Name: Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Naucz się dwuetapowej oczyszczania powinowactwa GST-His w celu uzyskania pełnej długości białek rekombinowanych o wysokiej czystości. Ta metoda zapewnia efektywną izolację białek rozpuszczalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Anne-Marie Dion-Cote za dyskusje, które doprowadziły do rozwoju metody. J.K. i R.B. są doktorantami FQNRT, M.-M.G. jest stypendystą Vanier CIHR, a J.-Y.M. jest starszym badaczem FRSQ. Prace te były wspierane przez fundusze Rady Nauk Przyrodniczych i Inżynierii dla J-Y. M.

1. Produkcja rekombinowanego bakulowirusa
Baculowirusy są generowane przy użyciu Systemu Ekspresji Baculowirusa Bac-to-Bac firmy Invitrogen głównie zgodnie z protokołem producenta, z niewielkimi tylko modyfikacjami:
<ol>
	<li>Stworzono zmodyfikowany wektor pFastBac1 (Gibco, life) zawierający znaczniki GST i His (rysunek 2). MultiKlonowanie Ośrodka (MCS) wektora pET-52b(+) (Novagen), zawierającego znacznik 10xHis, zostało wstawione do MCS wektora pFastBac1 w celu wygenerowania pFastBac1-Strep-10xHis. Sekwencja MCS pET-52b (+) została amplifikowana PCR między miejscami restrykcyjnymi XbaI i BlpI, dodając miejsce restrykcyjne BglII na końcu 5' i miejsce restrykcyjne HindIII na końcu 3'. Produkt PCR został następnie sklonowany między miejscem restrykcji BamHI i HindIII pFastBac1, wykorzystując kompatybilność sekwencji restrykcyjnych BamHI i BglII. Ponieważ celem było wygenerowanie pFastBac1 umożliwiającego ekspresję rekombinowanego białka ze znacznikami streptawidyny i 10xHis, nie wykorzystano miejsca restrykcyjnego BamHI sekwencji MCS pET-52b(+). Ponadto miejsce ograniczenia XbaI nie zostało użyte, aby uniknąć redundancji miejsc restrykcyjnych występujących między miejscami już w MCS pFastBac1 a tymi wstawionymi z MCS pET-52b(+). Sekwencja kodująca GST z miejscem rozpoznawania proteazy PreScission (LeuGluValLeuPheGln/GlyPro) została następnie wprowadzona do pFastBac1-Strep-10xHis. Sekwencja cDNA GST z pGEX-6P-2 (GE Healthcare) została amplifikowana PCR starterami zawierającymi miejsca restrykcyjne NcoI i KpnI odpowiednio na końcach 5' i 3'. Miejsce NcoI pozwala na dodanie kodonu startowego, ale także alaniny do GST. Produkt PCR został następnie sklonowany do pFastBac1-Strep-10xHis między miejscami restrykcji NcoI i KpnI, co spowodowało usunięcie znacznika Streptawidyny. Otrzymany w ten sposób nowy wektor fuzyjny został nazwany pFastBac1-GST-10xHis.</li>
	<li>Sklonuj cDNA kodujące interesujące białko do wektora pFastBac-GST-10xHis między GST (N-końcem) a znacznikiem His (C-końcem). Uważaj, aby usunąć kodon stop cDNA, aby umożliwić fuzję z C-końcowym znacznikiem His.</li>
	<li>Przekształć E. coli DH10Bac za pomocą rekombinowanego pFastBac (otrzymanego w kroku 1.2) w celu wytworzenia bakmidu. Pozostawić kolonie do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C i przez kilka godzin w temperaturze 30 °C na płytkach selekcyjnych zawierających Bluo-gal i IPTG (10 μg/ml tetracykliny, 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 100 μg/ml Bluo-Gal, 40 μg/ml IPTG).</li>
	<li>Wybierz i ponownie umieść 2 białe kolonie (z kroku 1.3) na płytkach selekcyjnych, aby potwierdzić biały fenotyp.</li>
	<li>Zaszczepić 2 ml LB zawierającego 10 μg/ml tetracykliny, 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml gentamycyny dwiema białymi koloniami z kroku 1.4 i pozostawić je do wzrostu przez noc pod wpływem mieszania (250 obr./min) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W celu oczyszczenia DNA bakterii należy otoczkować bakterie z kroku 1.5, ponownie zawiesić komórki w 300 μl roztworu I i dodać 300 μl roztworu II (zestaw Maxiprep firmy Qiagen). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, dodać 300 μl 3 M KOAc pH 5,5 i inkubować przez 10 minut na lodzie. Odwirować próbki w temperaturze 4 °C, maksymalna prędkość przez 10 minut. Dodać 800 μl izopropanolu do supernatantów i inkubować przez 10 minut na lodzie. Odwirować próbki przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przepłukać osad 500 μl 70% etanolu. Pozostawić granulkę do wyschnięcia i ponownie zawiesić ją w sterylnych warunkach w 40 μl Tris-EDTA pH 8,0. DNA bakterii powinno być przechowywane w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Generuj bakulowirusy zgodnie z opisem w protokole producenta. Bakulowirusy mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
</ol>
2. Ekspresja białka rekombinowanego
<ol>
	<li>Aby wybrać najskuteczniejszego bakulowirusa do oczyszczenia i monitorować, w którym czasie osiągany jest szczyt ekspresji białka, należy przeprowadzić test mini-infekcji w następujący sposób: Zainfekuj 2 x 107 komórek zakażonych Sf9 hodowanych w temperaturze 27 °C w pożywce Grace'a (uzupełnionej 10% FBS i 1% P/S) 133 μl (1/150) bakulowirusa. Zbierz porcje po 1,5 ml po 0, 24, 48 i 72 godzinach po zakażeniu. Umieść komórki w osadkach i przeanalizuj poziom ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą western blot przy użyciu przeciwciał anty-tagowych.</li>
	<li>Użyj najskuteczniejszego bakulowirusa z kroku 2.1, aby zainfekować spinnera zawierającego 1,0 x 106 komórek Sf9 na ml w 500 ml pożywki w stosunku 1/150 między wirusem a pożywką. Pozwolić zakażonym komórkom rosnąć w zawiesinie w temperaturze 27 °C i zebrać komórki, gdy osiągnięta zostanie maksymalna ekspresja białka (jak określono w kroku 2.1 powyżej). Granulowane komórki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie rozpuszczalnego lizatu komórkowego
Wszystkie poniższe etapy inkubacji są przeprowadzane w temperaturze 4 °C przy łagodnym obrocie.
<ol>
	<li>Lizuj komórki Sf9 wyrażające interesujące Cię białko w ~ 20 ml buforu wiążącego GST (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X-100, 1 mM DTT w PBS1X dla końcowego stężenia NaCl 250 mM i koktajl inhibitorów proteazy (Roche). W lodowatej kąpieli wodnej zanurz roztwór 20 razy za pomocą homogenizatora z odbiciem, poddaj sonikacji 3 razy po 30 sekund (70% wydajności) i ponownie zanurz 20 razy.</li>
	<li>(Opcjonalnie). Inkubować całkowity lizat komórkowy z 1 mM MgCl2 i nukleazą benzonazy7 (2,5 U/ml) przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczenia DNA lub RNA.</li>
	<li>Wirować z prędkością 18 000 obr./min przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zachować supernatant.</li>
	<li>(Opcjonalnie). Ponownie odwirować supernatant przez 30 minut przy 18 000 obr./min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać klarowny rozpuszczalny lizat. Przepuść supernatant przez filtr 0,2 lub 0,45 μm, aby uniknąć zatkania.</li>
</ol>
4. Wiązanie białka na koralikach GST
<ol>
	<li>Inkubować rozpuszczalny lizat komórkowy z 1 ml kulek GST (dwukrotnie przemytych 10 ml buforu wiążącego GST) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C przy delikatnych zmianach.</li>
</ol>
Komentarz: Czas inkubacji musi być zoptymalizowany pod kątem stabilności białka i skuteczności wiązania.
<ol start="2">
	<li>Szybkie wirowanie z prędkością 700 obr./min i usunięcie supernatantu zawierającego niezwiązane białka (można go zachować do dalszej analizy). Przemyć białka związane z GST (rysunek 3B, tor 1) buforem płuczącym GST (bufor wiążący GST z 350 mM NaCl końcowym).</li>
	<li>Powtórz krok 4.2 2 razy. Przy ostatnim praniu usuń jak najwięcej supernatantu.</li>
	<li>Inkubować kulki z 5 mM ATP i 15 mM MgCl2 (w 10 ml buforu wiążącego GST) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, aby uniknąć niespecyficznego wiązania białek szoku cieplnego8. Umyj koraliki trzykrotnie buforem myjącym GST.</li>
</ol>
5. Podział GST przed rozcięciem
<ol>
	<li>Odwirować kulki GST, usunąć supernatant i przemyć kulki GST buforem P5 (50 mM NaHPO4 pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glicerol, 0,05% Triton-X-100, 5 mM imidazolu).</li>
	<li>Inkubować kulki GST z enzymem PreScission w buforze P5 przez 3 godziny do nocy w temperaturze 4 °C. (Podzielić kulki GST na frakcje po 100 μl i dodać 4-8 jednostek (2-4 μl) enzymu rozcieńczonego w 100 μl buforu P5).</li>
</ol>
Komentarz: Czas inkubacji etapu PreScission musi być zoptymalizowany zgodnie z masą cząsteczkową oraz stabilnością białka. Jeśli zaobserwuje się degradację, czas inkubacji można skrócić do minimum 2 godzin zamiast przez noc.
<ol start="3">
	<li>Szybko zakręć i zbierz supernatant. Powtórz ten krok dwa razy po dodaniu 100 μl buforu P5 do kulek i zgrupuj wszystkie frakcje (Rysunek 3B, ścieżka 2).</li>
</ol>
Komentarz: Pozostałe koraliki mogą być użyte do analizy efektywności dekoltu (Rysunek 3B, ścieżka 3). Zwykle 70-80% białka jest rozszczepione.
6. Wiązanie białek z żywicą TALON Metal Affinity
<ol>
	<li>Podzielić elucję od góry na 3 frakcje po 1 ml i inkubować każdą z nich ze 100 μl suchych kulek żywicy o powinowactwie do metalu Talon (wstępnie przemytych dwukrotnie buforem P5) przez 1 godzinę na zmianach.</li>
</ol>
Komentarz: Dzielenie elucji na kilka frakcji zwiększa skuteczność wiązania/płukania.
<ol start="2">
	<li>Przemyć żywicę przez 5 minut buforem P30 (bufor P5 o końcowym stężeniu 30 mM imidazolu).</li>
	<li>Powtórz krok 6.2 2x i zbierz koraliki w jednej tubce. Przed ostatnim praniem usuń jak najwięcej supernatantu.</li>
</ol>
Komentarz: To odpowiada próbce związanej z TALON (Rysunek 3B, pas 4).
7. Elucja oczyszczonego białka
<ol>
	<li>Żywicę TALON związaną z białkiem inkubować przez 5 minut na zmianę z buforem P500 (bufor P5 o końcowym stężeniu 500 mM imidazolu). Użyj stosunku między buforem a kulkami 1:1 v/v. (Na przykład, jeśli wziąłeś 200 μl suchych kulek, będziesz musiał dodać 200 μl P500). Powtórz ten krok dwa razy i utrzymuj każdą eluowaną frakcję osobno (nazwaną elucją: 1 (E1), elucją, 2 (E2) i elucją3 (E3); Rysunek 3B, pasy 5-7).</li>
</ol>
Komentarz: Pozostałe koraliki mogą być użyte do analizy skuteczności elucji (Rysunek 3B, ścieżka 8). Zazwyczaj 60-80% białka jest całkowicie eluowane.
<ol start="2">
	<li>Przeanalizuj ilość i jakość oczyszczonego białka, ładując około 20-40 μl każdej frakcji o standardowym stężeniu BSA na SDS-PAGE i barwiąc niebieskim Coomassie (ryc. 3B) lub barwnikiem białkowym SYPRO w celu wizualizacji.</li>
</ol>
Komentarz: Interesujące białko można również wykryć podczas procedury oczyszczania za pomocą przeciwciał anty-GST i anty-His (Rysunek 3C).
8. Przechowywanie oczyszczonego białka
<ol>
	<li>Oczyszczone białko należy dializować w odpowiednim buforze do przechowywania (np. 20 mM octanu trisu o pH 8,0, 200 mM KAc, 10% glicerolu, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) w temperaturze 4 °C. Ważne jest, aby sprawdzić, czy podczas dializy nie wytrąciło się oczyszczone białko. Zazwyczaj dializujemy 2x przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C przy rotacji mieszania.</li>
	<li>Z oczyszczonego białka należy przygotować małe porcje (10–20 μl) i zamrażać na suchym lodzie przez 30 minut. Przechowywać porcje w temperaturze -80 °C i unikać wielu cykli rozmrażania/zamrażania.</li>
</ol>

<ol><li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li>
<li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis%2C+using+three+different+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li>
<li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li>
<li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li>
<li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li>
<li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2%2B+in+the+hydrolysis+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li>
<li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li>
<li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li>
<li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+vector+system%3A+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li>
</ol>

Przedstawiony tutaj protokół oczyszczania GST-His jest odpowiedni do oczyszczania szerokiego zakresu rozmiarów rekombinowanych białek: Z powodzeniem oczyściliśmy LiRAD51 (41 kDa), piBRCA2 (120 kDa), PALB2 (130 kDa) i niestabilne białko o wysokiej masie cząsteczkowej Leishmania infantum: LiBRCA2 (125 kDa)6,9. Co więcej, białka oczyszczone za pomocą tego protokołu były aktywne biochemicznie6. Sukces tej metody zależy wyłącznie od ekspresji, rozpuszczalności i stabilności po...

Oczyszczanie białek rekombinowanych jest kluczowe dla odpowiedzi na fundamentalne pytania w biochemii. Konwencjonalne metody oczyszczania białek, takie jak chromatografia jonowymienna i chromatografia wykluczania wielkości, opierają się na właściwościach fizycznych białka docelowego, takich jak odpowiednio jego punkt izoelektryczny i ładunek lub rozmiar. Te ostatnie cechy białek są wspólne dla różnych białek, co znacznie zwiększa szansę na zanieczyszczenie białek w konwencjonalnych strategiach oczyszczania białek. Problem ten można obejść za pomocą wielu kolumn oczyszczających, co jest czasochłonne. Jednocześnie te ostatnie metody chromatograficzne wymagają kosztownej konfiguracji eksperymentalnej. Oczyszczanie znacznika powinowactwa silnie zwiększa swoistość docelową, ponieważ w większości przypadków znacznik będzie unikalny dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. W ostatnich badaniach szeroko stosowane jest oczyszczanie z powinowactwem do flagi lub HA.
W przeciwieństwie do istniejących protokołów oczyszczania białek rekombinowanych, w których używane są pojedyncze znaczniki, ustaliliśmy unikalną kombinację dwóch znaczników. Nasza metoda polega na fuzji znacznika GST na końcu N i znacznika Hisa na końcu C białka będącego przedmiotem zainteresowania, w celu uzyskania optymalnego stosunku między ilością a czystością pożądanego białka. GST to długa etykieta (29 kDa), która jest bardzo skuteczna w oczyszczaniu kulek glutationu Sepharose. Co więcej, stosowanie podatku od towarów i usług gwarantuje opłacalność naszej metody1. Możliwość odszczepienia GST za pomocą enzymu PreScission (z sekwencją rozpoznającą LeuGluValLeuPheGln/GlyPro, co skutkuje dodaniem tylko dwóch aminokwasów) ma wiele zalet, na przykład strategia ta pozwala uniknąć zmian fizjologicznych funkcji białek z powodu przeszkody allosterycznej. Mały znacznik Hisa połączony z drugim końcem białka służy w drugim etapie oczyszczania do zwiększenia czystości białka poprzez zmycie rozszczepionego GST, a także zdegradowanych białek i innych zanieczyszczeń. Dodatkowo protokół nie wymaga etapu dializy przy przełączaniu z kolumny etapowej GST na kolumnę etapową oczyszczania His (żywica TALON). Powszechnymi zanieczyszczeniami w takich procesach oczyszczania są białka szoku cieplnego (HSP). Dodanie etapu inkubacji z MgCl2 i ATP pozwala na usunięcie tych zanieczyszczeń (ryc. 1).
Szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC) i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) są powszechnymi technikami, które polegają na drogim oprzyrządowaniu, aby uzyskać wysoką wydajność oczyszczonego białka. Z kolei prezentowany przez nas protokół oczyszczania wsadowego jest ręczny i nie wymaga drogiej konfiguracji instrumentalnej. Wysoką wydajność białka można osiągnąć poprzez zwiększenie skali protokołu. Jednocześnie, dzięki protokołowi oczyszczania partii, objętość elucji można dostosować w celu zwiększenia stężenia białka, czego nie podaje się za pomocą FPLC lub HPLC.
Ponadto, dzięki protokołowi oczyszczania partii GST-His, białka o zakresie wielkości ~10-300 kDa mogą być oczyszczane. Jedną z największych zalet jest fakt, że można oczyścić kilka białek jednocześnie, na przykład zarówno białko typu dzikiego, jak i jego zmutowane. Powodzenie przedstawionego protokołu zależy wyłącznie od poziomu ekspresji i rozpuszczalności białka będącego przedmiotem zainteresowania.

<table><tr><tbody><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>E.Coli DH10Bac (kompetentny)</td>System ekspresji bakulowirusa <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac</td> Zestaw przygotowawczy <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Qiagen</td><td></td><td>12163</td><td>Roztwór I i II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Życie)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Komórki zakażone Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Enzym PreScission</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Zakażone podłoże Grace uzupełnione</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca charakteryzująca</td><td>się Hyklon</td><td>SH30396,03</td><td></td></tr><tr><td>P / S (penicylina-streptomycyna)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutation Sepharose żywica</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon żywica</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało GST</td><td>Produkcja we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne 6X-His-Clontech</td><td></td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dounce homogenizator (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Torba do dializy (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>2115217</tr></tbody></table>

oczyszczanie gst-his : dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Kluczowe testy enzymatyczne do biochemicznej charakterystyki białek in vitro wymagają wysokich stężeń oczyszczonego białka, które jest przedmiotem zainteresowania. Protokoły oczyszczania białek powinny łączyć w sobie skuteczność, prostotę i opłacalność1. Tutaj opisujemy metodę GST-His jako nowy system oczyszczania powinowactwa na małą skalę dla białek rekombinowanych, oparty na N-końcowym znaczniku sefarozy glutationu (GST)2,3 i C-końcowym znaczniku 10xHis4, które są połączone z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Ten ostatni konstrukt jest używany do generowania bakulowirusów, do infekcji komórek zakażonych Sf9 w celu ekspresji białka5. GST to dość długa etykieta (29 kDa), która służy do zapewnienia skuteczności oczyszczania. Może jednak wpływać na właściwości fizjologiczne białka. W związku z tym jest on następnie odcinany od białka za pomocą enzymu PreScission6. Aby zapewnić maksymalną czystość i usunąć rozszczepiony podatek od towarów i usług, dodaliśmy drugi etap oczyszczania powinowactwa oparty na stosunkowo małym His-Tagu. Co ważne, nasza technika opiera się na dwóch różnych znacznikach flankujących dwa końce białka, co jest skutecznym narzędziem do usuwania zdegradowanych białek, a tym samym wzbogaca białka o pełnej długości. Przedstawiona tutaj metoda nie wymaga drogiego zestawu instrumentalnego, takiego jak FPLC. Dodatkowo zastosowaliśmy myjki MgCl2 i ATP w celu usunięcia zanieczyszczeń białkowych szoku cieplnego oraz obróbkę nukleazą w celu zniesienia zanieczyszczających kwasów nukleinowych. Podsumowując, połączenie dwóch różnych znaczników otaczających N- i C-koniec oraz zdolność do odcięcia jednego ze znaczników gwarantuje odzyskanie wysoce oczyszczonego i pełnowymiarowego białka, które jest przedmiotem zainteresowania.

Aby zilustrować wydajność protokołu oczyszczania GST-His, oczyszczono Rec14, białko S. pombe o masie 32,9 kDa. cDNA Rec14 sklonowano w zmodyfikowanym wektorze pFastBac1, co umożliwiło dodanie znaczników GST na końcu N oraz His na końcu C (Ryc. 1A). Następnie przygotowano rekombinowane bakulowirusy i wykorzystano je do infekcji komórek SF9 w celu ekspresji białka. Rozpuszczalne lizaty komórkowe inkubowano z kulkami GST, a związane białka eluowano poprzez odcięcie GST za pomocą proteazy PreScissio...

W obecnym protokole demonstrujemy wysoce efektywną i opłacalną metodę oczyszczania białek na małą skalę, która pozwala na oczyszczanie rekombinowanych białek poprzez unikalne połączenie rozszczepialnego znacznika GST i małego znacznika His.

Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest otrzymanie wysokiej czystości, pełnowymiarowego białka docelowego. Osiąga się to poprzez wytworzenie rekombinowanego wirusa baculovirus, który służy do infekcji komórek owadów SF nine w celu uzyskania wysokiej ekspresji i rozpuszczalności wersji białka docelowego z dwoma znacznikami. Następnie przeprowadza się dwuetapowe oczyszczanie powinowactwem, polegające na oczyszczaniu białka z znacznikiem glutationu i serozyny, a następnie na chromatografii powinowactwa do metali.Wynikiem oczyszczania jest wysokiej czystości białko z tagiem histydynowym. Następnie próbki oczyszczonego białka poddawane są dializie, aby zapewnić niskie stężenie soli w buforze do przechowywania. Wyniki uzyskane na podstawie barwienia całkowitego białka w żelu SDS-PAGE pozwalają określić rozpuszczalność ekspresji, ilość oraz jakość białka.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy napotkaliśmy trudności z oczyszczaniem dużych i niestabilnych białek, takich jak PAL B two oraz BOC two. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak jednokrokowe oczyszczanie powinowactwa, jest to, że w naszym protokole dwukrokowego oczyszczania powinowactwa otrzymane białko jest wysokiej czystości i zazwyczaj wolne od produktów degradacji. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii białek, takie jak funkcje biochemiczne oczyszczonych białek rekombinowanych.Niniejszy protokół rozpoczyna się od produkcji rekombinowanego wirusa baculowirusa, a następnie wyboru najskuteczniejszego wirusa BA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym dotyczącym infekcji. Należy przygotować naczynie do hodowli w inkubatorze z mieszadłem (spinnerze) zawierające od 0,75 do 1,0 × 10⁶ komórek SF9 w 500 ml pożywki, przy zachowaniu stosunku wirusa do pożywki wynoszącego 1:150. Spinner należy umieścić pod dygestorium do hodowli komórkowych, a następnie zainfekować komórki, dodając wymaganą objętość zawiesiny baculowirusa do zawiesiny komórkowej poprzez jedno z ramion spinnera.Pozostaw zainfekowane komórki do wzrostu w zawiesinie w temperaturze 27 °C i zbierz komórki w momencie osiągnięcia maksymalnej ekspresji białka, co określa się podczas wyboru najwydajniejszego wirusa baculowirusowego. Po zbiorze komórek poddaj lizie komórki Sf9 eksponujące interesujące białko w około 20 ml buforu wiążącego GST, uzupełnionego o inhibitory proteaz, w kąpieli wodnej z lodem. Przelej roztwór 20 razy za pomocą homogenizatora, a następnie poddaj sonikacji w trzech 32-sekundowych cyklach, po czym ponownie przelej 20 razy. Następnie odwiruj lizat komórkowy przy 18 000 RPM przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zachowaj supernatant. Inkubuj rozpuszczalny lizat komórkowy z 1 ml uprzednio przemytych kulek GST przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C przy łagodnym obracaniu.Czas inkubacji należy zoptymalizować zgodnie ze stabilnością białka oraz efektywnością wiązania po przeprowadzeniu procesu. Krótko odwiruj próbkę przy 700 RPM i usuń supernatant zawierający niezwiązane białka. Przemyj białka związane z GST buforem do przemywania GST.Powtórz ten proces dwukrotnie po ostatnim płukaniu. Usuń jak najwięcej supernatantu. Następnie inkubuj kuleczki z 5 mM ATP i 15 mM chlorku magnezu w 10 ml buforu wiążącego GST przez jedną godzinę w temperaturze 4°C, aby uniknąć niespecyficznego wiązania białek szoku cieplnego po inkubacji.Przemyj kuleczki trzykrotnie buforem płuczącym GST. Po odwirowaniu kuleczek GST i usunięciu nadsączu, przemyj kuleczki GST buforem P five. Następnie podziel kuleczki GST na frakcje po 100 µL i dodaj od czterech do ośmiu jednostek enzymu precision rozpuszczonego w 100 µL buforu P five.Inkubować kulki GST z enzymem przez trzy godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C przy łagodnym obracaniu. Czas inkubacji należy zoptymalizować w zależności od masy cząsteczkowej oraz stabilności białka po przecięciu. Krótko odwirować i zebrać nadsącz.Do kulek dodać 100 µL buforu P five. Następnie dwukrotnie powtórzyć proces dodawania, wirowania i zbierania nadsączu. Zebrać wszystkie frakcje.Podziel EIT na trzy frakcje po 1 ml i inkubuj każdą z nich z 100 µL uprzednio przemytych suchych kulek żywicy powinowactwa do metalu talon przez jedną godzinę w warunkach rotacji; podzielenie elucji na kilka frakcji zwiększa wydajność wiązania i przemywania. Następnie przemywaj żywicę przez pięć minut buforem P 30 w temperaturze 4 °C przy łagodnej rotacji. Po dwukrotnym powtórzeniu przemywania, zgromadź kuleczki w jednej probówce, aby wyeluować oczyszczone białko.Dodaj bufor P 500 do żywicy talon z wiązanym białkiem. Dodaj bufor w stosunku objętościowym jeden do jednego względem kulek. Inkubuj zawiesinę przez pięć minut w warunkach rotacji.Powtórz ten krok dwukrotnie. Przechowuj każdą z elowanych frakcji oddzielnie w celu zmagazynowania oczyszczonego białka. Dializuj białko przeciwko odpowiedniemu buforowi do przechowywania dwukrotnie przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C przy ciągłym mieszaniu.Ważne jest sprawdzenie, czy podczas dializy nie doszło do wytrącenia oczyszczonego białka. Należy przygotować małe alikwoty oczyszczonego białka i zamrozić je na suchem lodzie przez 30 minut. Alikwoty należy przechowywać w temperaturze -80°C, unikając wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.Analizę procesu oczyszczania przeprowadzono, nakładając od około 20 do 40 µL każdej frakcji na żel SDS-PAGE. Po elektroforezie żel zabarwiono błękitem Coomassie lub barwnikiem do białek w celu wizualizacji. Rozpuszczalne i całkowite lizaty komórkowe z komórek SF9 zainfekowanych rekombinowanym wirusem VALO REC 14 lub niezinfekowanych (kontrola) przeanalizowano za pomocą barwienia błękitem Coomassie, co pozwoliło potwierdzić ekspresję białka GST-RE14-His podczas procesu oczyszczania. Przeanalizowano wiele próbek, aby ocenić wydajność metody, poddając je analizie za pomocą błękitu Coomassie.Barwienie wykazuje, że podczas pierwszego etapu oczyszczania GST Rec 14 został prawidłowo związany z kuleczkami GST, wykazując pozorną masę cząsteczkową około 50 kilodaltonów ze względu na fuzję rec 14 z GST; po precyzyjnym cięciu w miejscu G-S-T-G-S-T wolny rec 14 hiss migruje w okolicy 37 kilodaltonów. Podczas gdy odcięte GST można zaobserwować na kuleczkach GST, to pomimo części wolnego REC 14, który pozostał związany z kuleczkami GST, osiągnięto znaczące wzbogacenie REC 14 hiss. Ten etap można by usprawnić poprzez wydłużenie czasu inkubacji białka z precyzyjną proteazą. Analiza REC 14 hiss związanego z kuleczkami Talon w porównaniu do białek eluowanych po etapie oczyszczania GST wykazuje, że duża frakcja REC 14 hiss jest związana z kuleczkami Talon.Po kilku etapach płukania REC 14 hiss został wymyty i zebrany, a następnie przeprowadzono trzy elucje. Analiza wykazała wysoką czystość REC 14 hiss; największe stężenie REC 14 hiss odnotowano w pierwszej frakcji elucyjnej. Porównanie frakcji elowanych z koralikami Talon po elucji potwierdza efektywność procesu, ponieważ na koralikach wykryto niewielką ilość związanego REC 14 hiss.Próbki te poddano również analizie Western blot z przeciwciałami anty-GST i anty-Hiss w celu monitorowania REC 14. W toku procedury blot anty-GST wykazał obecność części GST-REC 14 oraz samego GST w białkach wspomnianych z etapu oczyszczania GST, a także że zanieczyszczenia zostały usunięte na etapie oczyszczania powinowactwem do znacznika Hiss. Blot ten ujawnił, że GST zostało skutecznie usunięte z REC 14 poprzez precyzyjną obróbkę i etap oczyszczania znacznikiem Hiss.Celem analizy western blot przeciwko His jest wykrycie białka Rec 14. Analiza ta potwierdza, że białka GST Rec 14 His oraz REC 14 His nie zostały całkowicie odcięte i usunięte z kulek GST. Co więcej, przy wysokim stężeniu REC 14 wykazuje tendencję do agregacji.Podsumowując, przedstawione wyniki wykazują skuteczność oczyszczania GST-His w procesie izolacji S palm B rec 14. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat tego, jak odzyskać wysoko oczyszczone białko rekombinowane.Technikę tę można przeprowadzić w ciągu 12 godzin po degradacji rozpuszczalnego kwasu liowego, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby pracować szybko i ściśle w temperaturze 4°C, aby uniknąć degradacji białka po przeprowadzeniu procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja partnerów białkowych lub modyfikacje potranslacyjne badanego białka, można zastosować inne metody, np. testy ko-precypitacji lub spektrometrię mas.Chociaż stosujemy tę metodę w odniesieniu do białek naprawczych DNA, strategia ta mogłaby zostać zmodyfikowana w celu zbadania funkcji białek w innych obszarach badawczych.

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oczyszczanie GST-His: Protokół dwustopniowego oczyszczania powinowactwowego dający pełne oczyszczone białka

Transdukcja białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie czynnych białek do komórek. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, takich jak transfekcja DNA czy transdukcja wirusowa, ten nieinwazyjny paradygmat pozwala na wysoce efektywną manipulację komórkową w sposób miareczkowalny, unikając toksyczności komórkowej oraz ryzyka transformacji onkogennej wynikającej z trwałej modyfikacji genetycznej.

Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

W niniejszej pracy opisujemy protokół oczyszczania wysoce aktywnego białka Hsp104, heksamerycznego białka AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z disagregacją białek. Schemat ten wykorzystuje konstrukt z oznakowaniem His6 do oczyszczania powinowactwa z E. coli, a następnie chromatografię wymiany anionowej, usunięcie znacznika His6 za pomocą proteazy TEV oraz chromatografię wykluczania cząsteczkowego.

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

Opracowano i szczegółowo opisano nowatorski i wysoce wydajny dwuetapowy protokół chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na niewielkim znaczniku oczyszczającym o dwóch wrodzonych powinowactwach i jest możliwa do zastosowania w odniesieniu do szerokiego zakresu białek docelowych o różnych właściwościach.<br...

Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017).Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanego białka oznaczonego polisystydyną za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu. Określa kluczowe kroki, w tym lizę bakteryjną przez sonikację, klarowanie i filtrację lizatu oraz selektywne wiązanie i eluację docelowego białka za pomocą...

 Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii powinowactwa niklu do oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną z bakterii Clostridium difficile.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii powinowactwa niklu: technika oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną z lizatu komórek bakteryjnych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Na podstawie mechanizmu składania kompleksu białkowego INAD, w tym protokole, zmodyfikowano strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP Drosophila.

Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Naucz się dwuetapowej oczyszczania powinowactwa GST-His w celu uzyskania pełnej długości białek rekombinowanych o wysokiej czystości. Ta metoda zapewnia efektywną izolację białek rozpuszczalnych.

Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Przeglądaj więcej filmów