Name: Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę śledzenia komórek z wykorzystaniem białek fotokonwertowalnych w żywych zarodkach Danio rerio. Technika ta umożliwia precyzyjną obserwację zdarzeń komórkowych podczas rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr. Ianowi C. Scottowi z Hospital for Sick Children w Toronto w Kanadzie za udostępnienie transgenicznej linii rybek zebrafish Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7. Dziękujemy Confocal and 2-Photon Microscopy Core Facility (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine) oraz dr. Zoltana Cseresnyesa za doskonałą pomoc techniczną i ogólne wsparcie w zakresie obrazowania. S.A.-S. jest wspierany przez stypendium Heisenbergowskie Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Praca ta była finansowana z grantu DFG SE2016/7-1.

1. Pozyskiwanie embrionów do testu fotokonwersji
Po krzyżowaniu wewnątrz linii transgenicznych danio-przewodników (zebrafish) wykazujących ekspresję PCFP, wybierane są najjaśniejsze embriony homozygotyczne, które następnie hodowane są w temperaturze 28.5 °C aż do osiągnięcia pożądanego stadium embrionalnego15.
Uwaga 1: Ta wstępna selekcja pozwoli na skanowanie embrionów przy niskiej mocy lasera, zapobiegając tym samym fototoksyczności i fotobleachingowi.
Uwaga 2: Sugerujemy stosowanie światła o niskim natężeniu podczas wizualizacji embrionów oraz utrzymywanie ich w ciemności ze względu na wysoką wrażliwość PCFP, takich jak Kaede i KikGR, na ekspozycję na światło, w tym na światło dzienne.
2. Oddawanie w blok
<ol>
	<li>W szklanym naczyniu z wodą do jaj przeniesie się embriony pod stereomikroskopem i usunie błonkę naskórkową (dechorionizacja) za pomocą pęsety.</li>
	<li>Zanurzyć embriony w roztworze Tricaine (3-amino benzoic acidethylester, Sigma-Aldrich) o stężeniu 0.16 mg/ml w celu ich znieczulenia (40μl roztworu stokowego 4 mg/ml w 1 ml medium E3 1X).</li>
</ol>
Uwaga 1: Przenosić zarodki za pomocą szklanej pipety lub pipety o ściętym końcu (P1000), aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia zarodków.
Uwaga 2: Młode embriony po dechorionizacji nie powinny być wystawiane na działanie powietrza ani wynoszone do granicy woda/powietrze, ponieważ jaja łatwo pękają pod wpływem stresu mechanicznego.
<ol start="3">
	<li>Przenieś znieczulony embrion na pokrywkę naczynia hodowlanego, utrzymując go w jak najmniejszej objętości medium.</li>
	<li>Przenieś embrion do agarozy, pipetując go w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (LMA, Lonza) o temperaturze 30 °C zawierającej 0,16 mg/ml Tricaine, a następnie umieść go na szkiełku podstawowym naczynia hodowlanego z podstawką ze szkła kryształowego (MatTek Corp. Ashland MA USA). Następnie zorientuj embrion za pomocą gładkiego plastikowego końcówki (np. przyciętej końcówki pipety Microloader, Eppendorf), a po spolimeryzowaniu LMA przykryj agarozę roztworem 0,16 mg/ml Tricaine.</li>
</ol>
Uwaga 1: Rozpuść 1% LMA w temperaturze 60 °C i utrzymuj roztopiony agarozę w temperaturze 30 °C.
3. Fotokonwersja
<ol>
	<li>Za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w źródła laserowe 405 nm, 488 nm i 561 nm, takiego jak Zeiss LSM 710, zwizualizuj próbkę poprzez skan z-Stack obejmujący całą strukturę preparatu, który ma zostać poddany fotokonwersji i późzemu śledzeniu, wykorzystując laser 488 nm (t.j. laser Ar 30 mW, przy intensywności 5-7 %, detektor ustawiony na 493-540 nm) oraz laser 561 nm (t.j. laser DPSS 561 10 mW, przy intensywności 7-9 %, detektor ustawiony na 587-651), aby przeskanować tkankę/organ w kierunku odpowiednio zielonej i czerwonej fluorescencji białek fotokonwertowalnych.</li>
</ol>
Uwaga 1: Do skanowania przed fotokonwersją zastosowano obiektyw Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
Uwaga 2: Przed eksperymentem zawsze należy przeprowadzić skanowanie w poszukiwaniu fluorescencji czerwonej, aby wykluczyć obecność przypadkowo wytworzonego, przekształconego PCFP o czerwonej fluorescencji.
<ol start="2">
	<li>Wybierz narzędzie Time series i ustaw 2 cykle bez odstępu czasowego (jeden dla etapu przed i jeden dla etapu po fotokonwersji).</li>
	<li>Wybierz narzędzie Regions i zdefiniuj jeden lub więcej obszarów zainteresowania (ROI) do fotokonwersji.</li>
</ol>
Uwaga 1: Zalecamy, aby w pierwszej kolejności określić precyzję, z jaką obszar faktycznie poddany fotokonwersji przez laser skanujący w ROI pokrywa się z obszarem ROI wybranym w oprogramowaniu, mierząc powierzchnię tkanki/komórek poddanych fotokonwersji we wszystkich trzech kierunkach (xy i z) w utrwalonym preparacie, w którym nie przewiduje się ruchu komórek ani białek. Dla ustawień opisanych w niniejszym zastosowaniu ROI pokrywało się z obszarem poddanym fotokonwersji z dużą precyzją, jednak zależy to od użytego obiektywu oraz ilości światła laserowego zastosowanego do fotokonwersji. Rozmiar ROI może zostać zredukowany do rozmiaru pojedynczej komórki, w zależności od apertury numerycznej obiektywu, stopnia powiększenia oraz ilości światła laserowego wykorzystanego do fotokonwersji.
<ol start="4">
	<li>Wybierz narzędzie Bleaching i ustaw rozpoczęcie wybielania po pierwszym z dwóch skanowań. Do fotokonwersji zastosowano laser diodowy o mocy 30 mW i długości fali 405 nm, a parametry starannie zoptymalizowano w celu uzyskania minimalnej ilości światła laserowego niezbędnej do pełnej fotokonwersji, co osiągnięto głównie poprzez zmianę natężenia światła laserowego, liczby iteracji skanowania ROI oraz czasu piksela (tj. prędkości skanowania).</li>
</ol>
Uwaga 1: Do fotokonwersji wykorzystano obiektyw Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
Uwaga 2: Moc lasera oraz liczba iteracji muszą zostać określone empirycznie dla każdego ustawienia eksperymentalnego i powinny zapewnić całkowitą fotokonwersję PCFP z zielonego na czerwony w obrębie ROI przy minimalnej niezbędnej ilości światła laserowego, aby ograniczyć fototoksyczność. Zalecamy rozpoczęcie testów przy użyciu niskiej mocy lasera (np. 3 %, co odpowiada 0,03 mW w płaszczyźnie obiektywu) w połączeniu z niską liczbą iteracji (np. 20), a następnie stopniowe zwiększanie mocy lasera aż do uzyskania całkowitej fotokonwersji, co w naszych badaniach nastąpiło przy mocy lasera 10% (co odpowiada 0,1 mW w płaszczyźnie obiektywu). W tych warunkach wszystkie badane embriony przeżyły plan zabiegu. Zaobserwowaliśmy jednak, że błona żółtka jest wrażliwa na impulsy laserowe i może zostać łatwo uszkodzona, co prowadzi do śmierci embrionu. Z tego powodu śmiertelność embrionów po fotokonwersji może wystąpić, jeśli położenie tkanki docelowej znajduje się blisko ciała żółtka.
<ol start="5">
	<li>Wykonaj skan z-Stack próbki przy użyciu laserów o długości fali 488 nm i 561 nm, aby zwizualizować pozostałą zieloną oraz fotokonwertowaną czerwoną fluorescencję PCFP.</li>
</ol>
Uwaga 1: Do skanowania po fotokonwersji zastosowano obiektyw Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
4. Usunięcie zarodka z agarozy
<ol>
	<li>Wylać roztwór i ostrożnie wyjąć zarodek z 1% LMA za pomocą igły lub gładkiego plastikowego tipsa.</li>
	<li>Przechowywać zarodek w wodzie jajowej (egg water) w ciemności w temperaturze 28.5 °C aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju.</li>
</ol>
Uwaga 1: Ważne jest, aby embriony kontynuowały swój rozwój w wodzie jajowej, szczególnie w pierwszych dniach rozwoju podczas wydłużania ciała embrionalnego. Rzeczywiście, niektóre tkanki/organy embrionalne zmieniają swoje położenie w trakcie rozwoju i dlatego wymagają specyficznej orientacji podczas zatapiania, co zależy od konkretnej tkanki/organu oraz pożądanego stadium rozwoju poddanego analizie.
5. Ponowne zatapianie
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w punkcie 2.) niniejszego protokołu.</li>
</ol>
6. Śledzenie tkanki poddanej fotokonwersji w późniejszych stadiach embrionalnych
<ol>
	<li>Skanowanie obszaru zainteresowania (z-Stack) przy użyciu laserów o długości fali 488 nm oraz 561 nm odpowiednio dla zielonego i czerwonego sygnału fluorescencyjnego.</li>
</ol>
Uwaga 1: Do skanowania x godzin po fotokonwersji użyto obiektywu Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
Uwaga 2: Ponieważ protokół ten nie wpływa na prawidłowy rozwój zarodka, możliwe jest obserwowanie poddanego fotokonwersji zarodka na późniejszych etapach rozwoju (w tym celu należy postępować zgodnie z instrukcjami opisanymi w punktach 4 - 6).
7. Reprezentatywne wyniki
Przykład testu fotokonwersji przedstawiono na Rysunku 1. Śledziliśmy komórki śródbłonka podczas rozwoju danio pręgowanego (przegląd anatomii naczyniowej rozwijającego się danio pręgowanego znajduje się w16). W związku z tym zastosowaliśmy linię reporterową danio pręgowanego Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 wykazującą ekspresję KikGR w jądrach komórek śródbłonka17. Embriony homozygotyczne o silnej ekspresji hodowano w temperaturze 28.5 °C do 48 h po zapłodnieniu (hpf). Po dechorionacji embriony znieczulono i zatopiono w LMA, ustawiając stronę przednio-grzbietową embrionu w stronę szkiełka podstawowego, aby lepiej uwidocznić naczynia głowy. Do testu fotokonwersji i dalszego śledzenia fotokonwertowanego białka wykorzystaliśmy odwrócony mikroskop konfokalny (Zeiss LSM 710 Meta) wyposażony w lasery pracujące w długościach fal 405 nm, 488 nm i 561 nm oraz obiektyw Plan Apochromat 20x/NA 0.8. Jak pokazano na Rysunku 1A, przed fotokonwersją KikGR był wykazujący ekspresję w tkance śródbłonka i był wykrywalny jedynie jako fluorescencja zielona przy użyciu lasera argonowego 488 nm. Skanowanie kontrolne laserem DPSS 561-10 561 nm w celu wykrycia fluorescencji czerwonej nie wykazało obecności fotokonwertowanego KikGR przed przeprowadzeniem fotokonwersji (Rysunek 1A). Następnie obszar ROI został całkowicie poddany fotokonwersji przy użyciu lasera diodowego 405 nm (przy intensywności 10%, 20 iteracji), a naczynia głowy ponownie przeskanowano laserami 488 nm i 561 nm (Rysunek 1B). Jak pokazano na Rysunku 1B, zielony KikGR w obszarze ROI całkowicie zmienił kolor na czerwony. Po teście fotokonwersji embrion usunięto z agarozy i hodowano w temperaturze 28.5 °C w wodzie do jaj. Na koniec embrion ponownie obserwowano 24 h po fotokonwersji, około 72 hpf, aby śledzić fotokonwertowane komórki śródbłonka w późniejszych stadiach (Rysunek 1C). W tym celu embrion ponownie zatopiono w LMA i przeskanowano laserami 488 nm i 561 nm. Jak pokazano na Rysunku 1C, w tkance śródbłonka pochodzącej z fotokonwertowanego ROI zaobserwowano zarówno białka KikGR niekonwertowane, jak i fotokonwertowane, co wynika ze stabilności czerwonej fluorescencji fotokonwertowanego KikGR oraz resyntezy nowego, zielonego, niekonwertowanego KikGR.
<img alt="Proces fotokonwersji u danio-pręgopławca; zmiana białka fluorescencyjnego na obrazach mikroskopowych w czasie." src="/files/ftp_upload/4350/4350fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Fotokonwersja KikGR podczas rozwoju danio-pręgopławca. (A,B) Specyficzny region naczyń krwionośnych głowy śródbłonka został poddany fotokonwersji w 48 hpf w zarodkach transgenicznych Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 i (C) ponownie zaobserwowany 24 h po fotokonwersji (około 72 hpf). Przedstawiono fluorescencję KikGR (zielona), fotokonwertowanego KikGR (czerwona) oraz kanały nałożone. Przerywane okręgi wskazują ROI przed, po oraz 24 h po fotokonwersji. Obrazy przedstawiają widok grzbietowy zarodka danio-pręgopławca, z częścią przednią skierowaną w dół. Paski skali: 50 μm.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Białko (akronim)</td >
			<td >Ex (nm)</td >
			<td >Em (nm)</td >
			<td >EC </td >
			<td >QY</td >
			<td >Struktura czwartorzędowa</td >
			<td >Jasność </td >
			<td >Zastosowanie</td >
			<td >Ref</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Kaede_G</td >
			<td >508</td >
			<td >518</td >
			<td >99</td >
			<td >0.9</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >259</td >
			<td rowspan="2">Śledzenie komórek</td >
			<td rowspan="2">2,6</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Kaede_R</td >
			<td >572</td >
			<td >580</td >
			<td >60</td >
			<td >0.3</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >59</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >KikGR_G</td >
			<td >507</td >
			<td >517</td >
			<td >54</td >
			<td >0.7</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >112</td >
			<td rowspan="2">Śledzenie komórek</td >
			<td rowspan="2">3,6,8-10 </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >KikGR_R</td >
			<td >583</td >
			<td >593</td >
			<td >35</td >
			<td >0.6</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >68</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >mKikGR_G</td >
			<td >505</td >
			<td >515</td >
			<td >49</td >
			<td >0.7</td >
			<td >monomer</td >
			<td >101</td >
			<td rowspan="2">Dynamiczne śledzenie, obrazowanie superrozdzielcze</td >
			<td rowspan="2">13</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >mKikGR_R</td >
			<td >580</td >
			<td >591</td >
			<td >28</td >
			<td >0.6</td >
			<td >monomer</td >
			<td >53</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >EosFP_G</td >
			<td >506</td >
			<td >516</td >
			<td >72</td >
			<td >0.7</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >150</td >
			<td rowspan="2">Śledzenie komórek</td >
			<td rowspan="2">5,20</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >EosFP_R</td >
			<td >571</td >
			<td >581</td >
			<td >41</td >
			<td >0.5</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >67</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >tdEos_G</td >
			<td >506</td >
			<td >516</td >
			<td >34</td >
			<td >0.7</td >
			<td >dimer tandemowy</td >
			<td >165</td >
			<td rowspan="2">Obrazowanie superrozdzielcze</td >
			<td rowspan="2">12,14,21</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >tdEos_R</td >
			<td >569</td >
			<td >581</td >
			<td >33</td >
			<td >0.6</td >
			<td >dimer tandemowy</td >
			<td >59</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >mEos2_G</td >
			<td >506</td >
			<td >519</td >
			<td >56</td >
			<td >0.7</td >
			<td >monomer</td >
			<td >140</td >
			<td rowspan="2">Dynamiczne śledzenie, obrazowanie superrozdzielcze</td >
			<td rowspan="2">11,18</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >mEos2_R</td >
			<td >573</td >
			<td >584</td >
			<td >46</td >
			<td >0.7</td >
			<td >monomer</td >
			<td >90</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Dendra2_G</td >
			<td >490</td >
			<td >507</td >
			<td >45</td >
			<td >0.5</td >
			<td >monomer</td >
			<td >67</td >
			<td rowspan="2">Dynamiczne śledzenie, obrazowanie superrozdzielcze</td >
			<td rowspan="2">4,11</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dendra2_R</td >
			<td >553</td >
			<td >573</td >
			<td >35</td >
			<td >0.55</td >
			<td >monomer</td >
			<td >57</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela I. Właściwości fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych. W tabeli przedstawiono powszechną nazwę i/lub akronim każdego PCFP, maksymalne długości fal pobudzenia (Ex) i emisji (Em), molowe współczynniki ekstynkcji (EC, 10-3 M-1 cm-1 ), wydajność kwantową (QY), fizjologicznie istotną strukturę czwartorzędową, względną jasność (jako % EGFP), zastosowanie oraz referencje. Tabela zaadaptowana z Day and Davidson, 20101.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCFP</td>
			<td>Transgeniczne linie danio pręgowanego</td>
			<td>Źródło</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="10">Kaede</td>
			<td>Tg(elavl3:Kaede)rw0130a</td>
			<td>Okamoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(ins:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lhx5:Kaede)b1204/+</td>
			<td>ZIRC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(myl7:kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(olig2:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t</td>
			<td>ZIRC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS:Kaede)rk8</td>
			<td>ZIRC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(vsx2:Kaede)nns2</td>
			<td>Higashijima Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">KikGR</td>
			<td>Tg(kdrl:nlsKikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(krt4:NTR-KikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(myl7:nlsKikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(sox10:KikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS:KikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">EosFP</td>
			<td>Tg(sox10:EosFP)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(sox10:nlsEosFP)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dendra</td>
			<td>Tg(-8mpx:Dendra2)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS:Dendra-kras)</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela II. Transgeniczne linie danio pręgowanego wykazujące ekspresję PCFP. Dane uzyskane z bazy danych modelowych organizmów Zebrafish Model Organism Database (ZFIN, <a href="http://zfin.org/" target="_blank">http://zfin.org/</a>). Oznaczono dostępność linii w Zebrafish International Resource Center (ZIRC, <a href="http://zebrafish.org/zirc/" target="_blank">http://zebrafish.org/zirc/</a>).

<ol><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-rational+engineering+of+a+coral+fluorescent+protein+into+an+efficient+highlighter%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter.</a> EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).</li>
<li>Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li>
<li>Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+invasion+is+a+spatially-ordered+progression+into+the+head+with+higher+cell+proliferation+at+the+migratory+front+as+revealed+by+the+photoactivatable+protein%2C+KikGR%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR.</a> Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).</li>
<li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).</li>
<li>Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+iUBC-KikGR+photoconvertible+transgenic+mice+for+live+time-lapse+imaging+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development.</a> Genesis. 49, 591-598 (2011).</li>
<li>Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green-to-red+photoconvertible+fluorescent+proteins%3A+tracking+cell+and+protein+dynamics+on+standard+wide-field+mercury+arc-based+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes.</a> BMC Cell Biol. 11, 15(2010).</li>
<li>Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944(2008).</li>
<li>Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-associated+protein%2C+supervillin%2C+accelerates+F-actin-dependent+rapid+integrin+recycling+and+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility.</a> Traffic. 11, 782-799 (2010).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).</li>
<li>Lazic, S., Scott, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mef2cb+regulates+late+myocardial+cell+addition+from+a+second+heart+field-like+population+of+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish.</a> Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of zebrafish development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).</li>
<li>Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Foxd3+and+Mitf+regulates+cell+fate+plasticity+in+the+zebrafish+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest.</a> Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).</li>
<li>Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconvertible+fluorescent+protein+EosFP%3A+biophysical+properties+and+cell+biology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications.</a> Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

W ostatnich latach stworzono transgeniczne modele zwierzęce do ekspresji białek fotokonwertowalnych, takich jak Kaede lub KikGR. Zwierzęta te rozwijają się prawidłowo, co wskazuje, że białka te nie wywierają toksycznego wpływu na rozwój embrionalny. Pierwszy raport dotyczący testu fotokonwersji do śledzenia komórek w embrionach zwierząt został opublikowany przez Hattę i współpracowników, którzy wstrzyknęli mRNA lub DNA kodujące Kaede do jednokomórkowych embrionów zebrafish w celu uzyskania ekspresji powszechnej lub wywoł...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materiały:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Wyposażenie niezbędne do hodowli ryb i zbierania jaj (szczegóły znajdują się w Zebrafish Book22).</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>Stereomikroskop Lecia MZ6</td><td>Wyposażony w laser pracujący przy 488 nm</td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop skaningowy</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td>wyposażony w lasery pracujące przy 488 nm, 561 nm i 405 nm</td></tr><tr><td>Blok grzejny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane z dnem z deactivate-glass (szkiełko nakrywką)</td><td>MatTek Corp</td><td></td><td>Ashland MA USA</td></tr><tr><td>Końcówki do mikrodozownika (Microloader)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>igły</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Odczynniki:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Pożywka do jaj (Egg water medium)&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>60 &amp;mu;g/ml soli morskich Instant Ocean w ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Pożywka E3 &lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>5 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.17 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.00001% (w/v) błękitu metylenowego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Stężony roztwór tricainy 4 mg/ml &lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>400 mg tricainy (estru etylowego kwasu 3-aminobenzoenowego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>97.9 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1 ml 1M Tris (pH 9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dostosować pH do 7, podzielić na aletikoty i przechowywać w -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;1% LMA (agaroza o niskiej temperaturze topnienia, Lonza)&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>1 g LMA / 100 ml pożywki E3 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podzielić na aletikoty i przechowywać w 4 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju ryby danio-ostrogonia

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embriogeneza jest dynamicznym procesem, który najlepiej badać za pomocą technik umożliwiających dokumentowanie zmian rozwojowych in vivo. Wykorzystanie genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych okazało się cenną strategią wyjaśniania dynamicznych procesów morfogenetycznych zachodzących w nienaruszonym organizmie. W ciągu ostatniej dekady rozwój białek fluorescencyjnych fotoaktywowalnych i fotokonwertowalnych otworzył możliwość badania losów poszczególnych subpopulacji znakowanych białek1. W przeciwieństwie do białek fotoaktywowalnych, białka fluorescencyjne fotokonwertowalne (PCFPs) można łatwo śledzić i obrazować w ich natywnym stanie emisji przed fotokonwersją, co ułatwia identyfikację i wybór obszarów poprzez inspekcję optyczną. PCFPs, takie jak Kaede2, KikGR3, Dendra4 i EosFP5, mogą zmieniać kolor z zielonego na czerwony po ekspozycji na światło UV lub niebieskie dzięki sekwencji tripeptydu His-Tyr-Gly, która tworzy zielony chromofor mogący zostać poddany fotokonwersji do czerwonego poprzez katalizowaną światłem β-eliminację i późniejsze rozszerzenie układu π-sprzężonego3. PCFPs oraz ich warianty monomeryczne są użytecznymi narzędziami odpowiednio do śledzenia komórek6-10 oraz badania dynamiki białek11-14. W ostatnich latach PCFPs były ekspresowane w różnych modelach zwierzęcych, takich jak ryba danio6, kurczak7,8 i mysz9,10, w celu śledzenia losów komórek. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół specyficznej dla komórek fotokonwersji PCFPs w żywym zarodku ryby danio oraz dalszego śledzenia fotokonwertowanych białek w późniejszych etapach rozwoju. Metodologia ta pozwala na badanie, w sposób specyficzny dla danej tkanki, zdarzeń biologii komórki leżących u podstaw morfogenezy w modelu zwierzęcym ryby danio.

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę fotoaktywnego przełączania fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych (PCFPs) w żywym embrionie danio-pręgowanego oraz dalsze śledzenie fotokonwertowanego białka w określonych punktach czasowych podczas rozwoju. Metodologia ta umożliwia monitorowanie zdarzeń biologii komórkowej leżących u podstaw różnych procesów rozwojowych w żywym organizmie kręgowca.

Embriogeneza jest dynamicznym procesem, który najlepiej badać za pomocą technik umożliwiających dokumentowanie zmian rozwojowych in vivo. Zastosowanie ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest śledzenie komórek poddanych fotoprzekształceniu w żywym embrionie danio prążkowanego. Osiąga się to poprzez najpierw osadzenie embrionu wykazującego ekspresję tkankowo specyficznego, fotokonwertowalnego białka fluorescencyjnego w agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Następnie białko w obszarze zainteresowania zostaje całkowicie poddane fotokonwersji.Następnie zarodek jest ostrożnie usuwany z agarozy i utrzymywany w wodzie do jaj 28,5°C aż do późniejszych etapów rozwoju. Na koniec fotokonwertowany zarodek jest ponownie zatapiany w agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące, że dzięki stabilnej obecności fotokonwertowanego białka, komórki poddane fotokonwersji mogą być precyzyjnie wykrywane w późniejszych etapach za pomocą mikroskopii konfokalnej.Sądzimy, że metoda, którą zaprezentujemy dzisiaj, okaże się bardzo użyteczna w kontekście biologii komórki i biologii rozwoju. Uważamy, że zastosowanie tej metodologii w badaniach nad migracją komórek, dynamiką tkanek oraz innymi zachowaniami komórkowymi będzie niezwykle pomocne. Procedurę zademonstruje Veronica Lombardo, postdoc z mojego laboratorium,

cell-tracking-using-photoconvertible-proteins-during-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Śledzenie komórek za pomocą fotokonwertowalnych białek podczas rozwoju rybki zebrowej

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Ten film demonstruje śledzenie rekrutacji leukocytów za pomocą transgenicznych larw danio pręgowanego wykazujących ekspresję fotokonwertowalnego białka zielonej fluorescencji. Wstępne wstrzyknięcie bakterii znakowanych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym do pęcherzyka usznego i wywołanie fotokonwersji umożliwia obserwację migracji leukocytów, fagocytozy i dyspersji w organizmie, dostarczając cennych informacji na temat dynamiki odpowiedzi immunologicznej.

Śledzenie leukocytów w oparciu o fotokonwersję u transgenicznego danio pręgowanego zakażonego bakteriami

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Stworzyliśmy fotokonwertowalny system PSmOrange jako potężne, proste i tanie narzędzie do śledzenia komórek in vivo w transgenicznym tle GFP. Protokół ten opisuje jego zastosowanie w systemie modeli danio pręgowanego.

Śledzenie komórek u danio pręgowanego transgenicznego GFP za pomocą fotokonwertowalnego systemu PSmOrange

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół, który pokazuje, jak fotokonwersja komórek jest osiągana poprzez ekspozycję na promieniowanie UV na określone obszary wyrażające białko fluorescencyjne, Eos, u żywych zwierząt.

Fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych

Ten protokół opisuje metodę fotokonwersji białka fluorescencyjnego Kaede w komórkach wsierdzia żywego zarodka danio pręgowanego, która umożliwia śledzenie komórek wsierdzia podczas rozwoju kanału przedsionkowo-komorowego i zastawki przedsionkowo-komorowej serca.

Śledzenie ruchów tkanki wsierdzia poprzez fotokonwersję komórek w zarodku danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Poznaj metodę śledzenia komórek z wykorzystaniem białek fotokonwertowalnych w żywych zarodkach Danio rerio. Technika ta umożliwia precyzyjną obserwację zdarzeń komórkowych podczas rozwoju.

Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju ryby danio-ostrogonia

Przeglądaj więcej filmów