełni poznana. W artykule przedstawiono metodę izolowania podzbiorów TEC ze świeżej grasicy myszy przy użyciu połączenia rozerwania mechanicznego i trawienia enzymatycznego. Metoda ta pozwala na efektywne uwalnianie komórek zrębowych grasicy i tymocytów z połączeń komórka-komórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa oraz tworzenie zawiesiny jednokomórkowej. Korzystając z izolowanych komórek, wieloparametrowa cytometria przepływowa może być stosowana do identyfikacji i charakterystyki TEC i komórek dendrytycznych. Ponieważ TEC są rzadką populacją komórek w grasicy, opisujemy również skuteczny sposób wzbogacania i oczyszczania TEC poprzez zubożenie tymocytów, najliczniejszego typu komórek w grasicy. Po wzbogaceniu czas sortowania komórek może zostać skrócony, dzięki czemu utrata żywotności komórek może zostać zminimalizowana podczas oczyszczania TEC. Oczyszczone komórki nadają się do różnych dalszych analiz, takich jak Real Time-PCR, Western blot i profilowanie ekspresji genów. Protokół będzie promował badania nad funkcją TEC, a także rozwój rekonstytucji limfocytów T in vitro.

Zgodnie z niniejszym protokołem, grasiczkę usunięto z dorosłej myszy (Sekcja 2), a następnie przygotowano zawiesinę komórek grasiczki, jak opisano w Sekcji 3. Otrzymana zawiesina komórek składała się z tymocytów, komórek zrębowych pochodzenia hematopoetycznego oraz komórek zrębowych niehematopoetycznych. CD45 jest panmarkerem hematopoetycznym wykazywanym zarówno przez tymocyty, jak i hematopoetyczne komórki zrębowe, takie jak makrofagi i komórki dendrytyczne. W przeciwieństwie do nich, TEC nie mają pochodzenia hematopoet...

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie, zidentyfikowanie i oczyszczenie komórek nabłonka grasicy lub technologii. Osiąga się to poprzez najpierw enzymatycznie, trawienie i mechaniczne rozbijanie grasicy w celu dysocjacji technologii w zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie technologia może być analizowana za pomocą cytometrii przepływowej lub wzbogacana za pomocą strategii panoramowania.Ostatecznie podzbiory nabłonka grasicy można oczyścić przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na wiele kluczowych pytań w dziedzinie rozwoju komórek T, takich jak: w jaki sposób komórki nabłonka grasicy promują selekcję grasicy? Co powoduje dysfunkcję grasicy u starzejących się zwierząt i jak możemy osiągnąć rekonstytucję limfocytów T in vitro?Głównymi zaletami tej techniki są wysoki odzysk zmiennych emmicznych komórek rozrodczych, bezstronne wzbogacenie komórek nabłonka emmicznego oraz wysoka czystość, którą ostatecznie można osiągnąć poprzez sortowanie komórek. Aby wyizolować komórki zrębu grasicy, najpierw zidentyfikuj grasicę, która znajduje się tuż pod żebrami i wygląda jak dwa cienkie białe płaty pokrywające serce. Następnie odłącz tkankę ł

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Ten raport zawiera szczegółowy opis przeszczepiania mysiej thymi od myszy dawców w różnym wieku pod torebkę nerkową mysich biorców z niedoborem odporności. Celem tego podejścia jest modelowanie rozwoju limfocytów T i zdarzeń selekcji grasicy in vivo.

Izolacja i przeszczep różnych wiekowych mysich przeszczepów grasicy.

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mysich mezenchymów jelitowych, w tym telocytów. Mogą one być wykorzystywane do kilku zastosowań, takich jak współhodowla z organoidami pochodzącymi od myszy lub ludzi, w celu wsparcia wzrostu i lepszego odzwierciedlenia sytuacji w oryginalnej tkance.

Izolacja mysiej mezenchymy jelitowej skutkująca wysoką wydajnością telocytów

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Poznaj metodę izolacji i oczyszczania mysich komórek nabłonkowych grasicy przy użyciu cytometrii przepływowej oraz sortowania komórek aktywowanych fluorescencją. Technika ta umożliwia badanie rozwoju limfocytów T i funkcji grasicy.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Przeglądaj więcej filmów