Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie, zidentyfikowanie i oczyszczenie komórek nabłonka grasicy lub technologii. Osiąga się to poprzez najpierw enzymatycznie, trawienie i mechaniczne rozbijanie grasicy w celu dysocjacji technologii w zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie technologia może być analizowana za pomocą cytometrii przepływowej lub wzbogacana za pomocą strategii panoramowania.

Ostatecznie podzbiory nabłonka grasicy można oczyścić przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na wiele kluczowych pytań w dziedzinie rozwoju komórek T, takich jak: w jaki sposób komórki nabłonka grasicy promują selekcję grasicy? Co powoduje dysfunkcję grasicy u starzejących się zwierząt i jak możemy osiągnąć rekonstytucję limfocytów T in vitro?

Głównymi zaletami tej techniki są wysoki odzysk zmiennych emmicznych komórek rozrodczych, bezstronne wzbogacenie komórek nabłonka emmicznego oraz wysoka czystość, którą ostatecznie można osiągnąć poprzez sortowanie komórek. Aby wyizolować komórki zrębu grasicy, najpierw zidentyfikuj grasicę, która znajduje się tuż pod żebrami i wygląda jak dwa cienkie białe płaty pokrywające serce. Następnie odłącz tkankę łączną otaczającą grasicę i użyj zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby delikatnie pociągnąć i usunąć płaty grasicy.

Umieść płaty w sześciodołkowej płytce zawierającej pięć mililitrów pożywki i przytnij otaczający tłuszcz i tkankę łączną. Następnie przenieś przycięte płaty do nowej studzienki zawierającej pięć mililitrów świeżo przygotowanego roztworu enzymatycznego i użyj cienkich nożyczek, aby wykonać małe nacięcia w tkance. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 20 minutach delikatnie odpipetuj tkankę w górę i w dół kilka razy za pomocą pięciomililitrowej pipety, aby zdysocjować zawiesinę zawiesiny jednokomórkowej. Zebrać frakcję supernatantu w 50-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów zimnego buforu bogatego w albuminy na lodzie w celu zneutralizowania enzymów. Następnie dodaj 2,5 mililitra roztworu enzymatycznego do pozostałej tkanki.

Inkubować płytkę przez 15 minut. Następnie delikatnie porusz tkankę trzymililitrową strzykawką wyposażoną w igłę z 18 genami, aby rozbić wszelkie agregaty. Następnie przenieś do probówki zbiorczej.

Następnie dodaj 2,5 mililitra roztworu enzymatycznego do pozostałej tkanki. Inkubować płytkę przez 15 minut. Po trzeciej inkubacji powtórzyć mieszanie mechaniczne za pomocą igły 20 5G.

Po inkubacji tkanki przez ostatnie pięć do 10 minut, przenieś supernatant do probówki zbiorczej w celu odwirowania w celu zidentyfikowania odzyskanej technologii za pomocą cytometrii przepływowej Postępując zgodnie ze standardowymi procedurami barwienia przeciwciał, uruchom próbki na wieloparametrowym cytometrze przepływowym i przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy faksu, aby jeszcze bardziej wzbogacić technologię metodą panoramowania. Najpierw należy inkubować komórki z odpowiednim przeciwciałem do wzbogacenia. Następnie dodaj zawiesinę komórek do wstępnie zakodowanej płytki do panoramowania, a następnie zamieszaj płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej.

Po 30 minutach energicznie zamieszaj płytkę, a następnie przenieś supernatant do stożkowej probówki. Opłucz płytkę dwa razy świeżym, średnim, zbierając popłuczyny w tubie zbiorczej. Następnie, po odwirowaniu komórek, ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach świeżej, pożywki i przenieś zawiesinę komórek na nową płytkę do płukania, zbierając komórki po zawirowaniu i inkubacji, jak właśnie pokazano, aby dalej oczyścić wzbogaconą technologię do ich podzbiorów komórek grasicy.

Po znakowaniu odpowiednimi przeciwciałami, posortuj technologię przez dyszę o długości 100 mikrometrów poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, zbierając komórki w 30% objętości na objętość FBS w pożywce. W tej reprezentatywnej strategii bramkowania do identyfikacji technologii za pomocą cytometrii przepływowej można zaobserwować ekspresję epca, ale nie CD 45 przez technologię. W ten sposób technologia może być bramkowana zgodnie z ich ep, camm i CD 45 technologia składa się z podzbiorów nabłonka kory mózgowej lub CEC oraz rdzenia lub mtech nabłonka grasicy.

Podzbiory te można odróżnić po żywym przeciwciałie 51, które rozpoznaje glutamyloaminopeptydazę G wyrażaną przez ctec i lektynę UEA, która wiąże się z mtech zarówno ctech, jak i Mtech ekspresują MHC klasy drugiej na ich powierzchni. Chociaż mtech można dalej podzielić na populacje mtech low i mtech high, w zależności od poziomu ekspresji MHC dwa, około osiem razy więcej technologii można odzyskać przy użyciu właśnie zademonstrowanego protokołu opartego na enzymach liazy w porównaniu z protokołem z kolagenazą i przestrzenią dyskową z około dziewięć razy 10 do piątej, który można odzyskać tylko z jednej grasicy myszy w celu skrócenia czasu sortowania i zwiększenia żywotności odzyskane komórki zrębu. Panoramowanie może być stosowane, jak właśnie wykazano, w celu zubożenia miejsc tymocytów w porównaniu z całymi przygotowanymi komórkami grasicy.

Udział technologii wzrasta z mniej niż 0,5% do ponad 15% w populacji komórek po wzbogaceniu. Po panoramowaniu proporcje podzbiorów technicznych nie są zmieniane, co sugeruje, że żaden z nich nie jest selektywnie tracony podczas panoramowania. W porównaniu z próbką do wzbogacania preen, wskaźnik odzysku technologii wynosi około 85%Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wzbogacić tematyczne komórki rozrodcze z więcej niż paniki, a także jak zidentyfikować i oczyścić bardziej tematyczne subsydy nabłonka za pomocą cytometrii przepływowej.