Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie komórek przełączanych foto w żywym zarodku zebry danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez uprzednie osadzenie zarodka, wyrażającego specyficzne dla tkanki zdjęcie, konwertowalne białko fluorescencyjne w arosach o niskiej temperaturze topnienia. Następnie białko w obszarze zainteresowania jest całkowicie przekształcane w światło.

Następnie zarodek jest ostrożnie usuwany z aros i utrzymywany w wodzie jajecznej w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza do późniejszych etapów. Na koniec przekształcony na zdjęciu zarodek jest ponownie osadzany w arosach o niskiej temperaturze topnienia. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, że fotoprzekształcone komórki mogą być precyzyjnie wykryte na późniejszych etapach dzięki stabilnej obecności fotoprzekształconego białka za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Uważamy więc, że metoda, którą dzisiaj zaprezentujemy, będzie bardzo przydatna w kontekście biologii komórki i rozwoju. Uważamy więc, że zastosowanie tej metodologii w kontekście migracji komórek, dynamiki tkanek i innych zachowań komórek będzie bardzo przydatne. Procedurę zademonstruje Veronica Lombardo, doktor habilitowany z mojego laboratorium, po skrzyżowaniu transgenicznego danio pręgowanego, w wyniku którego uzyskano ekspresję fotokonwertowalnego białka fluorescencyjnego.

Wybierz najjaśniejsze zarodki, które są homozygotyczne i hoduj je w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, gdy osiągną pożądany etap. Użyj kleszczy, aby usunąć je w szklanym pojemniku z wodą jajeczną, aby znieczulić zarodki. Użyj szklanej pipety lub przeciętej końcówki do pipety, aby przenieść je pojedynczo do trica.

Przenieść znieczulony zarodek na pokrywę naczynia hodowlanego i utrzymać zarodek w najmniejszej możliwej objętości pożywki. Przenieś zarodek do aros, pipetując go za pomocą 1% agros o niskiej temperaturze topnienia z trica w temperaturze 30 stopni Celsjusza i umieść go w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem. Użyj gładkiej plastikowej końcówki, aby zorientować zarodek, gdy agros się spolimeryzuje.

Pokryj go roztworem Trica na odwróconym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w źródła laserowe 405, 488 i 561 nanometrów oraz obiektyw 20x. Użyj laserów 488 i 561 nanometrów, aby wygenerować stos Z całej struktury próbki, który obejmuje obszar zainteresowania. Wybierz narzędzie szeregów czasowych i ustaw dla dwóch cykli bez interwału, jednego dla konwersji przed i jednego dla konwersji zdjęć po .

Wybierz narzędzie regionu i zdefiniuj jeden lub więcej obszarów zainteresowania do konwersji zdjęć. Następnie wybierz narzędzie do wybielania i ustaw na rozpoczęcie wybielania po skanowaniu. Jednym z dwóch użytych tutaj jest 30-miliwatowy laser diodowy o długości 405 nanometrów.

Starannie zoptymalizowany pod kątem minimalnej ilości światła laserowego niezbędnego do pełnej konwersji zdjęć, którą uzyskuje się poprzez zmianę intensywności światła laserowego, iteracji skanowania obszaru zainteresowania i prędkości skanowania. Zeskanuj próbkę za pomocą laserów 488 nanometrów i 561 nanometrów, aby uwidocznić pozostałą zieloną i przekształconą w zdjęcie czerwoną fluorescencję fotokonwertowalnego białka fluorescencyjnego. Po konwersji zdjęcia wyrzuć roztwór i za pomocą igły lub gładkiej plastikowej końcówki ostrożnie usuń zarodek z agros.

Utrzymuj zarodek w wodzie jajowej w ciemności w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza do pożądanego etapu rozwoju. Osadź zarodek po raz drugi, a następnie wygeneruj Zacka próbki, w tym obszar zainteresowania, ponownie za pomocą laserów 488 i 561 nanometrów. Ponieważ protokół ten nie wpływa na prawidłowy rozwój, możliwe jest obserwowanie fotoprzekształconego zarodka w późniejszych stadiach.

Oto przykład testu konwersji zdjęć. Komórki śródbłonka śledzono podczas rozwoju danio pręgowanego od 48 do 72 godzin po zapłodnieniu za pomocą transgenicznej linii reporterowej wyrażającej kopnięcie G w jądrach śródbłonka, jak pokazano tutaj, przed konwersją zdjęć kopnięcie G było wyrażane w tkance śródbłonka i było wykrywalne tylko jako zielona fluorescencja za pomocą skanów kontrolnych laserem argonowym o długości 488 nanometrów z laserem o długości 561 nanometrów dla czerwonej fluorescencji. Nie wykryto żadnego przekonwertowanego zdjęcia kopnięcia GR przed konwersją zdjęcia.

Następnie obszar zainteresowania został całkowicie przekonwertowany na zdjęcia za pomocą lasera diodowego o długości 405 nanometrów o intensywności 10%, 20 iteracji, a naczynia głowy zostały ponownie zeskanowane za pomocą laserów 488 nanometrów i 561 nanometrów. W tym panelu zielony kopniak G całkowicie zmienił kolor na czerwony w obszarze zainteresowania, aby śledzić przekształcone w zdjęcie komórki śródbłonka na późniejszych etapach. Zarodek obserwowano po 24 godzinach od konwersji zdjęcia, czyli około 72 godziny po zapłodnieniu w tkankach śródbłonka powstałych z obszaru zainteresowania przekształconego w zdjęcie.

Zarówno nie, jak i fotokonwertowane białka kopnięcia G obserwowano ze względu na stabilność czerwonego fluorescencyjnego kopnięcia G przekształconego w światło oraz syntezę nowego zielonego, nieprzekształconego kopnięcia G po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwojową do zbadania biologii komórki i przebudowy tkanek u kilku ryb.