Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest otrzymanie wysokiej czystości, pełnowymiarowego białka docelowego. Osiąga się to poprzez wytworzenie rekombinowanego wirusa baculovirus, który służy do infekcji komórek owadów SF nine w celu uzyskania wysokiej ekspresji i rozpuszczalności wersji białka docelowego z dwoma znacznikami. Następnie przeprowadza się dwuetapowe oczyszczanie powinowactwem, polegające na oczyszczaniu białka z znacznikiem glutationu i serozyny, a następnie na chromatografii powinowactwa do metali.

Wynikiem oczyszczania jest wysokiej czystości białko z tagiem histydynowym. Następnie próbki oczyszczonego białka poddawane są dializie, aby zapewnić niskie stężenie soli w buforze do przechowywania. Wyniki uzyskane na podstawie barwienia całkowitego białka w żelu SDS-PAGE pozwalają określić rozpuszczalność ekspresji, ilość oraz jakość białka.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy napotkaliśmy trudności z oczyszczaniem dużych i niestabilnych białek, takich jak PAL B two oraz BOC two. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak jednokrokowe oczyszczanie powinowactwa, jest to, że w naszym protokole dwukrokowego oczyszczania powinowactwa otrzymane białko jest wysokiej czystości i zazwyczaj wolne od produktów degradacji. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii białek, takie jak funkcje biochemiczne oczyszczonych białek rekombinowanych.

Niniejszy protokół rozpoczyna się od produkcji rekombinowanego wirusa baculowirusa, a następnie wyboru najskuteczniejszego wirusa BA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym dotyczącym infekcji. Należy przygotować naczynie do hodowli w inkubatorze z mieszadłem (spinnerze) zawierające od 0,75 do 1,0 × 10⁶ komórek SF9 w 500 ml pożywki, przy zachowaniu stosunku wirusa do pożywki wynoszącego 1:150. Spinner należy umieścić pod dygestorium do hodowli komórkowych, a następnie zainfekować komórki, dodając wymaganą objętość zawiesiny baculowirusa do zawiesiny komórkowej poprzez jedno z ramion spinnera.

Pozostaw zainfekowane komórki do wzrostu w zawiesinie w temperaturze 27 °C i zbierz komórki w momencie osiągnięcia maksymalnej ekspresji białka, co określa się podczas wyboru najwydajniejszego wirusa baculowirusowego. Po zbiorze komórek poddaj lizie komórki Sf9 eksponujące interesujące białko w około 20 ml buforu wiążącego GST, uzupełnionego o inhibitory proteaz, w kąpieli wodnej z lodem. Przelej roztwór 20 razy za pomocą homogenizatora, a następnie poddaj sonikacji w trzech 32-sekundowych cyklach, po czym ponownie przelej 20 razy. Następnie odwiruj lizat komórkowy przy 18 000 RPM przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zachowaj supernatant. Inkubuj rozpuszczalny lizat komórkowy z 1 ml uprzednio przemytych kulek GST przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C przy łagodnym obracaniu.

Czas inkubacji należy zoptymalizować zgodnie ze stabilnością białka oraz efektywnością wiązania po przeprowadzeniu procesu. Krótko odwiruj próbkę przy 700 RPM i usuń supernatant zawierający niezwiązane białka. Przemyj białka związane z GST buforem do przemywania GST.

Powtórz ten proces dwukrotnie po ostatnim płukaniu. Usuń jak najwięcej supernatantu. Następnie inkubuj kuleczki z 5 mM ATP i 15 mM chlorku magnezu w 10 ml buforu wiążącego GST przez jedną godzinę w temperaturze 4°C, aby uniknąć niespecyficznego wiązania białek szoku cieplnego po inkubacji.

Przemyj kuleczki trzykrotnie buforem płuczącym GST. Po odwirowaniu kuleczek GST i usunięciu nadsączu, przemyj kuleczki GST buforem P five. Następnie podziel kuleczki GST na frakcje po 100 µL i dodaj od czterech do ośmiu jednostek enzymu precision rozpuszczonego w 100 µL buforu P five.

Inkubować kulki GST z enzymem przez trzy godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C przy łagodnym obracaniu. Czas inkubacji należy zoptymalizować w zależności od masy cząsteczkowej oraz stabilności białka po przecięciu. Krótko odwirować i zebrać nadsącz.

Do kulek dodać 100 µL buforu P five. Następnie dwukrotnie powtórzyć proces dodawania, wirowania i zbierania nadsączu. Zebrać wszystkie frakcje.

Podziel EIT na trzy frakcje po 1 ml i inkubuj każdą z nich z 100 µL uprzednio przemytych suchych kulek żywicy powinowactwa do metalu talon przez jedną godzinę w warunkach rotacji; podzielenie elucji na kilka frakcji zwiększa wydajność wiązania i przemywania. Następnie przemywaj żywicę przez pięć minut buforem P 30 w temperaturze 4 °C przy łagodnej rotacji. Po dwukrotnym powtórzeniu przemywania, zgromadź kuleczki w jednej probówce, aby wyeluować oczyszczone białko.

Dodaj bufor P 500 do żywicy talon z wiązanym białkiem. Dodaj bufor w stosunku objętościowym jeden do jednego względem kulek. Inkubuj zawiesinę przez pięć minut w warunkach rotacji.

Powtórz ten krok dwukrotnie. Przechowuj każdą z elowanych frakcji oddzielnie w celu zmagazynowania oczyszczonego białka. Dializuj białko przeciwko odpowiedniemu buforowi do przechowywania dwukrotnie przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C przy ciągłym mieszaniu.

Ważne jest sprawdzenie, czy podczas dializy nie doszło do wytrącenia oczyszczonego białka. Należy przygotować małe alikwoty oczyszczonego białka i zamrozić je na suchem lodzie przez 30 minut. Alikwoty należy przechowywać w temperaturze -80°C, unikając wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.

Analizę procesu oczyszczania przeprowadzono, nakładając od około 20 do 40 µL każdej frakcji na żel SDS-PAGE. Po elektroforezie żel zabarwiono błękitem Coomassie lub barwnikiem do białek w celu wizualizacji. Rozpuszczalne i całkowite lizaty komórkowe z komórek SF9 zainfekowanych rekombinowanym wirusem VALO REC 14 lub niezinfekowanych (kontrola) przeanalizowano za pomocą barwienia błękitem Coomassie, co pozwoliło potwierdzić ekspresję białka GST-RE14-His podczas procesu oczyszczania. Przeanalizowano wiele próbek, aby ocenić wydajność metody, poddając je analizie za pomocą błękitu Coomassie.

Barwienie wykazuje, że podczas pierwszego etapu oczyszczania GST Rec 14 został prawidłowo związany z kuleczkami GST, wykazując pozorną masę cząsteczkową około 50 kilodaltonów ze względu na fuzję rec 14 z GST; po precyzyjnym cięciu w miejscu G-S-T-G-S-T wolny rec 14 hiss migruje w okolicy 37 kilodaltonów. Podczas gdy odcięte GST można zaobserwować na kuleczkach GST, to pomimo części wolnego REC 14, który pozostał związany z kuleczkami GST, osiągnięto znaczące wzbogacenie REC 14 hiss. Ten etap można by usprawnić poprzez wydłużenie czasu inkubacji białka z precyzyjną proteazą. Analiza REC 14 hiss związanego z kuleczkami Talon w porównaniu do białek eluowanych po etapie oczyszczania GST wykazuje, że duża frakcja REC 14 hiss jest związana z kuleczkami Talon.

Po kilku etapach płukania REC 14 hiss został wymyty i zebrany, a następnie przeprowadzono trzy elucje. Analiza wykazała wysoką czystość REC 14 hiss; największe stężenie REC 14 hiss odnotowano w pierwszej frakcji elucyjnej. Porównanie frakcji elowanych z koralikami Talon po elucji potwierdza efektywność procesu, ponieważ na koralikach wykryto niewielką ilość związanego REC 14 hiss.

Próbki te poddano również analizie Western blot z przeciwciałami anty-GST i anty-Hiss w celu monitorowania REC 14. W toku procedury blot anty-GST wykazał obecność części GST-REC 14 oraz samego GST w białkach wspomnianych z etapu oczyszczania GST, a także że zanieczyszczenia zostały usunięte na etapie oczyszczania powinowactwem do znacznika Hiss. Blot ten ujawnił, że GST zostało skutecznie usunięte z REC 14 poprzez precyzyjną obróbkę i etap oczyszczania znacznikiem Hiss.

Celem analizy western blot przeciwko His jest wykrycie białka Rec 14. Analiza ta potwierdza, że białka GST Rec 14 His oraz REC 14 His nie zostały całkowicie odcięte i usunięte z kulek GST. Co więcej, przy wysokim stężeniu REC 14 wykazuje tendencję do agregacji.

Podsumowując, przedstawione wyniki wykazują skuteczność oczyszczania GST-His w procesie izolacji S palm B rec 14. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat tego, jak odzyskać wysoko oczyszczone białko rekombinowane.

Technikę tę można przeprowadzić w ciągu 12 godzin po degradacji rozpuszczalnego kwasu liowego, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby pracować szybko i ściśle w temperaturze 4°C, aby uniknąć degradacji białka po przeprowadzeniu procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja partnerów białkowych lub modyfikacje potranslacyjne badanego białka, można zastosować inne metody, np. testy ko-precypitacji lub spektrometrię mas.

Chociaż stosujemy tę metodę w odniesieniu do białek naprawczych DNA, strategia ta mogłaby zostać zmodyfikowana w celu zbadania funkcji białek w innych obszarach badawczych.