Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy
8 sierpnia 2014
Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie, zidentyfikowanie i oczyszczenie komórek nabłonka grasicy lub technologii. Osiąga się to poprzez najpierw enzymatycznie, trawienie i mechaniczne rozbijanie grasicy w celu dysocjacji technologii w zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie technologia może być analizowana za pomocą cytometrii przepływowej lub wzbogacana za pomocą strategii panoramowania.
Ostatecznie podzbiory nabłonka grasicy można oczyścić przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na wiele kluczowych pytań w dziedzinie rozwoju komórek T, takich jak: w jaki sposób komórki nabłonka grasicy promują selekcję grasicy? Co powoduje dysfunkcję grasicy u starzejących się zwierząt i jak możemy osiągnąć rekonstytucję limfocytów T in vitro?
Głównymi zaletami tej techniki są wysoki odzysk zmiennych emmicznych komórek rozrodczych, bezstronne wzbogacenie komórek nabłonka emmicznego oraz wysoka czystość, którą ostatecznie można osiągnąć poprzez sortowanie komórek. Aby wyizolować komórki zrębu grasicy, najpierw zidentyfikuj grasicę, która znajduje się tuż pod żebrami i wygląda jak dwa cienkie białe płaty pokrywające serce. Następnie odłącz tkankę łączną otaczającą grasicę i użyj zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby delikatnie pociągnąć i usunąć płaty grasicy.
Umieść płaty w sześciodołkowej płytce zawierającej pięć mililitrów pożywki i przytnij otaczający tłuszcz i tkankę łączną. Następnie przenieś przycięte płaty do nowej studzienki zawierającej pięć mililitrów świeżo przygotowanego roztworu enzymatycznego i użyj cienkich nożyczek, aby wykonać małe nacięcia w tkance. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po 20 minutach delikatnie odpipetuj tkankę w górę i w dół kilka razy za pomocą pięciomililitrowej pipety, aby zdysocjować zawiesinę zawiesiny jednokomórkowej. Zebrać frakcję supernatantu w 50-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów zimnego buforu bogatego w albuminy na lodzie w celu zneutralizowania enzymów. Następnie dodaj 2,5 mililitra roztworu enzymatycznego do pozostałej tkanki.
Inkubować płytkę przez 15 minut. Następnie delikatnie porusz tkankę trzymililitrową strzykawką wyposażoną w igłę z 18 genami, aby rozbić wszelkie agregaty. Następnie przenieś do probówki zbiorczej.
Następnie dodaj 2,5 mililitra roztworu enzymatycznego do pozostałej tkanki. Inkubować płytkę przez 15 minut. Po trzeciej inkubacji powtórzyć mieszanie mechaniczne za pomocą igły 20 5G.
Po inkubacji tkanki przez ostatnie pięć do 10 minut, przenieś supernatant do probówki zbiorczej w celu odwirowania w celu zidentyfikowania odzyskanej technologii za pomocą cytometrii przepływowej Postępując zgodnie ze standardowymi procedurami barwienia przeciwciał, uruchom próbki na wieloparametrowym cytometrze przepływowym i przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy faksu, aby jeszcze bardziej wzbogacić technologię metodą panoramowania. Najpierw należy inkubować komórki z odpowiednim przeciwciałem do wzbogacenia. Następnie dodaj zawiesinę komórek do wstępnie zakodowanej płytki do panoramowania, a następnie zamieszaj płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej.
Po 30 minutach energicznie zamieszaj płytkę, a następnie przenieś supernatant do stożkowej probówki. Opłucz płytkę dwa razy świeżym, średnim, zbierając popłuczyny w tubie zbiorczej. Następnie, po odwirowaniu komórek, ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach świeżej, pożywki i przenieś zawiesinę komórek na nową płytkę do płukania, zbierając komórki po zawirowaniu i inkubacji, jak właśnie pokazano, aby dalej oczyścić wzbogaconą technologię do ich podzbiorów komórek grasicy.
Po znakowaniu odpowiednimi przeciwciałami, posortuj technologię przez dyszę o długości 100 mikrometrów poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, zbierając komórki w 30% objętości na objętość FBS w pożywce. W tej reprezentatywnej strategii bramkowania do identyfikacji technologii za pomocą cytometrii przepływowej można zaobserwować ekspresję epca, ale nie CD 45 przez technologię. W ten sposób technologia może być bramkowana zgodnie z ich ep, camm i CD 45 technologia składa się z podzbiorów nabłonka kory mózgowej lub CEC oraz rdzenia lub mtech nabłonka grasicy.
Podzbiory te można odróżnić po żywym przeciwciałie 51, które rozpoznaje glutamyloaminopeptydazę G wyrażaną przez ctec i lektynę UEA, która wiąże się z mtech zarówno ctech, jak i Mtech ekspresują MHC klasy drugiej na ich powierzchni. Chociaż mtech można dalej podzielić na populacje mtech low i mtech high, w zależności od poziomu ekspresji MHC dwa, około osiem razy więcej technologii można odzyskać przy użyciu właśnie zademonstrowanego protokołu opartego na enzymach liazy w porównaniu z protokołem z kolagenazą i przestrzenią dyskową z około dziewięć razy 10 do piątej, który można odzyskać tylko z jednej grasicy myszy w celu skrócenia czasu sortowania i zwiększenia żywotności odzyskane komórki zrębu. Panoramowanie może być stosowane, jak właśnie wykazano, w celu zubożenia miejsc tymocytów w porównaniu z całymi przygotowanymi komórkami grasicy.
Udział technologii wzrasta z mniej niż 0,5% do ponad 15% w populacji komórek po wzbogaceniu. Po panoramowaniu proporcje podzbiorów technicznych nie są zmieniane, co sugeruje, że żaden z nich nie jest selektywnie tracony podczas panoramowania. W porównaniu z próbką do wzbogacania preen, wskaźnik odzysku technologii wynosi około 85%Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wzbogacić tematyczne komórki rozrodcze z więcej niż paniki, a także jak zidentyfikować i oczyścić bardziej tematyczne subsydy nabłonka za pomocą cytometrii przepływowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania komórek nabłonkowych grasicy mysiej (TEC). Protokół został zaprojektowany w celu ułatwienia badań nad funkcją grasicy, rozwojem komórek T i dysfunkcją grasicy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Funkcja grasicy
Tło
- Komórki nabłonkowe grasicy odgrywają kluczową rolę w rozwoju komórek T.
- Zrozumienie TEC może dostarczyć wglądu w procesy selekcji grasicy.
- Dysfunkcja grasicy jest związana z starzeniem się i różnymi chorobami.
- Rekonstytucja komórek T jest niezbędna dla strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Izolacja i oczyszczanie TEC w celu szczegółowej analizy.
- Zbadanie mechanizmów selekcji grasicy.
- Zbadanie przyczyn dysfunkcji grasicy w trakcie starzenia się.
Stosowane metody
- Enzymatyczne trawienie i mechaniczne uszkodzenie grasicy.
- Cytometria przepływowa do analizy TEC.
- Strategia panningu do wzbogacenia TEC.
- Sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie do oczyszczania podzbiorów TEC.
Główne wyniki
- Skuteczne izolowanie i oczyszczanie TEC.
- Identyfikacja kluczowych podzbiorów TEC zaangażowanych w rozwój komórek T.
- Wgląd w mechanizmy selekcji grasicy.
- Potencjalne implikacje dla terapii rekonstytucji komórek T.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w badaniu TEC.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia funkcji i dysfunkcji grasicy.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole w celu zbadania rozwoju komórek T.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating rare stromal populations like thymic epithelial cells enables mechanistic de-risking of T-cell development hypotheses and supports predictive confidence in immunotherapy target validation. This method provides a disease-relevant system for studying thymic selection and dysfunction, directly informing preclinical model design and translational biomarker discovery. By improving recovery and viability of rare cell subsets, it reduces biological ambiguity in early discovery and enhances portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thymic epithelial cell function in T-cell commitment and selection pathways.
- Operational Value: Provides unbiased enrichment of rare TECs from murine thymus, increasing yield approximately eightfold over collagenase-based methods.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by allowing multiparameter flow cytometry identification of cortical and medullary TEC subsets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified TEC subsets suitable for downstream functional assays like gene expression profiling and Western blot.
- Operational Value: Reduces cell sorting time and minimizes viability loss through thymocyte depletion via panning prior to FACS.
- Operational Value: Enables standardized preparation of single-cell suspensions from thymic stroma for reproducible immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling of thymic dysfunction in aging and immune reconstitution studies.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by providing purified TECs for in vitro T-cell reconstitution.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in thymic selection and T-cell development pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing validated stromal inputs for immunological target assessment and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of thymic epithelial roles in positive and negative T-cell selection through isolatable, analyzable subsets.
- Screening: Delivers assay-ready, purified TEC populations with enhanced recovery and reduced sorting time for compound or modulator screening.
- Analytics: Enables quantitative multiparameter flow cytometry and molecular profiling (PCR, Western blot) for objective comparison of TEC states.
- Translational Research: Connects to preclinical T-cell reconstitution models by providing purified TECs capable of supporting lymphoid development in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for isolating rare thymic stromal cells applicable across immunology and immunotherapy discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T-cell development models by enabling reliable isolation and characterization of rare TEC subsets.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through enzymatic-mechanical dissociation and panning-based enrichment prior to FACS.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target validation in thymus-dependent immunological pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into thymic selection and stromal-immune crosstalk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation, flow cytometry staining, and fluorescence activated cell sorting.
- Dependent on access to cell culture incubators, centrifuges, flow cytometers, and panning plates coated with appropriate substrates.
- Necessitates standardization of enzyme digestion times and mechanical agitation steps to ensure consistent single-cell suspension quality.
- Requires adaptation considerations when applying to different mouse strains, ages, or disease models affecting thymic cellularity and stromal composition.
- Practical limitations include the rarity of TECs necessitating enrichment steps and the need for careful viability maintenance during prolonged sorting.
