Name: Analiza funkcji genów i wizualizacja przepływu płynu generowanego przez rzęski w pęcherzyku Kupffera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj metodę modulacji funkcji genów w pęcherzyku Kupffera u zarodków Danio rerio oraz wizualizację przepływu płynu za pomocą fluorescencyjnych kulek. Technika ta umożliwia badanie asymetrii lewo-prawej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Fionie Foley za doskonałe wsparcie laboratoryjne i opiekę nad danio pręgowanym. Praca ta została wsparta stypendium przeddoktoranckim AHA dla G.W. (11PRE5730027) oraz granty NHLBI dla H.J.Y. (R01HL66292) i J.D.A. (R01HL095690).

Przegląd iniekcji zarodków danio pręgowanego dla poszczególnych etapów
Antysensowne oligonukleotydy morfolino (MO), które wiążą się z docelowym mRNA i zakłócają ekspresję białka z tego transkryptu, są szeroko stosowane w badaniach nad knockdownem genów (utratą funkcji) u ryb danio pręgowanych13,14. Gene Tools, LLC oferuje MO, które są znakowane karboksyfluoresceiną (emituje zieloną fluorescencję) lub lizaminą (emituje czerwoną fluorescencję) w celu wykrycia MO w wstrzykniętych zarodkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Poprzez wstrzyknięcie MO do komórki żółtkowej na różnych etapach rozwoju danio pręgowanego, możliwe jest dostarczenie MO do określonych przedziałów zarodka (ryc. 1A-F). MO wstrzyknięty do żółtka między 1-4 stadiami komórkowymi (0-1 hpf) dostaje się do wszystkich komórek embrionalnych (ryc. 1A, D, D') poprzez połączenia z żółtkiem, które utrzymują się do stadium15 32 komórek, aby ułatwić globalny knockdown. MO wstrzyknięty do żółtka w stadium środkowego blastuli (2,5-3 hpf) może dostać się do komórek progenitorowych DFC (ryc. 1B, E, E') prawdopodobnie przez mostki cytoplazmatyczne8 i funkcję genu knockdown, specyficznie w linii komórkowej DFC / KV12, bez wchodzenia do większości innych linii komórek embrionalnych. Jako ważna kontrola w celu sprawdzenia, czy funkcja genu jest wymagana w DFC / KV, czy także w żółtku12,16, możliwe jest również ograniczenie MO do komórki żółtkowej poprzez wstrzyknięcie między etapy epibolii kopuły 30% (~ 4,5 hpf) po zamknięciu wszystkich mostków cytoplazmatycznych (ryc. 1C, F, F'). Zastrzyki te zostały użyte w połączeniu do analizy funkcji genów w komórkach DFC / KV17-24. Aby ocenić przepływ płynu w KV, mikrogranulki fluorescencyjne są wstrzykiwane do światła KV między 6-10 stopniami somitu (12-14 hpf), a następnie natychmiast obrazowane za pomocą wideomikroskopii (ryc. 1G-J). Dostępne są mikrogranulki, które emitują czerwoną lub zieloną fluorescencję (lub jedno i drugie), dzięki czemu możliwe jest użycie różnych kanałów do obrazowania mikrokulek fluorescencyjnych i MO.
1. Specyficzne dla etapu wstrzykiwanie Morpholinos (MO)
Wykazano wcześniej wstrzykiwanie MO do zarodków danio pręgowanego25,26. W tym miejscu pokrótce opisujemy zastrzyki MO specyficzne dla danego etapu. Po wszystkich wstrzyknięciach zarodki przenosi się na szalkę Petriego i inkubuje w temperaturze 28,5 °C.
<ol>
	<li>Globalna iniekcja MO: Natychmiast po zapłodnieniu należy pobrać zarodki i umieścić je na płytce iniekcyjnej. Załaduj fluorescencyjny MO do igły kapilarnej i zamontuj igłę na mikrowtryskiwaczu (np. Inżektorze Harvard Apparatus PLI-90 Pico). Złamać końcówkę igły i dostosować ustawienia wstrzyknięcia (ciśnienie i/lub czas) w celu uzyskania kropli do wstrzykiwania o objętości 1 nl, zgodnie z opisem25,26. Używając stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, wstrzyknąć 1 nl MO do żółtka (ryc. 1A) ≥50 zarodków na eksperyment. Pracuj szybko, aby zakończyć iniekcje na etapie 4-komórkowym.</li>
	<li>Wstrzyknięcie MO ukierunkowane na DFC: Pobrać zarodki natychmiast po zapłodnieniu i inkubować w temperaturze 28,5 °C. Gdy zarodki osiągną stadium 256 komórek (~ 2,5 hpf), szybko załaduj je do płytki iniekcyjnej, a następnie wstrzyknij 1 nl fluorescencyjnego MO do żółtka ≥100 zarodków między stadiami 256-komórkowymi i 1,000-komórkowymi (ryc. 1B).</li>
	<li>Wstrzyknięcie MO ukierunkowane na żółtko: Zebrać zarodki natychmiast po zapłodnieniu i inkubować w temperaturze 28,5 °C. Na etapie kopuły (~ 4 hpf) załaduj zarodki do płytki iniekcyjnej, a następnie wstrzyknij 1 nl fluorescencyjnego MO w żółtko ≥100 zarodków między kopułą a 30% etapami epibolii (ryc. 1C).</li>
</ol>
2. Wybór wstrzykniętych zarodków do analizy
<ol>
	<li>Gdy zarodki, którym wstrzyknięto MO, osiągną stan 75% epibolii (8 hpf), usuń niezapłodnione i martwe zarodki, a następnie przebadaj żywe zarodki pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym w celu dystrybucji fluorescencyjnego MO. Następnie pozwól wybranym zarodkom rozwinąć się w temperaturze 28,5 °C.
	<ol>
		<li>Do globalnych wstrzyknięć MO wybierz zarodki, które mają fluorescencję równomiernie rozłożoną we wszystkich komórkach embrionalnych (ryc. 1D; Rysunek 2A).</li>
		<li>W przypadku wstrzyknięć MO ukierunkowanych na DFC należy wybrać zarodki, w których fluorescencyjny MO dyfunduje w żółtku i wydaje się skoncentrowany na grzbietowym brzegu blastodermy (DFC) (ryc. 1E; Rysunek 2B). Na tym etapie wizualizacja fluorescencyjnych DFC może być trudna ze względu na jasną fluorescencję w leżącym pod spodem żółtku. Należy zachować ostrożność, aby wykluczyć zarodki, w których fluorescencyjny MO włączył się do komórek embrionalnych innych niż DFC lub pozostaje zagregowany w miejscu wstrzyknięcia (ryc. 2D).</li>
		<li>W przypadku wstrzyknięć MO ukierunkowanych na żółtko należy wybrać zarodki, w których fluorescencja MO jest równomiernie rozłożona w żółtku i nie obserwuje się jej w żadnych komórkach zarodkowych (ryc. 1F; Rysunek 2C). Ponownie należy usunąć zarodki, w których fluorescencyjne MO pozostaje zagregowane w miejscu wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiędzy etapami 2-4-somitowymi (~11 hpf) należy przebadać zarodki po raz drugi pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu większego powiększenia. Następnie pozwól wybranym zarodkom rozwinąć się w temperaturze 28,5 °C.
	<ol>
		<li>W przypadku globalnych wstrzyknięć MO upewnij się, że wybrane zarodki mają fluorescencję MO równomiernie rozłożoną w KV i wszystkich komórkach zarodkowych (ryc. 1D'; Rysunek 2E).</li>
		<li>W przypadku wstrzyknięć MO ukierunkowanych na DFC należy starannie wybrać zarodki, które mają fluorescencję MO tylko w komórkach KV i żółtku (ryc. 1E'). Transgeniczne zarodki, które wyrażają GFP w komórkach KV, takie jak Tg(Dusp6:d2EGFP)27, mogą pomóc w identyfikacji zarodków, w których MO zostało pomyślnie dostarczone do komórek KV (Figura 2F). Wyrzuć zarodki z fluorescencją MO w komórkach embrionalnych innych niż komórki KV.</li>
		<li>W przypadku wstrzyknięć MO ukierunkowanych na żółtko wybierz zarodki, które mają fluorescencję MO wyłącznie w żółtku (Rysunek 1F': Rysunek 2G).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Montowanie zarodków do analizy przepływu płynów w KV
<ol>
	<li>Aby przeanalizować asymetryczny przepływ płynu w KV globalnych zarodków MO, MO ukierunkowanych na DFC lub MO ukierunkowanych na żółtko, ostrożnie zdekorionuj ~20 zarodków między 4-6 stadiami somitowymi (~11-12 hpf) za pomocą ostrych kleszczy.</li>
	<li>Przygotować 50 ml 1% niskotopliwej agarozy i podwielokrotności do 5 ml probówek, które mają być przechowywane w postaci cieczy w suchej kąpieli w temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Przenieś jeden zarodek do szkiełka wgłębieniowego (United Scientific Supplies, Inc.) i usuń jak najwięcej wody. Unieruchomij zarodek, dodając tyle ciepłej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby tylko przykryć zarodek (zbyt dużo agarozy może zakłócać późniejsze obrazowanie). Gdy agaroza zestala się, użyj kleszczy, aby ustawić zarodek tak, aby KV był skierowany do góry (widok grzbietowy) (ryc. 1H). Zamontuj 10 zarodków z jednym zarodkiem na szkiełku. Pracuj szybko, aby upewnić się, że wszystkie wstrzyknięcia w następnym kroku zostaną zakończone do etapu 10 somitów (14 hpf).</li>
</ol>
4. Wstrzykiwanie mikrogranulek fluorescencyjnych do KV
<ol>
	<li>Rozcieńczyć Fluoresbrite Multifuorescent Microspheres o średnicy 0,5 mikrona (Polysciences, Inc.) w stosunku 1:50 w sterylnej wodzie w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Mikrogranulki w rozcieńczeniu 1:50 należy dokładnie wymieszać stukając w probówkę i załadować 3 μl do igły kapilarnej. Używając tego samego mikroiniektora, który jest używany do iniekcji MO (np. Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injector), przełamać końcówkę igły kleszczami i dostosować ustawienia iniekcji, aby wygenerować jak najmniejszą (<0,5 nl) kroplę iniekcji.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wyrównaj igłę ze światłem KV pierwszego zamontowanego zarodka. Wprowadzić igłę do światła i wstrzyknąć niewielką objętość (< 0,5 nl) kulek (Rysunek 1G). Mała końcówka igły i mała objętość wstrzyknięcia mają kluczowe znaczenie, aby uniknąć uszkodzenia KV.</li>
	<li>Wstrzyknąć wszystkie zamontowane zarodki. Po wstrzyknięciu zarodka na agarozę można dodać kroplę sterylnej wody, aby zapobiec jej wysychaniu. W trakcie wstrzykiwań kulki często zasłaniają otwór igły. Wymaga to ponownego złamania końcówki igły i dostosowania objętości iniekcji poprzez modulację ciśnienia lub ustawienia czasu w aparacie do mikroiniekcji. Wymienić igłę, jeśli stanie się na tyle, że spowoduje znaczne uszkodzenie podczas wstrzykiwania.</li>
	<li>Przebadaj wstrzyknięte zarodki pod kątem pomyślnego dostarczenia kulek pod pionowym mikroskopem fluorescencyjnym (np. Zeiss AxioImager M1) przy użyciu obiektywu 20X. Najpierw określ, czy struktura KV jest nienaruszona za pomocą oświetlenia w jasnym polu (rysunek 1J), a następnie użyj fluorescencji do obserwacji koralików. Wybierz zarodki, w których koraliki są obecne i poruszają się w świetle KV. Wyrzuć zarodki z uszkodzeniem KV lub bez pływających koralików w KV. Łatwo jest przeoczyć KV i dostarczyć koraliki do pobliskiej tkanki lub leżącego pod nią żółtka. Jeśli to się nie powiedzie, zainstaluj kolejne 10 zarodków i powtórz procedurę wstrzyknięcia.</li>
</ol>
5. Wizualizacja i analiza przepływu płynów KV
<ol>
	<li>Dla każdego wybranego zarodka z koralikami wewnątrz KV dodaj kroplę sterylnej wody, aby przykryć agarozę, a następnie obserwuj KV pod pionowym mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą 63-krotnego obiektywu do zanurzania w wodzie (ryc. 1I). Alternatywnie można zastosować szkiełko nakrywkowe do użytku z obiektywami do zanurzania w wodzie i/lub mikroskopami odwróconymi.</li>
	<li>Użyj szybkiej kamery zamontowanej na mikroskopie (np. Zeiss AxioCamHSm), aby nagrać 10-sekundowy film. Nagraj zarówno koraliki za pomocą kanału fluorescencyjnego (około 70 klatek/s), jak i lumenów KV za pomocą kanału jasnego pola lub różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC).</li>
	<li>Aby zobrazować wszystkie ruchy koralików w czasie, zaimportuj film z koralikami fluorescencyjnymi do oprogramowania ImageJ (do pobrania bezpłatnie pod adresem <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>) i utwórz maksymalną projekcję wszystkich sygnałów fluorescencyjnych w filmie. Aby wykonać maksymalną projekcję w ImageJ, kliknij "Image→Stacks→ Z project". W oknie "Projekt Z" rzutuj wszystkie plasterki z typem projekcji "Maksymalna intensywność". Obraz ten można nałożyć na obraz DIC KV, w którym koraliki zostały zobrazowane (rysunki 3A-B).</li>
	<li>Ruchy poszczególnych koralików można śledzić za pomocą ImageJ. Wtyczkę ("Śledzenie ręczne") można pobrać pod adresem <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a>. Otwórz film z koralikami fluorescencyjnymi w ImageJ i uruchom funkcję śledzenia ręcznego. W oknie Śledzenie ręczne zaznacz "pokaż parametry" i wprowadź parametry dla "interwałów czasowych" i "kalibracji x/y". Ręcznie wybierz koraliki, które pozostają w płaszczyźnie ogniskowej filmu przez ≥50 klatek, a następnie śledź ≥5 koralików na zarodek. Ścieżka i prędkość każdego koralika jest generowana przez oprogramowanie (rysunki 3 C-D).</li>
</ol>

<ol><li>Sutherland, M. J., Ware, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+left-right+asymmetry%3A+heterotaxy+and+situsinversus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+C+Semin.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus.</a> Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).</li>
<li>Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer%27s+vesicle+is+a+ciliated+organ+of+asymmetry+in+the+zebrafish+embryo+that+initiates+left-right+development+of+the+brain%2C+heart+and+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut.</a> Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).</li>
<li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+KIF3B+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li>
<li>Essner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+function+for+embryonic+nodal+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved function for embryonic nodal cilia.</a> Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).</li>
<li>Kramer-Zucker, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros%2C+brain+and+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).</li>
<li>Schweickert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+leftward+flow+determines+laterality+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus.</a> Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).</li>
<li>Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+to+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The key to left-right asymmetry.</a> Cell. 127 (1), 27-32 (2006).</li>
<li>Cooper, M. S., D'Amico, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+noninvolutingendocytic+cells+at+the+margin+of+the+zebrafish+blastoderm+marks+the+site+of+embryonic+shield+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation.</a> Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).</li>
<li>Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+cell+fates+at+the+dorsal+margin+of+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula.</a> Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).</li>
<li>Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+T-box+genes+play+independent+and+cooperative+roles+to+regulate+morphogenesis+of+ciliated+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).</li>
<li>Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+shaping+of+the+laterality+organ+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish.</a> Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).</li>
<li>Amack, J. D., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+box+transcription+factor+no+tail+in+ciliated+cells+controls+zebrafish+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry.</a> Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Law, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+of+zebrafish+blastomeres.+I.+Cleavage+pattern+and+cytoplasmic+bridges+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells.</a> Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).</li>
<li>Arrington, C. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-embryonic+syndecan+2+regulates+organ+primordia+migration+and+fibrillogenesis+throughout+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo.</a> Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).</li>
<li>Caron, A., Xu, X., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+directly+regulates+Foxj1+expression+and+ciliogenesis+in+zebrafish+Kupffer%27s+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle.</a> Development. 139 (3), 514-524 (2012).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+Rock2b+establishes+anteroposterior+asymmetry+of+the+ciliated+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 138 (1), 45-54 (2011).</li>
<li>Aamar, E., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox17+and+chordin+are+required+for+formation+of+Kupffer%27s+vesicle+and+left-right+asymmetry+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).</li>
<li>Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signalling+during+embryo+development+regulates+cilia+length+in+diverse+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia.</a> Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).</li>
<li>Schneider, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Nkd1+promotes+Dvl+degradation+and+is+required+for+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning.</a> Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).</li>
<li>Matsui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canopy1%2C+a+positive+feedback+regulator+of+FGF+signaling%2C+controls+progenitor+cell+clustering+during+Kupffer%27s+vesicle+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+alpha2+and+Ncx4a+regulate+zebrafish+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning.</a> Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).</li>
<li>Esguerra, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ttrap+is+an+essential+modulator+of+Smad3-dependent+Nodal+signaling+during+zebrafish+gastrulation+and+left-right+axis+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination.</a> Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+fluxes+in+dorsal+forerunner+cells+antagonize+beta-catenin+and+alter+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning.</a> Development. 135 (1), 75-84 (2008).</li>
<li>Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cdc14B+phosphatase+contributes+to+ciliogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (2), 291-302 (2011).</li>
<li>Matsui, T., Bessho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Stosowanie iniekcji specyficznych dla etapu w celu ukierunkowania MO na linię komórkową DFC / KV jest użytecznym podejściem do badania autonomii komórkowej funkcji genów i unikania plejotropowych fenotypów spowodowanych globalnym knockdownem genu. Jednak te zastrzyki mogą być technicznie trudne. Wstrzyknięcie MO między etapami 256 komórek i 1000 komórek może spowodować trzy możliwe wyniki: 1) MO pozostaje zagregowane w miejscu wstrzyknięcia, 2) MO dyfunduje przez żółtko i dostaje się do komórek DFC / KV lub 3) MO dyfundu...

<table><tbody><tr><td>Standardowa kontrola oligo-lizsamina oznaczona </td><td>Gene Tools, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom Rock2b morpholino oligo</td><td>Gene Tools, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite Multifluorescencyjne mikrosfery 0,5 mikrona</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>Numer katalogowy: 24054</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza funkcji genów i wizualizacja przepływu płynu generowanego przez rzęski w pęcherzyku kupffera

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Narządy wewnętrzne, takie jak serce, mózg i jelita, mają asymetrie lewo-prawo (LR), które są krytyczne dla ich normalnych funkcji1. Ruchome rzęski biorą udział w tworzeniu asymetrii LR w zarodkach kręgowców, w tym myszy, żab i danio pręgowanych2-6. Te "rzęski LR" generują asymetryczny przepływ płynu, który jest niezbędny do wyzwolenia konserwatywnej kaskady sygnalizacyjnej asymetrycznych węzłów (nadrodziny TGF-β) w mezodermie lewej płytki bocznej, która, jak się uważa, dostarcza informacji o wzorcu LR dla rozwijających się narządów7. Dlatego, aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw wzorców LR, konieczne jest zidentyfikowanie genów, które regulują organizację komórek rzęskowych LR, ruchliwość i długość rzęsek LR oraz ich zdolność do generowania silnego asymetrycznego przepływu.
W zarodku danio pręgowanego, rzęski LR znajdują się w pęcherzyku Kupffera (KV)2,4,5. KV składa się z pojedynczej warstwy monorzęskowych komórek nabłonka, które otaczają światło wypełnione płynem. Mapowanie losu wykazało, że KV pochodzi z grupy ~ 20-30 komórek znanych jako grzbietowe komórki prekursorskie (DFC), które migrują na grzbietowym brzegu blastodermy podczas etapów epibolii8,9. We wczesnych stadiach somitowych DFC grupują się i różnicują w rzęskowe komórki nabłonkowe, tworząc KV w pąku ogonowym zarodka10,11. Zdolność do identyfikacji i śledzenia DFC - w połączeniu z przezroczystością optyczną i szybkim rozwojem zarodka danio pręgowanego - sprawia, że danio pręgowany KV jest doskonałym systemem modelowym do badania komórek rzęskowych LR.
Co ciekawe, przodkowie linii komórkowej DFC/KV zachowują mostki cytoplazmatyczne między komórką żółtka do 4 godzin po zapłodnieniu (hpf), podczas gdy mostki cytoplazmatyczne między komórką żółtka a innymi komórkami embrionalnymi zamykają się po 2 hpf8. Wykorzystując te mosty cytoplazmatyczne, opracowaliśmy specyficzną dla etapu strategię wstrzykiwania, aby dostarczyć oligonukleotydy morfolino (MO) wyłącznie do DFC i wyłączyć funkcję docelowego genu w tych komórkach12. Technika ta tworzy chimeryczne zarodki, w których funkcja genu jest zaburzona w linii DFC/KV rozwijającej się w kontekście zarodka typu dzikiego. Aby przeanalizować asymetryczny przepływ płynu w KV, wstrzykujemy mikrogranulki fluorescencyjne do światła KV i rejestrujemy ruch kulek za pomocą wideomikroskopii2. Przepływ płynu jest łatwy do wizualizacji i można go określić ilościowo, śledząc przemieszczenie ściegu w czasie.
Tutaj, korzystając z techniki eliminacji genów ukierunkowanej na DFC i wstrzykiwania fluorescencyjnych mikrogranulek do KV w celu wizualizacji przepływu, prezentujemy protokół, który zapewnia skuteczne podejście do scharakteryzowania roli konkretnego genu podczas rozwoju i funkcji KV.

Iniekcje MO specyficzne dla określonego stadium stanowią przydatne podejście do analizy funkcji genów w konkretnych obszarach embrionu. Rycina 1 przedstawia schemat strategii iniekcji stosowanych w celu przetestowania funkcji genów w komórkach DFC/KV oraz sposób wprowadzania fluorescencyjnych kuleczek w celu wizualizacji przepływu płynu w KV. Rozkład fluorescencyjnego MO w embrionach po udanych iniekcjach specyficznych dla danego stadium przedstawiono schematycznie na Ryciniach 1D-F oraz...

Generowany przez rzęski przepływ płynu w pęcherzyku Kupffera (KV) kontroluje formację zarodka danio pręgowanego w lewo-prawo. Tutaj opisujemy technikę modulowania funkcji genów specyficznie w komórkach KV. Ponadto pokazujemy, jak dostarczyć kulki fluorescencyjne do KV, aby zobrazować przepływ płynu.

Analiza funkcji genów i wizualizacja przepływu płynu generowanego przez rzęski w pęcherzyku Kupffera

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Celem tej procedury jest modulacja genów funkcji w pęcherzyku Kavas lub KV w zarodku danio pręgowanego, który jest odpowiedzialny za wzorzec lewo-prawy, oraz analiza asymetrycznego przepływu płynu generowanego przez motil clia poprzez dostarczanie fluorescencyjnych kulek do kv. Osiąga się to poprzez pierwsze wstrzyknięcie fluorescencyjnych oligonukleotydów morficznych, które hamują ekspresję określonego genu zainteresowania w komórce żółtkowej zarodka Dilla w średnim stadium blash, tak że ładują się do grzbietowych komórek prekursorskich, które dają początek kv. Następnie do dalszej analizy wybiera się wstrzyknięte zarodki, które mają fluorescencyjne morfo tylko w komórce żółtkowej i kv.Następnie zarodki są umieszczane w szkiełkach depresyjnych, a kulki fluorescencyjne są wstrzykiwane do wypełnionego płynem światła pęcherzyka kv. Wreszcie, mikroskopia wideo służy do rejestrowania koralików przepływających wewnątrz kv. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które określą, czy specyficzne dla tkanki zubożenie genu kandydującego w KV zmienia asymetryczny przepływ płynu poprzez analizę ilościową ruchów kulek.Demonstracja wirusa w tym semestrze ma kluczowe znaczenie, ponieważ zastrzyki molin

analysis-gene-function-visualization-cilia-generated-fluid-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza funkcji genu i wizualizacja przepływu płynu generowanego przez rzęski w worku Kupffera

Opisana jest łatwa i niezawodna technika wizualizacji i ilościowego określania ruchliwości rzęsek w drogach oddechowych oraz przepływu generowanego przez rzęski za pomocą tchawicy myszy.  Technikę tę można zmodyfikować w celu określenia, w jaki sposób szeroki zakres czynników wpływa na ruchliwość rzęsek, w tym czynniki farmakologiczne, czynniki genetyczne, narażenie środowiskowe i/lub czynniki mechaniczne, takie jak obciążenie śluzem.

Ex vivo Metoda obrazowania w wysokiej rozdzielczości ruchliwości rzęsek w nabłonku dróg oddechowych gryzoni

Gigantyczny orzęsek Stentor coeruleus to klasyczny system do badania regeneracji i gojenia się ran w pojedynczych komórkach. Poprzez obrazowanie komórek Stentora jednocześnie przy małym i dużym powiększeniu, można mierzyć przepływy cytoplazmatyczne przed, w trakcie i po zranieniu.

Wizualizacja przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran jednokomórkowych w stentorze sinawym

Rzęski węchowych neuronów czuciowych zawierają białka kaskady transdukcji sygnału, ale szczegółowa analiza przestrzenna ich rozmieszczenia jest trudna w kriosekcjach. Opisujemy tutaj zoptymalizowane podejście do znakowania całego mocowania i wizualizacji en face białek rzęskowych.

Znakowanie całego mocowania rzęsek w głównym układzie węchowym myszy

W tym badaniu, szczegółowa technika mikroskopii świetlnej została zoptymalizowana do obserwacji i analizy ruchu rzęsek CPEC w czasie rzeczywistym ex vivo wraz z metodą mikroskopii elektronowej do analizy ultrastrukturalnej.

Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

Złożoność tkanek systemów wielokomórkowych utrudnia identyfikację związku przyczynowego między sygnałami zewnątrzkomórkowymi a indywidualnymi zachowaniami komórek. W tym miejscu przedstawiamy metodę badania bezpośredniego związku między wskazówkami zależnymi od kontaktu a osiami podziału przy użyciu blastomerów zarodkowych C. elegans i adhezyjnych kulek polistyrenowych.

Rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi

Wykorzystanie sztucznej inteligencji (Ai) do analizy obrazów jawi się jako potężne, mniej stronnicze i szybkie podejście w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami. Tutaj wyszkoliliśmy Ai, aby rozpoznawała organellę komórkową, pierwotne rzęski i analizowała właściwości, takie jak długość i intensywność barwienia, w rygorystyczny i powtarzalny sposób.

Podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Ta metoda opisuje wykorzystanie endogennego sygnału w transgenicznym modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2 do obrazowania pierwotnych rzęsek in situ, w trzech wymiarach na dużych obszarach zmineralizowanej tkanki, od pobrania tkanki do analizy organizacji rzęsek. Protokół ten może być również stosowany do innych rodzajów tkanek.

Obrazowanie wolumetryczne i analiza rzęsek pierwotnych w tkance mięśniowo-szkieletowej przy użyciu modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2

Poznaj metodę modulacji funkcji genów w pęcherzyku Kupffera u zarodków Danio rerio oraz wizualizację przepływu płynu za pomocą fluorescencyjnych kulek. Technika ta umożliwia badanie asymetrii lewo-prawej.

Analiza funkcji genów i wizualizacja przepływu płynu generowanego przez rzęski w pęcherzyku Kupffera

Przeglądaj więcej filmów