Analiza funkcji genów i wizualizacja przepływu płynu generowanego przez rzęski w pęcherzyku Kupffera

Celem tej procedury jest modulacja genów funkcji w pęcherzyku Kavas lub KV w zarodku danio pręgowanego, który jest odpowiedzialny za wzorzec lewo-prawy, oraz analiza asymetrycznego przepływu płynu generowanego przez motil clia poprzez dostarczanie fluorescencyjnych kulek do kv. Osiąga się to poprzez pierwsze wstrzyknięcie fluorescencyjnych oligonukleotydów morficznych, które hamują ekspresję określonego genu zainteresowania w komórce żółtkowej zarodka Dilla w średnim stadium blash, tak że ładują się do grzbietowych komórek prekursorskich, które dają początek kv. Następnie do dalszej analizy wybiera się wstrzyknięte zarodki, które mają fluorescencyjne morfo tylko w komórce żółtkowej i kv.

Następnie zarodki są umieszczane w szkiełkach depresyjnych, a kulki fluorescencyjne są wstrzykiwane do wypełnionego płynem światła pęcherzyka kv. Wreszcie, mikroskopia wideo służy do rejestrowania koralików przepływających wewnątrz kv. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które określą, czy specyficzne dla tkanki zubożenie genu kandydującego w KV zmienia asymetryczny przepływ płynu poprzez analizę ilościową ruchów kulek.

Demonstracja wirusa w tym semestrze ma kluczowe znaczenie, ponieważ zastrzyki molino specyficzne dla danego etapu i zastrzyki z kulek fluorescencyjnych są trudne do nauczenia, ponieważ oba zależą od propozycji zarodka i czasu rozwoju eksperymentu. Aby wykonać iniekcję global morph lub MO, należy pobrać zarodki natychmiast po zapłodnieniu i umieścić je na płytce iniekcyjnej. Użyj ognia wypolerowanego obok naszej pipety, aby umieścić zarodki w płytce iniekcyjnej w celu unieruchomienia zarodków.

Złamać końcówkę igły do wstrzykiwań i dostosować ustawienia wstrzykiwania, aby uzyskać kroplę do wstrzykiwań o objętości jednego nanolitra. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego wstrzyknij jeden nanolitr MO do jarzma co najmniej 50 zarodków między jednym a czterema stadiami komórkowymi. W przypadku celowanego wstrzyknięcia DFC M mo należy pobrać zarodki natychmiast po zapłodnieniu i inkubować w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.

Kiedy zarodki osiągną stadium 256 komórek, szybko załaduj je do płytki iniekcyjnej i wstrzyknij jeden nanolitr fluorescencyjnego MO do żółtka. Wstrzyknij co najmniej 100 zarodków między 256 a 1000 stadiami komórek, aby wykonać celowane wstrzyknięcie żółtka. Po inkubacji zapłodnionych jaj do stadium kopuły, wstrzyknij jeden nanolitr fluorescencyjnego MO w jarzmo co najmniej 100 zarodków między kopułą i 30% to stadia warstwowe.

Gdy zarodki wstrzyknięte M mo osiągają 75% stadium warstwy. Usuń niezapłodnione i martwe zarodki pod mikroskopem preparacyjnym w celu globalnych zastrzyków MO. Wybierz żywe zarodki do fluorescencji równomiernie rozmieszczonej we wszystkich komórkach.

W przypadku ukierunkowanych na DFC wstrzyknięć M mo wybierz zarodki z fluorescencją rozproszoną w żółtku i skoncentrowaną na grzbietowym brzegu skóry właściwej. Do iniekcji MO ukierunkowanych na żółtko. Wybierz zarodki, w których fluorescencja jest równomiernie rozłożona w żółtku i nie obserwuje się jej w żadnej komórce embrionalnej między dwoma a czterema.

A więc stadia roztoczy. Wybierz zarodki ukierunkowane na DFC, które wykazują fluorescencję tylko w komórkach KV i żółtku, a resztę odrzuć do iniekcji ukierunkowanych na żółtko. Wybierz zarodki z fluorescencją wyłącznie w żółtku, aby przeanalizować asymetryczny przepływ w KV zarodków wstrzykniętych MO, zacznij od użycia ostrych kleszczy, aby ostrożnie pokryć około 20 zarodków między czterema a sześcioma.

Tak samo może być z etapami, które przenoszą jeden zarodek do szkiełka wgłębieniowego i usuwają jak najwięcej wody. Unieruchomić zarodek, dodając wystarczającą ilość ciepłego powietrza o niskiej temperaturze topnienia 1%, aby po prostu go przykryć, gdy aero zestala się. Użyj kleszczy, aby ustawić go tak, aby KV był skierowany do góry, zamontuj 10 zarodków, pracując szybko, aby upewnić się, że wszystkie wstrzyknięcia zostały zakończone przez 10.

A więc etap roztoczy. Po rozcieńczeniu mikrokulek fluorescencyjnych o średnicy 0,5 mikrona do 1 do 50 w sterylnej wodzie. Dokładnie wymieszaj kulki i załaduj trzy mikrolitry do igły kapilarnej za pomocą tego samego mikrowtryskiwacza, który jest używany do wstrzykiwań MO.

Za pomocą kleszczyków złamać końcówkę igły i dostosować ustawienia wstrzyknięcia, aby uzyskać jak najmniejsze wstrzyknięcie. Kropla. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, wyrównaj igłę ze światłem KV pierwszego zamontowanego zarodka. Następnie włóż igłę do światła i wstrzyknij mniej niż 0,5 nanolitra kulek.

Dodaj kroplę sterylnej wody na aros, aby zapobiec wysychaniu zarodka pod pionowym mikroskopem fluorescencyjnym. Za pomocą 20-krotnego obiektywu przesiewowego wstrzyknięte zarodki w celu pomyślnego dostarczenia koralików dla każdego wybranego zarodka z koralikami wewnątrz KV w kropli sterylnej wody, aby pokryć aros. Następnie obserwuj za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu złożonego z obiektywem do zanurzania w wodzie 63x.

Za pomocą szybkiej kamery zamontowanej na mikroskopie nagraj dziesięciosekundowy film. Użyj kanału fluorescencyjnego, aby nagrać koraliki z prędkością około 70 klatek na sekundę i kontrastu w jasnym polu lub różnicowym kontraście interferencyjnym, aby zarejestrować światło KV. Zaimportuj filmy do obrazu J. Utwórz maksymalne projekcje i użyj oprogramowania do śledzenia ruchów poszczególnych koralików.

Rysunek ten przedstawia rozkład fluorescencyjnego MO w żywych zarodkach, którym wstrzyknięto pomyślnie określone stadium. Pokazano tutaj nieudane wstrzyknięcie MO, w którym roztwór pozostaje zagregowany w komórce żółtka. Przepływ płynu w pomyślnie wstrzykniętych zarodkach można zmierzyć jakościowo lub ilościowo w zarodku kontrolnym z kulkami o normalnym przepływie.

Podążaj ścieżkami w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, które można zwizualizować, wykonując maksymalne rzutowanie pozycji koralików fluorescencyjnych w czasie lub śledząc poszczególne koraliki w czasie. Aby zademonstrować utratę skoordynowanego przepływu, zarodkom wstrzyknięto MO w celu rozbicia kinazy rzędowej dwóch B lub skały dwóch B, co zakłóca przepływ, w wyniku czego kulki poruszają się losowo w kv, średnia prędkość pięciu kulek z grupy kontrolnej i skały dwóch zarodków B mo jest pokazana tutaj Po jego rozwoju. To techniczne utorowało drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwojową do zbadania genów i mechanizmów ustalających dostęp do ciała po lewej stronie i prawej u danio pręgowanego.