Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie wysoce oczyszczonego białka o pełnej długości. Osiąga się to poprzez wytwarzanie rekombinowanego wirusa bao, który jest używany do infekowania dziewięciu komórek owadów SF w celu uzyskania wysoce eksprymowanej i rozpuszczalnej dwuznakowanej wersji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Następnie przeprowadza się dwuetapowe oczyszczanie powinowactwa, charakteryzujące się oczyszczaniem glutationu, białka znakowanego surowicą, a następnie chromatografią powinowactwa do metali.

Wynikiem oczyszczania jest wysoce czyste białko znakowane histydyną. Następnie oczyszczone próbki białka są dializowane w celu zagwarantowania niskich stężeń soli w buforze magazynowym. Uzyskano wyniki, które pokazują rozpuszczalność, ilość i jakość wyrażenia białka na podstawie barwienia całego białka żelu strony SDS.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy mieliśmy problemy z oczyszczaniem dużych i niestabilnych białek, takich jak PAL B 2 i BOC 2. Tak więc główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa, jest to, że w naszym dwuetapowym protokole oczyszczania powinowactwa uzyskane białko jest wysoce czyste i ogólnie wolne od produktów degradacji. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii białek, takie jak funkcje biochemiczne oczyszczonych białek rekombinowanych.

Protokół ten rozpoczyna się od produkcji rekombinowanego wirusa bao, po którym następuje wybór najskuteczniejszego wirusa BA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym dotyczącym infekcji. Przygotuj naczynie hodowlane zawierające od 0,75 do 1,0 razy 10 do sześciu dziewięciu komórek SF w 500 mililitrach pożywki w stosunku jeden do 150 między wirusem a pożywką. Umieść przędzarkę pod kapturem do hodowli komórkowej, zainfekuj komórki, dodając niezbędną objętość zawiesiny wirusa baula do zawiesiny komórkowej przez jedno ramię przędzarki.

Pozwól zainfekowanym komórkom rosnąć w zawiesinie w temperaturze 27 stopni Celsjusza i zbierz komórki, gdy zostanie osiągnięta maksymalna ekspresja białka, która jest określana przy wyborze najbardziej wydajnego wirusa plamki żółtej. Po zebraniu komórek, lyce SF dziewięć komórek eksprymujących interesujące białko w około 20 mililitrach buforu wiążącego GST, uzupełnionego inhibitorami proteazy w lodowatej kąpieli wodnej. Przepłukać roztwór 20 razy homogenizatorem puchowym, następnie poddać sonikacji przez trzy 32. cykle, a następnie ponownie tańczyć 20 razy, odwirować lizat komórkowy przy 18 000 obr./min przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i utrzymywać supernatant w inkubacji rozpuszczalnego lizatu komórkowego z jednym mililitrem wstępnie umytych kulek GST przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod delikatnym obrotem.

Czas inkubacji powinien być zoptymalizowany w zależności od stabilności pro i skuteczności wiązania po związaniu. Szybkie wirowanie z prędkością 700 obr./min i usunięcie supernatantu zawierającego niezwiązane białka. Przemyć białka związane z GST buforem do przemywania GST.

Powtórz ten proces dwa razy po ostatnim praniu. Usunąć jak najwięcej supernatantu. Następnie inkubować kulki z pięcioma milimolowymi A TP i 15-milimolowymi chlorkami magnezu w 10 mililitrach buforu wiążącego GST przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uniknąć niespecyficznego wiązania białek szoku cieplnego po inkubacji.

Umyj koraliki trzykrotnie buforem myjącym GST. Po odwirowaniu kulek GST i usunięciu supernatantu, przemyć kulki GST buforem P pięć. Następnie podziel kulki GST, naruszenia 100 mikrolitrów i dodaj od czterech do ośmiu jednostek precyzyjnego enzymu rozcieńczonego w 100 mikrolitrach buforu P pięć.

Inkubuj kulki GST z enzymem przez trzy godziny do nocy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy delikatnym obracaniu. Czas inkubacji powinien być zoptymalizowany w zależności od masy cząsteczkowej, a także stabilności białka po rozszczepieniu. Szybko zakręć i zbierz supernatant.

Dodaj 100 mikrolitrów buforu P five do kulek. Następnie powtórz, odwiruj i dwukrotnie zbieraj supernatant. Wyciągnij wszystkie frakcje.

Podziel EIT na trzy frakcje po jednym mililitrze i inkubuj każdą ze 100 mikrolitrami wstępnie umytych suchych kulek żywicy powinowactwa do metali szponowych przez jedną godzinę pod obrotem, dzieląc elucję na kilka frakcji, zwiększając skuteczność wiązania i prania. Następnie myj żywicę przez pięć minut buforem P 30 w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnymi obrotami. Po dwukrotnym powtórzeniu prania pociągnij kulki do jednej tubki, aby wymyć oczyszczone białko.

Dodać bufor P 500 do żywicy szponowej związanej z białkiem. Dodaj stosunek bufora do ściegu objętości jeden do jednego. Głośność. Inkubować zawiesinę przez pięć minut na zmianę.

Powtórz ten krok dwukrotnie. Trzymanie każdej frakcji wymykającej się oddzielnie w celu przechowywania oczyszczonego białka. Dializować białko w odpowiednim buforze do przechowywania dwa razy przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod wpływem mieszania.

Ważne jest, aby sprawdzić, czy podczas dializy nie wytrąciło się oczyszczone białko. Przygotuj małe porcje oczyszczonego białka i zamrażaj na suchym lodzie przez 30 minut. Przechowuj porcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i unikaj wielu cykli zamrażania z rozmrażaniem.

Przeanalizuj proces oczyszczania, ładując około 20 do 40 mikrolitrów każdej frakcji na żel stronicowy SDS. Po uruchomieniu barwienia żelem z błękitem kumasi lub barwnikiem białkowym w celu wizualizacji, rozpuszczalne i całkowite lizaty komórkowe z dziewięciu komórek SF zakażonych rekombinowanym wirusem valo REC 14 lub pozorowanym zakażonym jako kontrola analizowano za pomocą barwienia niebieskiego Kumasi, co pozwoliło potwierdzić ekspresję białka GST re 14 jego białka podczas procesu oczyszczania. Wiele próbek zostało przeanalizowanych w celu śledzenia skuteczności analizy metodologicznej tych próbek przez kumasi Blue.

Barwienie pokazuje, że podczas pierwszego etapu oczyszczania GST Rec 14 został prawidłowo związany z kulkami GST o pozornej masie cząsteczkowej około 50 kilodaltonów w wyniku fuzji rec 14 z GST po precyzyjnym rozszczepieniu z G-S-T-G-S-T, swobodny syk rec 14 migruje około 37 kilodaltonów. Podczas gdy rozszczepiony GST można zwizualizować na koralikach GST, pomimo części REC 14 wolnej od GST, która nadal pozostawała związana z koralikami GST, osiągnięto znaczące wzbogacenie syku REC 14. Ten krok można poprawić, wydłużając czas inkubacji białka za pomocą precyzyjnej analizy proteazy syku REC 14 związanego z kulkami Talon w porównaniu z białkami, o których wspomniano po etapie oczyszczania GST, który pokazuje, że duża część syku REC 14 jest związana z kulkami szponu.

Po kilku praniach syk REC 14 został wymyknięty i zebrany, wykonano trzy iluzje. Analiza wykazała wysoką czystość syczenia rec 14 i największą koncentrację syczenia rec 14 w pierwszym ellucjańskim porównaniu ułamków wymykających się z koralikami szponowymi po Ellucian ilustruje skuteczność iluzji. Od małego rec 14 syk można wykryć jako związany na koralikach.

Próbki te poddano również zachodniej analizie krwi z przeciwciałami anty GST i anty hiss w celu przestrzegania REC 14. W trakcie całej procedury plama anty GST pokazuje, że niektóre GS TRE 14 i sam GST były obecne w białkach, o których mowa na etapie oczyszczania GST, oraz że zanieczyszczenia zostały usunięte na etapie oczyszczania powinowactwa znacznika syczącego. Ta plama pokazuje, że GST został skutecznie usunięty z re 14 przez precyzyjne leczenie i etap oczyszczania hiss ttag.

Przeciw syczącemu blot ma na celu wykrycie re 14. Ta plama potwierdza, że syk GST Rec 14 i syk REC 14 nie zostały całkowicie rozszczepione i usunięte z koralików GST. Co więcej, przy wysokim stężeniu REC 14 wydaje się agregować.

Podsumowując, przedstawione wyniki wskazują na skuteczność oczyszczania z hissu GST w procesie oczyszczania dłoni S palm B rec 14. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odzyskać wysoce upiększoną energię. Białko kombinowane raz opanowane.

Technikę tę można wykonać w ciągu 12 godzin po zwyrodnieniu rozpuszczalnego kwasu, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby pracować szybko i ściśle w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uniknąć degradacji białka Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak testy wytrącania kodów lub spektrometria mas, mogą być wykonywane w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja partnerów białkowych lub potranslacyjna modyfikacja białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Chociaż używamy tej metody do DNA, białka naprawcze do strategii mogą być modyfikowane w celu zbadania funkcji białek w innych obszarach badań.