Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

Ogólnym celem poniższej procedury jest zastosowanie wysokoprzepustowego protokołu przesiewowego ekspresji w celu ilościowego określenia poziomu rozpuszczalnych białek w bakteriach E. coli za pomocą zautomatyzowanego robota do obsługi cieczy. Osiąga się to poprzez pierwsze zaszczepienie.96. Cóż, hodowle wstępne z komórkami przekształconymi plazmidami kodującymi docelowe białka fuzyjne następnego dnia, 24-dołkowe płytki wypełnione pożywką do automatycznej indukcji są zaszczepiane nocnymi kulturami wstępnymi w celu wytworzenia ekspresji.

Kultury po zbiorach i zamrożeniu rozpuszczalnych białek z kultur ekspresyjnych są następnie oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali. Ostatecznie można zmierzyć poziomy rozpuszczalności dla każdej nienaruszonej fuzji docelowej w celu określenia optymalnych warunków ekspresji dla produkcji białek i generowania udanych celów. Ze względu na zalety tej techniki tradycyjnych metod o zwiększonej wydajności, ograniczone promieniowanie z partii na partię oraz prostota obsługi i śledzenia danych Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.

Zautomatyzowane kroki mogą wydawać się zniechęcające i trudne do zrozumienia w samym formacie tekstowym, ponieważ tekst nie oddaje szybkości ani prostoty procedury. Po przemianie bakterii zacznij od użycia chwytaka robota, aby odłożyć pokrywę pierwszej 24-dołkowej płytki agarowej LB. Następnie użyj ośmiokanałowego ramienia do obsługi cieczy, aby wymieszać, a następnie odessać 50 mikrolitrów mieszanki transformacyjnej z 96-dołkowej płytki transformacyjnej.

Dozować mieszaninę transformacyjną w pierwszych czterech kanałach ramienia do obsługi cieczy do pierwszej kolumny płytki agarowej LB, a przemiany w obrębie ostatnich czterech kanałów do drugiej kolumny płytki agarowej LB Po dozowaniu dokładnie umyć wszystkie końcówki, a następnie kontynuować przenoszenie mieszaniny transformacyjnej z płytki 96-dołkowej do wszystkich studzienek w następnych czterech kolumnach płytki agarowej LB do momentu Ta płyta jest skończona. Po zakończeniu przenoszenia na pierwszą płytkę załóż pokrywkę i rozpocznij przenoszenie na następną płytkę. Po pokryciu wszystkich przemian należy wstrząsnąć wszystkimi płytkami przez jedną minutę z prędkością 1200 obr./min, aby uzyskać jednorodny rozkład mieszanki transformacyjnej.

Następnie, po wymieszaniu, użyj ramienia wielokanałowego 96, aby zassać 60 mikrolitrów pozostałej mieszanki transformacyjnej z płytki 96-dołkowej i dozować mieszaninę do płytki głębokiej 96 zawierającej bulion LB. Uszczelnij kultury wstępne Deep Well 96 oddychającą folią samoprzylepną, aby umożliwić napowietrzenie hodowli, a następnie umieść płytkę w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 stopni Celsjusza z maksymalną prędkością przez noc. Gdy kultury wstępne znajdą się w inkubatorze, należy umieścić płytki agarowe LB w kapturze ze zdjętymi pokrywkami na około 10 minut.

Następnie odwróć płytki w inkubatorze płytkowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy użyć ramienia do obsługi cieczy, aby zassać 100 mikrolitrów nocnej kultury wstępnej do płytki z głęboką studzienką 96 w celu zaszczepienia kultur ekspresyjnych w jednym 40. rozcieńczeniu, stosując ten sam schemat co poprzednio, dokładnie myjąc ramię do obsługi cieczy w stacji mycia między każdą kolumną kultur wstępnych. Po zakończeniu inokulacji umieść kultury ekspresji w inkubatorze wstrząsającym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, uszczelnionym oddychającym klejem na cztery godziny.

Następnie zmniejsz temperaturę do 17 stopni Celsjusza na nocną inkubację. Następnego ranka odwirować 24 płytki w studzience głębinowej przez 10 minut przy stężeniu 3000 Gs. Wyrzucić supernatant do pojemnika na odpady zawierającego środek przeciwdrobnoustrojowy, a następnie postukać płytki do góry nogami o bibułę chłonną, aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki w celu sprawdzenia, czy kultury rosną prawidłowo. Sprawdź, czy w głębokiej studni nie ma granulek.

Następnie zassać 125 mikrolitrów buforu do lizy i dwukrotnie dozować bufor do każdej studzienki z 24 płytek głębokiej studzienki z czterema końcówkami do każdej studzienki. Aby osiągnąć ostateczną objętość jednego mililitra buforu do lizy w celu ponownego zawieszenia granulek, potrząsaj płytkami z prędkością 1200 obr./min przez pięć minut. Na robocie przenieś zawiesiny komórek z powrotem do odpowiednich dołków płytki studzienki głębinowej 96 i przechowuj płytki szczelnie zamknięte w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę.

Do tej demonstracji użyjemy protokołu z 50 mikrolitrami kulek niklowych do oczyszczania docelowych białek fuzyjnych. Najpierw rozmrozić płytkę z głębokiej studni 96 w łaźni wodnej przez około 15 minut. Następnie zawiesić lizaty komórkowe w inkubatorze wytrząsającym z maksymalną prędkością na dodatkowe 10 minut, kultury powinny stać się lepkie.

Następnie użyj ręcznej ośmiokanałowej pipety, aby dozować DNA i siarczan magnezu Wymieszaj z każdym dołkiem płytki głębokiej studni 96 do końcowego stężenia odpowiednio 10 mikrogramów na mililitr i 20 milimolów. Potrząsaj szczelnie zamkniętą płytką przez kolejne 15 minut, po czym kultura powinna stać się nielepka. Aby uniknąć zatkania płyty filtracyjnej podczas oczyszczania, bardzo ważne jest dokładne wizualne sprawdzenie, czy żaden z lizatów nie jest już lepki.

W robocie do obsługi cieczy użyj końcówek o szerokim otworze o pojemności 200 mikrolitrów, aby dokładnie wymieszać zawiesinę żywicy przed przeniesieniem 200 mikrolitrów gnojowicy do głębokiej płytki 96 zawierającej lizat. Potrząśnij płytką głębokiej studzienki 96 przy 1400 obr./min i temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić związanie, a następnie użyj końcówek o szerokim otworze do wymieszania, a następnie przenieś pełne 1200 mikrolitrów zawiesiny lizatu żywicy w podwielokrotnościach 200 mikrolitrów na płytę filtracyjną. Teraz włącz próżnię na około 30 sekund, aby przefiltrować lizat przez płytkę, zbierając przepływ w głębokiej studni.

96 poniżej studni głębinowej 96 zawierającej przepływ jest usuwany spod płyty filtracyjnej i przechowywany na stojaku do końca eksperymentu. Następnie przemyj żywicę dwukrotnie 800 mikrolitrami buforu wiążącego za każdym razem po drugim praniu, użyj chwytaka robota, aby umieścić świeżą, głęboką, dobrze 96 płytkę pod płytą filtracyjną, aby zebrać 50-milimolowy płyn do płukania I midaz. Dodać 150 mikrolitrów buforu płuczącego na płytę filtracyjną i ponownie zastosować próżnię, aż bufor przejdzie przez głęboką studzienkę 96 zawierającą.

Popłuczynę wyjmuje się spod płyty filtracyjnej i przechowuje na stojaku do końca eksperymentu. Następnie, po dwukrotnym umyciu 800 mikrolitrami buforu do płukania, jak pokazano dla bufora wiążącego, myjki używały chwytaka robota do przenoszenia mikropłytki na stół roboczy i umieszczały blok SPE i płytkę filtracyjną z powrotem na mikropłytce, aby zebrać elucjan. Następnie dodaj 190 mikrolitrów buforu Elucian do żywicy w płytce filtracyjnej.

Po trzech minutach zastosuj podciśnienie na minutę, aby umożliwić przejście całego buforu. Szybko, wizualnie sprawdź, czy woluminy Ellucian są poprawne. Na koniec należy zablokować próbki Ellucian wash i przepuścić przez płytki w celu ilościowego określenia poziomu rozpuszczalnej ekspresji.

Najpierw przeanalizuj płytkę ellucjańską i tylko wtedy, gdy to konieczne, sprawdź odpowiednie płukanie i przepływ przez frakcje. Dane te ilustrują wynik elektroforezy z systemu chipów laboratoryjnych suwmiarki. Nienaruszone rozszczepione białka fuzyjne są reprezentowane przez górne pasma, przy czym rozszczepione fragmenty białka są reprezentowane jako dolne pasma.

Wydajność fuzji dla każdego białka docelowego określono tak, aby mieściła się w zakresach od 0,1 do dwóch, od dwóch do 10 i od 10 do 25 mikrogramów na litr hodowli, a w niektórych przypadkach nie została wykryta. Ocena powodzenia ekspresji białka na podstawie liczby wiązań siarczkowych diss obecnych w każdym fragmencie białka fuzyjnego wykazuje rozsądny sukces dla wszystkich badanych wiązań dwusiarczkowych, przy czym najniższy poziom sukcesu wynosi 66% dla celów zawierających sześć wiązań dwusiarczkowych. Analiza rozkładu powodzenia ekspresji w oparciu o punkt izoelektryczny i liczbę reszt nie wskazuje na szczególne odchylenie dla techniki, w przypadku których zarówno pomyślnie wyrażone cele, jak i cele, które nie zostały wykryte, są rozproszone na całym wykresie.

Po wykryciu i rozszczepieniu fuzji, oczyszczone cele poddawane są kontroli jakości poprzez jonizację elektronrozpylającą, spektrometrię mas. Tutaj pokazano reprezentatywny cel, to białko jadu bogate w dwusiarczek o mocy 5,7 kilodaltonu z czterema wiązaniami dwusiarczkowymi. To widmo pokazuje wyniki dla białka przed redukcją za pomocą DTT, tak jak to było po rozszczepieniu i odsoleniu bez dalszej interwencji.

To widmo pokazuje białko po redukcji za pomocą DTT, a następnie odsalaniu w celu usunięcia nadmiaru DTT. Strzałki wskazują jony odpowiadające masom doświadczalnym, a oznaczenie każdego jonu jest oznaczone kolorem zielonym. Eksperymentalne masy macierzyste obliczone dla tych jonów są pokazane w tabeli i odpowiadają różnicy mas wynoszącej osiem daltonów, co odpowiada czterem utlenionym wiązaniom siarczkowym matrycy.

Po skonfigurowaniu pełny protokół można wykonać na ponad tysiącu kultur w ciągu tygodnia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać kultur E. coli na małą skalę do identyfikacji pomyślnych warunków niezbędnych do produkcji rozpuszczalnych białek przy użyciu metod wysokoprzepustowych.