Name: Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Poznaj protokół wysokoprzepustowego ekspresyjnego przesiewania i oczyszczania rozpuszczalnych białek z E. coli przy użyciu zautomatyzowanego robota do obsługi cieczy. Ta metoda optymalizuje warunki produkcji białek bogatych w mostki dwusiarczkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez projekt VENOMICS, europejski grant nr 278346 w ramach Siódmego Programu Ramowego (FP7 ZDROWIE 2011-2015). Projekt VENOMICS jest wynikiem współpracy między kilkoma instytucjami badawczymi i firmami z Europy:
AFMB, Aix-Marseille Université (Francja), CEA Saclay (Francja), NZYTech (Portugalia), SistemasGenomicos (Hiszpania), University de Liège (Belgia), VenomeTech (Francja), Vitamib (Francja), Zealand Pharma (Dania)
Ta praca była wspierana przez Francuską Infrastrukturę dla Zintegrowanej Biologii Strukturalnej (FRISBI) ANR-10-INSB-05-01.
Autorzy chcieliby również podziękować Panu Jeremy'emu Turchetto za pomoc w przygotowaniach do kręcenia filmu.

<ol><li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+and+solubility+screening+in+Escherichia+coli%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).</li>
<li>Correa, A., Oppezzo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+different+expression+parameters+to+achieve+soluble+recombinant+proteins+in+E.+coli%3A+advantages+of+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening.</a> Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5, 135-146 (2008).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+systematic+N-+and+C-terminal+deletions+to+promote+production+and+structural+studies+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins.</a> Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).</li>
<li>Bird, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+construction+and+small+scale+expression+screening+of+multi-tag+vectors+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 29-37 (2011).</li>
<li>Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fusion+protein+systems+designed+to+give+soluble+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).</li>
<li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+maltose-binding+protein+is+uncommonly+effective+at+promoting+the+solubility+of+polypeptides+to+which+it+is+fused%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).</li>
<li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).</li>
<li>Marblestone, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SUMO+fusion+technology+with+traditional+gene+fusion+systems%3A+enhanced+expression+and+solubility+with+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).</li>
<li>Nozach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+identifies+disulfide+isomerase+DsbC+as+a+very+efficient+partner+for+recombinant+expression+of+small+disulfide-rich+proteins+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli.</a> Microb Cell Fact. 12, 37(2013).</li>
<li>Sachdev, D., Chirgwin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusions+to+maltose-binding+protein%3A+control+of+folding+and+solubility+in+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).</li>
<li>Smith, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+fusions+to+glutathione+S-transferase+for+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies.</a> Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32(2007).</li>
<li>Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+reducing+pathways+is+not+essential+for+efficient+disulfide+bond+formation+in+the+cytoplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli.</a> Microb Cell Fact. 9, 67(2010).</li>
<li>de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+contributions+in+the+field+of+the+recombinant+expression+of+disulfide+bonded+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria.</a> Microb Cell Fact. 11, 129(2012).</li>
<li>Katzen, F., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+formation+in+periplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).</li>
<li>Klint, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+disulfide-rich+venom+peptides+for+structural+and+functional+analysis+via+expression+in+the+periplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli.</a> PloS One. 8, e63865(2013).</li>
<li>Braud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+expression+system+suitable+for+high-throughput+fluorescence-based+screening+and+production+of+soluble+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins.</a> Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).</li>
<li>Douzi, B. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+expressing+recombinant+animal+toxins+in+E.+coli.+%28Collection+Rencontres+en+Toxicologie%2C+Publications+de+la+SFET%2C+Chatenay-Malabry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+and+new+technologies+in+toxinology%22%5BJournal%5D)">A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry).</a> Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).</li>
<li>Groisillier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARINE-EXPRESS%3A+taking+advantage+of+high+throughput+cloning+and+expression+strategies+for+the+post-genomic+analysis+of+marine+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact.%22%5BJournal%5D)">MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms.</a> Microb Cell Fact.. 9, 45(2010).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 65-72 Forthcoming.</li>
<li>Xiao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-throughput+protein+sample+production+platform+of+the+Northeast+Structural+Genomics+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium.</a> Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).</li>
<li>Saez, N. J., Vincentelli, R. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaez%2C+NJ+%22Structural+Genomics%3A+General+Applications+%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22">Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology</a>. Chen, Y. W. 1091, Humana Press. 33-53 (2014).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+%28R%29+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).</li>
<li>Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+expression+and+solubility+screening+of+His-tagged+proteins+in+96-well+format%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format.</a> Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Spencer, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+pharmacology+under+flow%3A+automation+via+well-plate+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).</li>
<li>Sala, E., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+optimized+protein+purification+protocols+by+coupling+small-scale+expression+and+mini-size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography.</a> Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).</li>
<li>Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synergistic+approach+to+protein+crystallization%3A+combination+of+a+fixed-arm+carrier+with+surface+entropy+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).</li>
<li>Zanier, K., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZanier%2C+K+%22Structural+basis+for+hijacking+of+cellular+LxxLL+motifs+by+papillomavirus+E6+oncoproteins%22">Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins</a>. 339, Science. New York, N.Y. 694-698 (2013).</li>
<li>Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P1%27+specificity+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The P1' specificity of tobacco etch virus protease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).</li>
<li>Vincentelli, R., Romier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli%3A+becoming+faster+and+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>van den Ent, F., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RF+cloning%3A+a+restriction-free+method+for+inserting+target+genes+into+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+automated+refolding+screening+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Nie ma jednego uniwersalnego protokołu ekspresji rozpuszczalnych, pofałdowanych, funkcjonalnych białek. Aby być efektywnym kosztowo i czasowo, większość laboratoriów lub ośrodków zajmujących się rdzeniami białkowymi pracującymi z wieloma celami korzysta z wysokoprzepustowych badań przesiewowych ekspresji białek w celu znalezienia najlepszej "ogólnej" kombinacji zmiennych w celu uzyskania rozpuszczalnego białka aktywnego dla większości celów. Zidentyfikowaliśmy DsbC jako ogólnie stosowanego partnera fuzyjnego do rozpuszczalnej ekspresji peptydów i białek bogatych w dwusiarczki11. Korzystając z fuzji DsbC i metod wysokoprzepustowych, w ciągu tygodnia można zaobserwować rozpuszczalną ekspresję wielu celów11 , a następnie dodatkowe zmienne, takie jak te omówione we wprowadzeniu, mogą być badane w kolejnych rundach na tych celach, które wymagają dalszej optymalizacji. Opisane w niniejszym dokumencie protokoły mają na celu ekspresję białek i peptydów bogatych w dwusiarczki. Jednak dla użytkowników, którzy chcą eksprymować białka niesiatkowane w sposób wysokoprzepustowy, odpowiednie protokoły zostały opublikowane wcześniej i można je znaleźć gdzie indziej22,24.
Konfiguracja o wysokiej przepustowości jest idealna do wielu zastosowań, w tym do badań przesiewowych dużej liczby różnych białek pod kątem rozpuszczalnej ekspresji lub do badań przesiewowych dużej liczby konstruktów ekspresyjnych (w tym różnych znaczników fuzyjnych) dla kilku genów docelowych w tym samym czasie (lub wielu konstruktów ekspresji dla jednego celu) w celu poprawy wskaźników sukcesu. Platforma może być również wykorzystywana do analizy porównawczej i walidacji nowych protokołów dla dużej liczby celów. Inne zastosowania obejmują badania przesiewowe wariantów dla jednego trudnego celu, np. wszystkich ortologów lub członków tej samej rodziny, lub do testowania sukcesu produkcji panelu mutantów jednego celu w jednym eksperymencie. Protokół ten został również wykorzystany w połączeniu z wektorami koekspresji (tylko z jednym znakowanym białkiem), aby umożliwić ściągnięcie i wstępną charakterystykę kompleksów białko-białko, a następnie dokładniejszą analizę biofizyczną w celu potwierdzenia prawidłowego tworzenia kompleksów i stechiometrii33. Ilość oczyszczonego białka jest czasami odpowiednia do mikrotestów (testy funkcjonalne, testy interakcji białko-DNA34 lub białko-białko). Strategia wysokoprzepustowych badań przesiewowych ekspresji ma kilka zalet: (i) możliwość testowania dużej liczby celów lub dużej liczby zmiennych w jednym eksperymencie, (ii) ograniczona zmienność między partiami, (iii) prostota i łatwość pracy na mniejszą skalę przy użyciu studni głębinowych, (iv) skalowalność i odtwarzalność na większą skalę, (v) potencjał automatyzacji, oraz (vi) prostota śledzenia i obsługi (brak etykietowania pojedynczych probówek, mniej błędów popełnianych przy stosowaniu formatu płytek niż przy obchodzeniu się z pojedynczymi probówkami podczas mieszania lub wymiany klonów).
Chociaż nie zostało to omówione w sekcji dotyczącej protokołu, istnieje kilka ważnych kwestii związanych z przygotowaniem eksperymentu, które zostaną pokrótce omówione poniżej. Bardziej szczegółowe omówienie tej kwestii można znaleźć w naszej poprzedniej publikacji24. Aby uzyskać maksymalną wydajność, korzystne jest posiadanie odpowiedniego systemu do klonowania o wysokiej przepustowości, aby uprościć podklonowanie dużej liczby celów. W początkowej fazie projektu VENOMICS wykorzystujemy wszechstronny system rekombinacji Gateway25 , który umożliwia subklonowanie w dowolnym wektorze docelowym w tempie setek klonów tygodniowo. Protokoły klonowania rekombinacji bramki można znaleźć na stronie internetowej Invitrogen. Inne alternatywy dla klonowania wysokoprzepustowego obejmują klonowanie niezależne od ligacji (LIC)35,36 i klonowanie bez ograniczeń (RF)37. Istnieje wiele sposobów pozyskiwania genów docelowych do ekspresji, w tym metodą PCR z matrycowego DNA, z wejściowych kolekcji klonów lub w postaci genów syntetycznych, co jest strategią wybraną w ramach projektu VENOMICS. Geny syntetyczne można uporządkować z miejscami rekombinacji na każdym końcu genu, a synteza genów umożliwia łatwą optymalizację kodonów docelowej sekwencji genów (w celu wykluczenia rzadkich kodonów E. coli ). Jest to zalecane, ale nie jest konieczne. W przypadku celów bez optymalizacji kodonów, które zawierają dużą liczbę rzadkich kodonów, Rosetta 2 (DE3) pLysS (który przenosi tRNA dla rzadkich kodonów, które nie są wysoko eksprymowane w E. coli) może być lepiej dopasowany niż BL21 (DE3) pLysS. Chociaż dostępne są szczepy, które ograniczają redukcję wiązań dwusiarczkowych w normalnie redukującym środowisku cytoplazmy, w naszych rękach nie odniosły one takiego sukcesu, jak zwykłe szczepy E. coli 11.
Oczyszczanie powinowactwa w skali analitycznej z kultur ekspresji testowej przeprowadza się w celu odzyskania rozpuszczalnych białek fuzyjnych i ilościowego określenia wydajności. Można uzyskać dane ilościowe dotyczące wydajności rozpuszczalnych białek fuzyjnych wyrażonych w zakresie 0,1 – 100 mg/L hodowli. Jeśli wzorzec nie jest rozpuszczalny, można przetestować alternatywne temperatury, szczepy lub pożywki przed poszukiwaniem różnych partnerów do fuzji. W przypadku rozpuszczalnej ekspresji białek bogatych w dwusiarczki wcześniej uszeregowaliśmy wpływ partnerów fuzyjnych jako DsbC > DsbA > GST > MBP > TRX > znacznikiem HIS dla ekspresji cytoplazmatycznej11. Ekspresja peryplazmatyczna to kolejna możliwość, która może pomóc w pomyślnym fałdowaniu celów bogatych w dwusiarczek. Peryplazma jest mniej redukującym środowiskiem niż cytoplazma i zawiera przydatne białka opiekuńcze redoks, które wspomagają wiązanie dwusiarczków. Białka DsbC, DsbA i MBP są zwykle zlokalizowane w peryplazmie przez ich peryplazmatyczne sekwencje sygnałowe. Daje to możliwość wykorzystania tych znaczników do skierowania celów bogatych w dwusiarczki do przestrzeni peryplazmatycznej, aby wspomóc fałdowanie. W przypadku celów trudnych do opanowania, następnym krokiem byłoby oczyszczenie nierozpuszczalnego celu oznaczonego przez HIS z ciał inkluzyjnych, rozpuszczenie i ponowne złożenie (wykracza to poza zakres tego protokołu i nie będzie tutaj omawiane39). Może to być dość proste w przypadku celów z tylko jednym lub dwoma wiązaniami dwusiarczkowymi, ale staje się coraz trudniejsze wraz ze wzrostem liczby wiązań dwusiarczkowych. Alternatywnie, szczególnie w przypadku białek i peptydów z czterema lub więcej wiązaniami dwusiarczkowymi, korzystne może być wypróbowanie bardziej złożonych systemów produkcji, takich jak ekspresja drożdży, owadów lub ssaków.
Dzięki postępom w miniaturyzacji i automatyzacji, technologie HTP Electrophysiology lab-on-a-chip28 bez wątpienia staną się przyszłością dla analiz funkcjonalnych. Przewidujemy, że w większości celów (być może z wyjątkiem badań strukturalnych) zaneguje to potrzebę kultur na dużą skalę. Hodowle na małą skalę będą nie tylko przydatne do badań przesiewowych warunków ekspresji, ale także będą w stanie zapewnić wystarczającą ilość próbki do tych zminiaturyzowanych testów funkcjonalnych. Zdolność do równoległego wytwarzania wielu celów w ilościach wystarczających do charakterystyki funkcjonalnej obniży koszty hodowli, a przy użyciu tego rodzaju platform, ekspresja i charakterystyka rekombinowanych białek stanie się bardziej opłacalna i czasodajna.
Protokoły zawarte w niniejszym dokumencie zostały zastosowane do ekspresji peptydów i białek bogatych w dwusiarczki w początkowej fazie europejskiego projektu VENOMICS realizowanego w ramach 7PR. Jady są doskonałym źródłem bioaktywnych peptydów, które często mają ciekawy potencjał farmakologiczny. Jednak ich produkcja jest trudna ze względu na złożone wzorce wiązań dwusiarczkowych i niewielkie rozmiary. Korzystając z wysokoprzepustowych platform, takich jak opisana w niniejszym dokumencie, projekt VENOMICS ma na celu stworzenie biblioteki 10 000 nowych peptydów jadowych, aby odtworzyć różnorodność obserwowaną w przyrodzie. Biblioteka ta zostanie wykorzystana do scharakteryzowania peptydów bogatych w dwusiarczki o potencjalnych zastosowaniach farmakologicznych lub terapeutycznych w celu opracowania nowych leków. Platforma jest obecnie wykorzystywana do analizy porównawczej i walidacji nowych protokołów do wykorzystania w projekcie VENOMICS.

Motywowany postępem genomiki i przyspieszonym tempem odkrywania nowych białek, opracowano wysokoprzepustowe rurociągi, aby zrównoleglić tradycyjne podejścia do badań przesiewowych i identyfikacji optymalnych strategii produkcji białek. Potencjalne zmienne, które należy zoptymalizować, obejmują między innymi różne szczepyekspresji 1,2, temperaturę3,4, pożywkę2,3, warianty docelowe5, partnerów fuzyjnych6-13, koekspresję z białkami opiekuńczymi14,15, ekspresję cytoplazmatyczną lub peryplazmatyczną16-18 oraz składniki buforu oczyszczającego3. Dzięki wdrożeniu podejść o wysokiej przepustowości można równolegle testować wiele zmiennych lub wiele celów z wysokim poziomem wydajności, przy jednoczesnym ograniczeniu zmienności między partiami. Z naszego doświadczenia wynika, że strategia zapewnia również dobrą odtwarzalność po zwiększeniu skali przy użyciu tych samych kultur (temperatura, pożywka, napowietrzanie itp.) i warunków oczyszczania (ta sama żywica, itp.). W ciągu ostatniej dekady wykorzystano kilka wysokoprzepustowych platform do identyfikacji warunków ekspresji rozpuszczalnych białek, a mianowicie poprzez różne parametry, takie jak partnerzy fuzyjny, szczepy ekspresji lub temperatura19-23.
Ostatnio użyliśmy naszego wysokoprzepustowego podejścia do badania przesiewowego do ekspresji rozpuszczalnych białek bogatych w dwusiarczki11. Wybrane białka pochodziły nie tylko ze źródeł jadowitych, ale zawierały również bogate w dwusiarczki inhibitory enzymów z szerokiej gamy gatunków, w tym roślin, świń, krów i ludzi. W eksperymencie porównano wpływ 12 różnych partnerów fuzyjnych i trzech różnych szczepów ekspresyjnych na rozpuszczalność i fałdowanie 28 białek siatkowanych dwusiarczkiem. Wykazaliśmy, że użycie DsbC jako partnera fuzyjnego do produkcji w szczepie BL21 (DE3) pLysS znacznie przewyższało (zarówno pod względem wydajności, jak i liczby uzyskanych rozpuszczalnych białek) jakąkolwiek inną kombinację szczepu i fuzji11. Wyniki tego eksperymentu stanowiły podstawę do adaptacji naszego pierwotnego ogólnego potoku o wysokiej przepustowości (który został wykorzystany do badania przesiewowego ekspresji szerokiego zakresu białek)22,24 do bardziej odpowiedniego do ekspresji celów bogatych w dwusiarczki. Szczególnie interesujące są białka bogate w dwusiarczki pochodzące z jadów zwierzęcych. Jady są złożoną mieszaniną bioaktywnych peptydów i białek, o potencjalnej wartości farmakologicznej i terapeutycznej. Jednak ekspresja białek zawierających wiązania dwusiarczkowe nie jest trywialna. Białka te na ogół zawierają od jednego do siedmiu wiązań dwusiarczkowych i muszą być utlenione z odpowiednimi wzorcami wiązań dwusiarczkowych, aby były aktywne. Obecnie platforma jest wykorzystywana do badań przesiewowych ekspresji dużej liczby bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego w ramach europejskiego projektu VENOMICS (www.venomics.eu) 7PR oraz do analizy porównawczej nowych protokołów dla wysokowydajnej ekspresji tysięcy celów. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowaną metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego i oczyszczania ekspresji na małą skalę (patrz rysunek 1) stosowanej do bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego. Strategia dla peptydów i białek bogatych w dwusiarczki wykorzystuje znacznik HIS do oczyszczania i aktywnego partnera fuzyjnego redoks, DsbC, tworząc rozszczepialne fuzje HIS-DsbC z białkami docelowymi (patrz rysunek 2).
Chociaż głównym celem tych protokołów jest automatyzacja za pomocą robota do obsługi cieczy i elektroforezy HTP, metody te są również odpowiednie dla wysokoprzepustowego podejścia ręcznego, co oznacza, że nawet laboratoria z podstawową konfiguracją mogą korzystać z protokołów bez żadnych warunków wstępnych dla drogiego sprzętu. Ręczne protokoły transformacji do oczyszczania i analizy (niespecyficzne dla białek bogatych w dwusiarczki) zostały opublikowane w innym miejscu24 i nie będą tutaj powtarzane. Przepustowość procedury ręcznej (od klonu ekspresji, wytworzonego przez klonowanie rekombinacyjne25, do analizy poziomów rozpuszczalnych białek) wynosi 96 (przy użyciu detekcji SDS-PAGE) lub 384 (przy użyciu 4 x 96; przy użyciu dot blot i SDS-PAGE26) kultur tygodniowo (patrz ryc. 1). Wartość tę można zwiększyć, jeśli jest wykonywana w sposób półautomatyczny (przy użyciu robota do obsługi cieczy i elektroforezy punktowej26 lub elektroforezy HTP, np. za pomocą systemu Caliper GXII LabChip22 do analizy wyników) do 1 152 (12 x 96) kultur równolegle przez jeden tydzień, jak opisano w niniejszym dokumencie. Hodowlę przeprowadza się w formacie Deep Well 24 (DW24), dzięki czemu można stosować regularne inkubatory z wytrząsaniem w przeciwieństwie do kultur hodowanych w formacie Deep Well 96 (DW96), które wymagają stosowania krótkich orbitalnych inkubatorów z szybkim wytrząsaniem w celu wystarczającego napowietrzenia (wytrząsanie przy 800 obr./min). Zastosowanie nośników z automatyczną indukcją27 upraszcza również odciąganie pokarmu, eliminując etap indukcji ręcznej. Nawet tam, gdzie laboratoria już stosują predefiniowane warunki odciągania i oczyszczania, można je przenieść bezpośrednio do tego systemu HTP po prostu w celu poprawy wydajności. Szczegółowy schemat wysokoprzepustowego procesu przesiewowego białek bogatych w dwusiarczki przedstawiono na rysunku 3. Parametry w pipeline zostały dobrane na podstawie obszernych eksperymentów przesiewowych 11,22, które pozwoliły nam wybrać najbardziej przydatne warunki do produkcji białka.
Charakterystyka może być przeprowadzona na oznakowanych białkach oczyszczonych bezpośrednio z ekspresji na małą skalę w badaniach pilotażowych, gdzie wystarczają dziesiątki mikrogramów próbki, lub dla czułych testów funkcjonalnych i testów wiązania (na przykład, systemy zacisków krosowych HTP o małej objętości28). To samo można wykonać nawet na nieoznakowanych celach po rozszczepieniu, pod warunkiem, że znacznik i proteaza zostaną usunięte (na przykład za pomocą HPLC z odwróconą fazą). Kontrolę jakości można również przeprowadzić za pomocą spektrometrii mas (w celu potwierdzenia oczekiwanej wielkości i stopnia utlenienia) lub metod chromatograficznych (w celu potwierdzenia czystości lub niejednorodności)29. Czasami rozszczepienie znaczników jest niepotrzebne lub nawet niepożądane (szczególnie w przypadku słabo rozpuszczalnych białek30,31), więc w tym protokole rozszczepienie jest opcjonalne. Niezależnie od tego, we wszystkich konstruktach znajduje się miejsce cięcia proteazy TEV (ENLYFQ/[G]32) bezpośrednio poprzedzające gen docelowy w celu wytworzenia natywnego białka po rozszczepieniu (patrz Ryc. 2 i Dyskusja). Jeśli pożądane jest rozszczepienie znacznika fuzyjnego, rozszczepienie można przetestować (na frakcji elucyjnej lub "na kolumnie") w małej skali w celu analizy wydajności, optymalizacji warunków w razie potrzeby i uzyskania wiarygodnych szacunków wydajności dla kolejnych eksperymentów na dużą skalę.
Są dwie opcje dotyczące ilości koralików używanych podczas oczyszczania powinowactwa, w zależności od celów i oczekiwań eksperymentu. Aby móc wychwycić jak największą ilość białka (w celu oczyszczenia do testów pilotażowych lub MS lub w celu ekstrapolacji w celu zwiększenia wydajności), należy użyć końcowej objętości 200 μl żywicy, umożliwiającej wykrycie rozpuszczalnego białka w zakresie 1-100 mg/l kultury przed nasyceniem systemu (patrz protokół (A) w sekcji 8.1). Jeżeli jednak celem doświadczenia jest wykrycie niewielkich ilości rozpuszczalnych białek, wówczas odpowiednia jest końcowa objętość 50 μl żywicy, pozwalająca na wykrycie rozpuszczalnego białka w zakresie 0,1-25 mg/l kultury (patrz protokół (B) w sekcji 8.2).
Produkcja może być zwiększana, jeśli jest to wymagane, aby uzyskać miligramowe ilości oczyszczonych celów do dalszych badań strukturalnych i funkcjonalnych przy użyciu warunków określonych dla rozpuszczalnego wyrażenia. Szczegóły dotyczące protokołów scale-up stosowanych w AFMB zostały omówione w innym miejscu22,24.
Dalsze szczegóły dotyczące konfiguracji eksperymentalnej, krytycznych kroków w protokole, modyfikacji i rozwiązywania problemów oraz ograniczeń techniki znajdują się w dyskusji. Prosimy o zapoznanie się z dyskusją przed rozpoczęciem eksperymentów.
We wszystkich protokołach oczekujemy wskaźnika sukcesu na poziomie 90% na każdym kroku (na przykład, co najmniej 90% kultur musi rosnąć na danym etapie). Jeśli wskaźnik powodzenia któregokolwiek kroku w eksperymencie spadnie poniżej 90%, próbki są odrzucane, a eksperyment jest powtarzany dla pełnej kolekcji konstruktów. Jednak ten wskaźnik sukcesu nie ma zastosowania do liczby konstruktów, które wyrażają się jako rozpuszczalne białka, ani do proporcji konstruktów, które rozszczepiają się ze 100% wydajnością, ponieważ będzie to w dużym stopniu zależało od badanych białek.
Szczegółowe informacje dotyczące konfiguracji stołu roboczego robota są podane dla każdego protokołu (zobacz również Rysunek 4), jednak mogą być dostosowane do alternatywnych ustawień stołu roboczego. Osprzęt robota (Tecan) składa się z 96-kanałowego ramienia (MCA96), manipulatora robota (RoMa) i 8-kanałowej głowicy do obsługi cieczy (LiHa). Wszystkie czynności przy użyciu MCA96 można również wykonać za pomocą LiHa, jeśli MCA96 nie jest dostępny, jednak zajmie to więcej czasu, ponieważ LiHa będzie musiał być myty między krokami. Chociaż z technicznego punktu widzenia robot nie jest sterylnym środowiskiem, włączenie antybiotyków generalnie zapewnia, że nie ma problemów z zanieczyszczeniem lub sterylnością.

<table><tbody><tr><td>Robot do obsługi cieczy Tecan Freedom EVO 200</td><td>Tecan Group Sp. z o.o.</td><td></td><td>Protokoły można dostosować do dowolnego robota do obsługi cieczy z kolektorem próżniowym do płytek. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do PCR (PCR96)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>652270</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td></tr> <tr><td>LB podłoże</td><td></td><td></td><td>Autoklawowane dla sterylności.</td></tr><tr><td>Zapasy</td><td></td><td></td> antybiotyków <td>Kanamycyna (50 mg/ml), ampicylina (100 mg/ml), chloramfenikol (34 mg/ml w etanolu), zapasy magazynowe o temperaturze &minus; 20 &deg;C. Użyj rozcieńczenia 1:1,000.</td></tr><tr><td>Płytka Deep-well 96 (DW96) o pojemności 2,42 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780270</td><td>Autoklawizowana do sterylności. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td></tr> <tr><td>Wektory</td><td></td><td></td> ekspresji <td>Do ekspresji konstruktów docelowych. Przechowywać w &minus; 20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) kompetentne komórki</td><td></td><td></td> pLysS <td>Lub alternatywny szczep ekspresji E. coli według wyboru użytkownika. Przechowywać w &minus; 80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Oddychająca folia samoprzylepna Breathseal</td><td>Maszyna do PCR Greiner Bio-One</td><td>676050</td><td></td></tr><tr><td>z 96-dołkowym blokiem</td><td></td><td></td> płytek <td>Do transformacji, szoku cieplnego i wrzenia próbek SDS-PAGE/Caliper.</td></tr><tr><td>24-dołkowe sterylne płytki do hodowli tkanek</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662165</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td></tr> <tr><td>LB-agar</td><td></td><td></td><td>Autoklawizowane w celu zapewnienia sterylności.</td></tr><tr><td>200 &mu; l sterylne jednorazowe końcówki</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 617</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem Multitron, o skoku 3 mm</td><td>Infors</td><td>AJ103</td><td>Nie jest to konieczne, można również użyć zwykłego inkubatora z wytrząsaniem. http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td></tr> <tr><td>Inkubator płytkowy Płytka</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>do mikromiareczkowaniaDla zapasów glicerolu i elucji przy użyciu protokołu oczyszczania B.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td></td><td>Do przygotowania zapasów glicerolu.</td></tr><tr><td>200 &mu; l jednorazowe końcówki</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 616</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Podkładki z taśmą klejącą&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td></tr><tr><td>Bactinyl</td><td>Orapi Group</td><td></td><td>Lub równoważny mikrobiologiczny środek dezynfekujący.</td></tr><tr><td>ZYP-5052 medium</td><td></td><td></td><td>Patrz Tabela 1 dla receptur składników.</td></tr><tr><td>Studnia głębinowa 24 (DW24) płytki, pojemność 10 ml</td><td>Whatman</td><td>7701-5102</td><td>Autoklawowany do sterylności. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td></tr><tr><td>Płaskodenna, przezroczysta płytka do mikromiareczkowania</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Do odczytów absorbancji. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td></tr> <tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td> <td>do odczytu płytekFakultatywny. Do pomiaru OD600 kultur.</td></tr><tr><td>Wirówka z wirnikiem do płytek głębinowych&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Nadaje się do 3 800 x g.</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td></td><td></td><td>50 mg/ml w wodzie. Przechowywać w &minus; 20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Imidazol klasy ACS Merck</td><td></td><td>IX0005-1</td><td>Należy stosować wysokiej jakości imidazol wysokiej jakości, aby nie zakłócał odczytów A280 do obliczania wydajności białka.</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> do lizy <td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8 zawierający 0,25 mg/ml lizozymu (lub preferowany bufor). Za każdym razem dodawaj lizozym z zapasów i nie przechowuj przez dłuższy czas.</td></tr><tr>Kąpiel <td></td><td></td><td></td><td>wodna</td></tr><tr><td>Sonikator płytowy (Procesor ultradźwiękowy XL, przystosowany do płyt głębinowych)</td><td>Misonix Inc.</td><td></td><td>Nieistotnie. Sam lizozym jest zwykle wystarczający do prawie całkowitej lizy.</td></tr><tr><td>DNaza&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2 mg/ml bulionu w wodzie, wysterylizowany filtrem. Przechowuj podwielokrotności w &minus; 20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td></td><td></td><td>2 M zapas w wodzie, w autoklawie.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE lub bufor próbki suwmiarki&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> wiążący <td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8 (lub preferowany bufor). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> płuczący <td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8 (lub preferowany bufor). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> elucyjny <td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8 (lub preferowany bufor). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>96-dołkowy odbiornik/płyta filtracyjna 20 &micro; m, pojemność 1,8 ml</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740686.4</td><td>http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td></tr><tr><td>200 &mu; l jednorazowe końcówki o szerokim otworze</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 050 348</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Żywica Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-02</td><td>Do oczyszczania docelowych białek fuzyjnych. Przechowywać w temperaturze 4 stopni C. Przed użyciem umyć i zrównoważyć. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td></tr><tr>Proteaza <td></td><td></td><td>wirusa wytrawiania tytoniu (TEV)</td><td>Opcjonalnie, do rozszczepienia. 2 mg/ml, bez środków redukujących w buforze do przechowywania. Przechowywać w &minus; 80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>96-dołkowy 0,22 &mikro; m płyta filtracyjna</td><td>Millipore</td><td>MSGV N22 10</td><td>Opcjonalnie. Do filtrowania frakcji rozpuszczalnej po rozszczepieniu. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td></tr><tr><td>SDS-PAGE/sprzęt do punktowego blot lub sprzęt</td><td></td><td></td> Caliper Labchip GXII <td>Aparatura do elektroforezy i wybór rodzaju żelu należy do użytkownika s uznania.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr i kuwety</td><td></td><td></td><td>Do pomiaru absorbancji przy 280 nm (A280) w celu obliczenia wydajności rozpuszczalnych białek. Nie jest to wymagane, jeśli analiza jest wykonywana na suwmiarce.</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet ZipTip</td><td>Millipore</td><td></td><td>Opcjonalnie. Typ ZipTip zależy od uznania użytkownika. Żywica C4 powinna być stosowana do większych białek, natomiast do peptydów C18 może być lepsza. Alternatywne metody odsalania próbek mogą być również stosowane do oczyszczania próbek przed dalszą kontrolą jakości. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td></tr><tr><td colspan="4">Materiały są wymienione w kolejności, w jakiej są wymagane, w sekcji Protokół. Odczynniki można przechowywać w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Numery piśmiennictwa dla autora" Zapewniony jest preferowany wybór materiałów, jednak odpowiednie mogą być również równoważne produkty. W przypadku odczynników, w przypadku których marka nie będzie miała wpływu na wynik eksperymentu, dane firmy zostały pominięte.</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w e. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) jest najczęściej używanym systemem ekspresji do produkcji białek rekombinowanych do badań strukturalnych i funkcjonalnych. Jednak oczyszczanie białek jest czasami trudne, ponieważ wiele białek ulega ekspresji w postaci nierozpuszczalnej. Dlatego podczas pracy z trudnymi lub wieloma celami zaleca się stosowanie wysokoprzepustowych (HTP) badań przesiewowych ekspresji białek na małą skalę (1-4 ml kultur), aby szybko zidentyfikować warunki rozpuszczalnej ekspresji. Aby poradzić sobie z różnymi programami genomiki strukturalnej laboratorium, wdrożono ilościowy (w zakresie 0,1-100 mg/l kulturę rekombinowanego białka) i protokół przesiewowy ekspresji białka HTP i zwalidowano go na tysiącach białek. Protokoły zostały zautomatyzowane przy użyciu robota do obsługi cieczy, ale mogą być również wykonywane ręcznie bez specjalistycznego sprzętu.
Bogate w dwusiarczki białka jadu zyskują coraz większe uznanie ze względu na swój potencjał jako terapeutyczne leki prowadzące. Mogą być bardzo silne i selektywne, ale ich złożone sieci wiązań dwusiarczkowych sprawiają, że są trudne do wyprodukowania. Jako członek projektu European Venomics (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu FP7</a>), naszym wyzwaniem jest opracowanie skutecznych strategii produkcji w celu wyprodukowania tysięcy nowych białek jadowych do charakterystyki funkcjonalnej. Wspomagani właściwościami redoks izomerazy o wiązaniach dwusiarczkowych DsbC, dostosowaliśmy nasz rurociąg produkcyjny HTP do ekspresji utlenionych, funkcjonalnych peptydów jadowych w cytoplazmie E. coli. Protokoły mają również zastosowanie do produkcji różnorodnych białek bogatych w dwusiarczki. Tutaj prezentujemy nasz rurociąg stosowany do produkcji białek jadu zwierzęcego. Dzięki opisanym tutaj protokołom jest prawdopodobne, że rozpuszczalne białka bogate w dwusiarczki zostaną uzyskane w ciągu zaledwie tygodnia. Nawet na małą skalę istnieje możliwość wykorzystania oczyszczonych białek do walidacji stopnia utlenienia za pomocą spektrometrii mas, do charakterystyki w badaniach pilotażowych lub do czułych mikrotestów.

Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rycina 6 do przesiewowej analizy ekspresji 96 białek bogatych w mostki dwusiarczkowe z potoku VENOMICS. Białka zostały uporządkowane według rosnącej liczby wiązań dwusiarczkowych, a następnie według rosnącej liczby reszt. Peptydy wyekspresowano w cytoplazmie z zastosowaniem znacznika HIS oraz białka fuzyjnego DsbC. Przy zastosowaniu zalecanych warunków hodowli, wartość OD600 zazwyczaj osiąga się wartość 12. Peptydy oczyszczono zgodnie z protokołem 8.2-B, uzyskując końcową objętość wynoszącą 50 µl żywicą z powinowactwem do niklu, zatem w tym doświadczeniu można było wykryć maksymalnie ok. 25 mg/L białka fuzyjnego.
Rysunek 6A przedstawia wynik elektroforezy z systemu Caliper LabChip (pokazujący fuzję przed cięciem) oraz system punktacji oparty na ekstrapolacji wydajności w mg/L hodowli białka fuzyjnego (w zakresach od 0,1 do 2 mg/L hodowli, 2 do 10 mg/L hodowli, 10 do 25 mg/L hodowli oraz nie wykryto). Należy zauważyć, że odcięty znacznik DsbC zazwyczaj wędruje w okolicach 32 kDa, a nie 27 kDa, jak oczekiwano. Podobnie białka fuzyjne DsbC wędrują o około 5 kDa wyżej niż oczekiwano. W przypadku wielu celów obserwujemy nie tylko nienaruszoną fuzję (górny prążek), ale także sam partner fuzyjny (dolny prążek). W przypadku niektórych z tych celów optymalizacja warunków hodowli może poprawić stosunek nienaruszonej fuzji (górny prążek) w stosunku do samego DsbC, co pozwala na zwiększenie końcowej wydajności. Punktacja opiera się wyłącznie na poziomie nienaruszonej fuzji. Tylko 16 z 96 białek nie udało się wykryć na poziomie fuzji. Odpowiada to ogólnemu poziomowi sukcesu wynoszącemu 83%. Spośród 80 białek, które udało się wykryć, 45 z nich wykryto na poziomach przekraczających 2 mg/L hodowli (56%). W zależności od celu i fuzji, wydajność białek zazwyczaj mieści się w zakresie 2-100 mg/L hodowli (choć w tym przykładzie, stosując protokół 8.2 B, można wykryć maksymalnie ~25 mg/L białka fuzyjnego).
Analiza sukcesu w zależności od liczby obecnych mostków dwusiarczkowych (przedstawiona na Rysunku 6B) wykazuje zadowalający sukces dla wszystkich testowanych liczb mostków dwusiarczkowych (od 1 do 7), przy czym najniższy poziom sukcesu wyniósł 66% dla celów zawierających 6 mostków dwusiarczkowych. Analiza rozkładu sukcesu ekspresji w zależności od punktu izoelektrycznego i liczby reszt (przedstawiona na Rysunku 6C) nie wykazuje żadnej szczególnej stronniczości techniki, gdyż zarówno pomyślnie wyeksponowane cele, jak i cele niewykryte są rozproszone na całym wykresie.
Rycina 6D przedstawia przykład wyników spektrometrii mas uzyskanych za pomocą spektrometrii mas z jonizacją w elektroryaju (ESI-MS) dla pojedynczego celu, przed i po redukcji próbki za pomocą DTT. Zazwyczaj tak wyczerpująca analiza spektrometryczna nie byłaby konieczna (próbka zredukowana nie wymagałaby analizy), jednak w celu dokładnej demonstracji przedstawiliśmy oba wyniki. Przedstawionym celem jest białko jadu o masie 5,7 kDa, bogate w mostki disiarczkowe, posiadające 4 wiązania disiarczkowe. Widmo po lewej stronie pokazuje wyniki dla białka przed redukcją DTT, w stanie po trawieniu i odsoleniu, bez dalszej interwencji. Widmo po prawej stronie przedstawia białko po redukcji DTT, a następnie odsoleniu w celu usunięcia nadmiaru DTT. Jony odpowiadające masom eksperymentalnym są oznaczone strzałkami na widmie, a oznaczenie każdego jonu wyświetla się na zielono. W tabeli przedstawiono obliczone eksperymentalne masy macierzyste dla tych jonów (dla białka przed redukcją (-DTT) i po redukcji (+DTT)). Masy (5709,6 Da dla próbki przed redukcją i 5717,6 Da dla próbki zredukowanej) wykazują różnicę masy wynoszącą 8 Da. Różnica masy 2 Da odpowiada obecności 1 utlenionego wiązania disiarczkowego, zatem różnica masy 8 Da wskazuje na obecność 4 wiązań disiarczkowych (zgodnie z oczekiwaniami) w próbce nieredukowanej.
<img alt="Schemat procesu transformacji genów z płytkami PCR96, wektorami ekspresyjnymi i analizą SDS-PAGE." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczna reprezentacja protokołu wysokoprzepustowego przesiewania ekspresji. Stosując ten protokół, jedna osoba może w ciągu tygodnia przetestować od 96 do 384 warunków metodami manualnymi lub do 1 152 warunków przy użyciu opisanego sprzętu półautomatycznego. Plasmidy ekspresyjne są konstruowane przy użyciu technologii klonowania rekombinacyjnego, co pozwala na jednoczesne subklonowanie wielu celów. Po zidentyfikowaniu warunków ekspresji rozpuszczalnej i ewentualnym przeprowadzeniu cięcia, białko może zostać przekazane do kontroli jakości w celu sprawdzenia utleniania i czystości, do mikroanaliz i/lub produkcji na dużą skalę.
<img alt="Schemat procesu klonowania genów z wykorzystaniem wektorów HIS-DsbC do ekspresji białek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat uniwersalnego klonowania rekombinacyjnego i projektowania konstruktów.Z klonów wejściowych (entry clones) można w ramach jednego eksperymentu podklonować wiele wektorów ekspresyjnych w sposób wysokoprzepustowy (do 6 x 96 klonów wejściowych w ciągu tygodnia). Ekspresowane białko zawiera znacznik HIS do oczyszczania powinowactwem do niklu. Partner fuzyjny DsbC (pozbawiony periplazmatycznej sekwencji sygnałowej w celu ekspresji cytoplazmatycznej) jest stosowany w celu zwiększenia rozpuszczalności i/lub wspomagania fałdowania oraz prawidłowego utleniania białka docelowego. Należy pamiętać, że sekwencja kodująca białko docelowe powinna zawierać N-końcową sekwencję rozpoznawania proteazy TEV (ENLYFQ), jeśli wymagane jest odcięcie znacznika. Wstawka w lewym górnym rogu przedstawia otrzymywanie klonów wejściowych przy użyciu wektora donora i sekwencji docelowych, które mogą być uzyskane metodą PCR lub syntezy genów. Klony wejściowe można również pozyskać z komercyjnych kolekcji klonów wejściowych. Dostępnych jest wiele systemów klonowania rekombinacyjnego, jednak w przedstawionym schemacie wykorzystano system Gateway.
<img alt="Schemat ekspresji białka HIS-DsbC; synteza genów, oczyszczanie na niklu, analiza LC/MS." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Potok wysokoprzepustowego screeningu dla wielu celów bogatych w mostki disiarczkowe. Cele są początkowo ekspresjonowane jako fuzje HIS-DsbC w cytoplazmie E. coli BL21 (DE3) pLysS w temperaturze 37/17 °C z użyciem pożywki do autoindukcji (ZYP-5052). Oczyszczanie przeprowadza się na żywicy niklowej, a następnie wykrywa rozpuszczalne konstrukty za pomocą elektroforezy HTP (lub metodą dot blot/SDS-PAGE). Jeśli pierwsza runda screeningu ekspresji nie przyniesie rezultatów, próbuje się alternatywnych warunków hodowli. Jeśli konstrukty dają rozpuszczalne białka w wystarczająco wysokich wydajnościach, można przeprowadzić mikroanalizy i kontrolę jakości, a w razie potrzeby przejść do produkcji na dużą skalę. W przypadku celów, w których wydajność białek rozpuszczalnych jest zbyt niska, screening ekspresji można kontynuować przy użyciu alternatywnych szczepów i temperatur, a następnie innych partnerów fuzyjnych i ekspresji periplazmatycznej. Kroki opcjonalne są zaznaczone przerywanymi ramkami.
<img alt="Schemat zautomatyzowanego ustawienia laboratorium zawierający sloty MP4 i MP3 do przetwarzania i analizy próbek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Konfiguracja stołu roboczego robota dla platformy HTP. Przedstawiono układ stołu roboczego naszego robota do przenoszenia cieczy, choć można stosować alternatywne stoły robocze, pod warunkiem dostępności równoważnych stanowisk. Konfiguracja składa się ze stacji myjącej (WS) dla (8-kanałowej głowicy do przenoszenia cieczy (LiHa)), dwóch nośników mikropłytek z 4 pozycjami każdy (MP4, pozycje 1-4 i 5-8), stacji próżniowej z 2 pozycjami (Te-VacS, pozycje 9 i 10), nośnika mikropłytek z 3 pozycjami (MP3, pozycje 11-13), dwóch wstrząsarek do płytek z 2 pozycjami każda (Te-Shakers, pozycje 14-15 i 16-17) oraz nośnika na jednorazowe końcówki z 3 pozycjami (DiTi, pozycje 18-20). Dodatkowo znajdują się dwa nośniki typu „hotel” dla płytek głębokich oraz jeden dla mikropłytek (nie pokazano). Sprzętem zainstalowanym na robocie do przenoszenia cieczy jest 96-kanałowe ramię wielokanałowe (MCA96) do użytku z jednorazowymi końcówkami, 8-kanałowa głowica do przenoszenia cieczy (LiHa) ze stałymi końcówkami oraz manipulator robotyczny (RoMa), który przemieszcza płytki/sprzęt na stole roboczym. Numeracja pozycji jest przywoływana w całym protokole.
<img alt="Podział płytki PCR96 na cztery płytki TC24; schemat rozmieszczenia studni dla dystrybucji próbek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Schemat przenoszenia z jednej płytki 96-dołkowej do czterech płytek 24-dołkowych.
<img alt="Analiza ekspresji białek; wirtualny żel, mostki dwusiarczkowe, punkty izoelektryczne; wyniki w formie wykresów słupkowych, punktowych i ESI-MS." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Przedstawiono reprezentatywne wyniki screeningu ekspresji 96 białek jadu bogatych w mostki dwusiarczkowe. Białka wyeksponowano jako fuzje HIS-DsbC w cytoplazmie i oczyszczono przy użyciu 50 µl żywicy niklowej (Protokół 8.2-B). A) Wyniki screeningu ekspresji, przedstawiające wirtualny żel oraz punktację wydajności ekspresji. Kontrast w wirtualnym żelu został dostosowany dla poszczególnych ścieżek, aby skompensować bardzo słabe lub intensywne prążki. Należy zauważyć, że dla niektórych celów widoczne są dwa prążki: górny odpowiada nienaruszonemu białku fuzyjnemu, a dolny samemu znacznikowi fuzyjnemu. B) Proporcja białek wyeksponowanych na każdym poziomie ekspresji w porównaniu do liczby mostków dwusiarczkowych w białku. Rzeczywista liczba białek w każdej grupie jest naniesiona na wykres. C) Rozkład poziomów ekspresji w zależności od punktu izoelektrycznego (pI) i liczby reszt. D) Przykład wyników spektrometrii mas dla białka jadu bogatego w mostki dwusiarczkowe o masie 5,7 kDa z 4 mostkami dwusiarczkowymi. Spektrum po lewej stronie przedstawia białko przed redukcją przy użyciu DTT, a spektrum po prawej stronie białko zredukowane DTT i następnie odsolone. Jony odpowiadające masom eksperymentalnym są zaznaczone strzałkami, a ich przypisania pokazano na zielono. Eksperymentalne masy białka przed i po redukcji przedstawiono w tabeli; wykazują one różnicę masy wynoszącą 8 Da, co odpowiada obecności utlenionego białka przed dodaniem reduktora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Receptura</td>
			<td>Komentarz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZY</td>
			<td>~928 ml 
			10 g tryptonu 
			5 g ekstraktu drożdżowego 
			925 ml wody</td>
			<td>Wymieszać, a następnie wysterylizować w autoklawie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M MgSO₄4</td>
			<td>100 ml 
			49,3 g MgSO44·7H2O 
			ok. 60 ml wody</td>
			<td>Mieszać do czasu rozpuszczenia, a następnie wysterylizować w autoklawie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x 5052</td>
			<td>1 L 
			250 g glicerolu 
			730 ml wody 
			25 g glukozy 
			100 g α-laktozy</td>
			<td>Dodawać kolejno, mieszać podgrzewając do całkowitego rozpuszczenia, a następnie wysterylizować w autoklawie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x NPS</td>
			<td>1 L 
			900 ml wody 
			66 g (NH4)2SO4 
			136 g KH2PO4 
			142 g Na2HPO4</td>
			<td>Dodawać sekwencyjnie i mieszać do całkowitego rozpuszczenia, a następnie wysterylizować w autoklawie.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Skład komponentów pożywki ZYP-5052.

Protokół ilościowego, wysokoprzepustowego badania ekspresji i analitycznego oczyszczania białek fuzyjnych z małych kultur Escherichia coli jest opisany i zastosowany do ekspresji bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego.

Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest zastosowanie wysokoprzepustowego protokołu przesiewowego ekspresji w celu ilościowego określenia poziomu rozpuszczalnych białek w bakteriach E. coli za pomocą zautomatyzowanego robota do obsługi cieczy. Osiąga się to poprzez pierwsze zaszczepienie.96. Cóż, hodowle wstępne z komórkami przekształconymi plazmidami kodującymi docelowe białka fuzyjne następnego dnia, 24-dołkowe płytki wypełnione pożywką do automatycznej indukcji są zaszczepiane nocnymi kulturami wstępnymi w celu wytworzenia ekspresji.Kultury po zbiorach i zamrożeniu rozpuszczalnych białek z kultur ekspresyjnych są następnie oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali. Ostatecznie można zmierzyć poziomy rozpuszczalności dla każdej nienaruszonej fuzji docelowej w celu określenia optymalnych warunków ekspresji dla produkcji białek i generowania udanych celów. Ze względu na zalety tej techniki tradycyjnych metod o zwiększonej wydajności, ograniczone promieniowanie z partii na partię oraz prostota obsługi i śledzenia danych Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.Zautomatyzowane kroki mogą wydawać się zniechęcające i trudne do zrozumienia w samym formacie tekstowym, ponieważ tekst nie oddaje szybkości ani prostoty procedury. Po przemianie bakterii zacznij od użycia chwytaka robota, aby odłożyć pokrywę pierwszej 24-dołkowej płytki agarowej LB. Następnie użyj ośmiokanałowego ramienia do obsługi cieczy, aby wymieszać, a następnie odessać 50 mikrolitrów mieszanki transformacyjnej z 96-dołkowej płytki transformacyjnej.Dozować mieszaninę transformacyjną w pierwszych czterech kanałach ramienia do obsługi cieczy do pierwszej kolumny płytki agarowej LB, a przemiany w obrębie ostatnich czterech kanałów do drugiej kolumny płytki agarowej LB Po dozowaniu dokładnie umyć wszystkie końcówki, a następnie kontynuować przenoszenie mieszaniny transformacyjnej z płytki 96-dołkowej do wszystkich studzienek w następnych czterech kolumnach płytki agarowej LB do momentu Ta płyta jest skończona. Po zakończeniu przenoszenia na pierwszą płytkę załóż pokrywkę i rozpocznij przenoszenie na następną płytkę. Po pokryciu wszystkich przemian należy wstrząsnąć wszystkimi płytkami przez jedną minutę z prędkością 1200 obr./min, aby uzyskać jednorodny rozkład mieszanki transformacyjnej.Następnie, po wymieszaniu, użyj ramienia wielokanałowego 96, aby zassać 60 mikrolitrów pozostałej mieszanki transformacyjnej z płytki 96-dołkowej i dozować mieszaninę do płytki głębokiej 96 zawierającej bulion LB. Uszczelnij kultury wstępne Deep Well 96 oddychającą folią samoprzylepną, aby umożliwić napowietrzenie hodowli, a następnie umieść płytkę w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 stopni Celsjusza z maksymalną prędkością przez noc. Gdy kultury wstępne znajdą się w inkubatorze, należy umieścić płytki agarowe LB w kapturze ze zdjętymi pokrywkami na około 10 minut.Następnie odwróć płytki w inkubatorze płytkowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy użyć ramienia do obsługi cieczy, aby zassać 100 mikrolitrów nocnej kultury wstępnej do płytki z głęboką studzienką 96 w celu zaszczepienia kultur ekspresyjnych w jednym 40. rozcieńczeniu, stosując ten sam schemat co poprzednio, dokładnie myjąc ramię do obsługi cieczy w stacji mycia między każdą kolumną kultur wstępnych. Po zakończeniu inokulacji umieść kultury ekspresji w inkubatorze wstrząsającym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, uszczelnionym oddychającym klejem na cztery godziny.Następnie zmniejsz temperaturę do 17 stopni Celsjusza na nocną inkubację. Następnego ranka odwirować 24 płytki w studzience głębinowej przez 10 minut przy stężeniu 3000 Gs. Wyrzucić supernatant do pojemnika na odpady zawierającego środek przeciwdrobnoustrojowy, a następnie postukać płytki do góry nogami o bibułę chłonną, aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki w celu sprawdzenia, czy kultury rosną prawidłowo. Sprawdź, czy w głębokiej studni nie ma granulek.Następnie zassać 125 mikrolitrów buforu do lizy i dwukrotnie dozować bufor do każdej studzienki z 24 płytek głębokiej studzienki z czterema końcówkami do każdej studzienki. Aby osiągnąć ostateczną objętość jednego mililitra buforu do lizy w celu ponownego zawieszenia granulek, potrząsaj płytkami z prędkością 1200 obr./min przez pięć minut. Na robocie przenieś zawiesiny komórek z powrotem do odpowiednich dołków płytki studzienki głębinowej 96 i przechowuj płytki szczelnie zamknięte w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę.Do tej demonstracji użyjemy protokołu z 50 mikrolitrami kulek niklowych do oczyszczania docelowych białek fuzyjnych. Najpierw rozmrozić płytkę z głębokiej studni 96 w łaźni wodnej przez około 15 minut. Następnie zawiesić lizaty komórkowe w inkubatorze wytrząsającym z maksymalną prędkością na dodatkowe 10 minut, kultury powinny stać się lepkie.Następnie użyj ręcznej ośmiokanałowej pipety, aby dozować DNA i siarczan magnezu Wymieszaj z każdym dołkiem płytki głębokiej studni 96 do końcowego stężenia odpowiednio 10 mikrogramów na mililitr i 20 milimolów. Potrząsaj szczelnie zamkniętą płytką przez kolejne 15 minut, po czym kultura powinna stać się nielepka. Aby uniknąć zatkania płyty filtracyjnej podczas oczyszczania, bardzo ważne jest dokładne wizualne sprawdzenie, czy żaden z lizatów nie jest już lepki.W robocie do obsługi cieczy użyj końcówek o szerokim otworze o pojemności 200 mikrolitrów, aby dokładnie wymieszać zawiesinę żywicy przed przeniesieniem 200 mikrolitrów gnojowicy do głębokiej płytki 96 zawierającej lizat. Potrząśnij płytką głębokiej studzienki 96 przy 1400 obr./min i temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić związanie, a następnie użyj końcówek o szerokim otworze do wymieszania, a następnie przenieś pełne 1200 mikrolitrów zawiesiny lizatu żywicy w podwielokrotnościach 200 mikrolitrów na płytę filtracyjną. Teraz włącz próżnię na około 30 sekund, aby przefiltrować lizat przez płytkę, zbierając przepływ w głębokiej studni.96 poniżej studni głębinowej 96 zawierającej przepływ jest usuwany spod płyty filtracyjnej i przechowywany na stojaku do końca eksperymentu. Następnie przemyj żywicę dwukrotnie 800 mikrolitrami buforu wiążącego za każdym razem po drugim praniu, użyj chwytaka robota, aby umieścić świeżą, głęboką, dobrze 96 płytkę pod płytą filtracyjną, aby zebrać 50-milimolowy płyn do płukania I midaz. Dodać 150 mikrolitrów buforu płuczącego na płytę filtracyjną i ponownie zastosować próżnię, aż bufor przejdzie przez głęboką studzienkę 96 zawierającą.Popłuczynę wyjmuje się spod płyty filtracyjnej i przechowuje na stojaku do końca eksperymentu. Następnie, po dwukrotnym umyciu 800 mikrolitrami buforu do płukania, jak pokazano dla bufora wiążącego, myjki używały chwytaka robota do przenoszenia mikropłytki na stół roboczy i umieszczały blok SPE i płytkę filtracyjną z powrotem na mikropłytce, aby zebrać elucjan. Następnie dodaj 190 mikrolitrów buforu Elucian do żywicy w płytce filtracyjnej.Po trzech minutach zastosuj podciśnienie na minutę, aby umożliwić przejście całego buforu. Szybko, wizualnie sprawdź, czy woluminy Ellucian są poprawne. Na koniec należy zablokować próbki Ellucian wash i przepuścić przez płytki w celu ilościowego określenia poziomu rozpuszczalnej ekspresji.Najpierw przeanalizuj płytkę ellucjańską i tylko wtedy, gdy to konieczne, sprawdź odpowiednie płukanie i przepływ przez frakcje. Dane te ilustrują wynik elektroforezy z systemu chipów laboratoryjnych suwmiarki. Nienaruszone rozszczepione białka fuzyjne są reprezentowane przez górne pasma, przy czym rozszczepione fragmenty białka są reprezentowane jako dolne pasma.Wydajność fuzji dla każdego białka docelowego określono tak, aby mieściła się w zakresach od 0,1 do dwóch, od dwóch do 10 i od 10 do 25 mikrogramów na litr hodowli, a w niektórych przypadkach nie została wykryta. Ocena powodzenia ekspresji białka na podstawie liczby wiązań siarczkowych diss obecnych w każdym fragmencie białka fuzyjnego wykazuje rozsądny sukces dla wszystkich badanych wiązań dwusiarczkowych, przy czym najniższy poziom sukcesu wynosi 66% dla celów zawierających sześć wiązań dwusiarczkowych. Analiza rozkładu powodzenia ekspresji w oparciu o punkt izoelektryczny i liczbę reszt nie wskazuje na szczególne odchylenie dla techniki, w przypadku których zarówno pomyślnie wyrażone cele, jak i cele, które nie zostały wykryte, są rozproszone na całym wykresie.Po wykryciu i rozszczepieniu fuzji, oczyszczone cele poddawane są kontroli jakości poprzez jonizację elektronrozpylającą, spektrometrię mas. Tutaj pokazano reprezentatywny cel, to białko jadu bogate w dwusiarczek o mocy 5,7 kilodaltonu z czterema wiązaniami dwusiarczkowymi. To widmo pokazuje wyniki dla białka przed redukcją za pomocą DTT, tak jak to było po rozszczepieniu i odsoleniu bez dalszej interwencji.To widmo pokazuje białko po redukcji za pomocą DTT, a następnie odsalaniu w celu usunięcia nadmiaru DTT. Strzałki wskazują jony odpowiadające masom doświadczalnym, a oznaczenie każdego jonu jest oznaczone kolorem zielonym. Eksperymentalne masy macierzyste obliczone dla tych jonów są pokazane w tabeli i odpowiadają różnicy mas wynoszącej osiem daltonów, co odpowiada czterem utlenionym wiązaniom siarczkowym matrycy.Po skonfigurowaniu pełny protokół można wykonać na ponad tysiącu kultur w ciągu tygodnia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać kultur E. coli na małą skalę do identyfikacji pomyślnych warunków niezbędnych do produkcji rozpuszczalnych białek przy użyciu metod wysokoprzepustowych.

high-throughput-quantitative-expression-screening-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysoko Przepustowe Ilościowe Badanie Ekspresji i Oczyszczanie Zastosowane do Rekombinowanych Białek Jadowych Bogatych w Mostkach Disulfidowych Produkowanych w E. coli

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Domeny palców cynkowych są z natury przepuszczalne dla komórek i zdolne do pośredniczenia w dostarczaniu białek do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku wdrażania technologii palca cynkowego do wewnątrzkomórkowego dostarczania białka.

Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych

Określenie struktury roztworu białka za pomocą rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wymaga próbek monodyspersyjnych. W tym miejscu przedstawiamy dwie możliwości zapewnienia minimalnych opóźnień między przygotowaniem próbki a akwizycją danych: chromatografia wykluczania wielkości online (SEC) i chromatografia jonowymienna online (IEC).

Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Obecny protokół opisuje szczegółową metodę produkcji przez bakterie białek rekombinowanych, w tym zazwyczaj nierozpuszczalnych lub zawierających wiązania dwusiarczkowe, upakowanych wewnątrz pęcherzyków związanych z błoną zewnątrzkomórkową. Ma to potencjał do zastosowania w różnych obszarach badań naukowych, w tym w biotechnologii stosowanej i medycynie.

Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Protokół ten opisuje produkcję rekombinowanej ludzkiej rybonukleazy SLFN14 oraz jej stechiometryczną analizę za pomocą fotometrii masowej.<br...

Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej

Poznaj protokół wysokoprzepustowego ekspresyjnego przesiewania i oczyszczania rozpuszczalnych białek z E. coli przy użyciu zautomatyzowanego robota do obsługi cieczy. Ta metoda optymalizuje warunki produkcji białek bogatych w mostki dwusiarczkowe.

Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

Przeglądaj więcej filmów