Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest oczyszczenie natywnego kompleksu makromolekularnego o jakości odpowiedniej do badań biofizycznych. Protokół ten służy nie tylko jako metoda oczyszczania kompleksu, ale także jako szczegółowy przewodnik po ocenie jakości strukturalnej próbki w trakcie procesu oczyszczania. Główną zaletą tego protokołu jest możliwość prostego i szybkiego oczyszczenia natywnego kompleksu w warunkach buforowych zbliżonych do fizjologicznych, co pozwala na zapewnienie homogeniczności składu.

Po odwirowaniu komórek S.cerevisiae i odlaniu supernatantu zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać dwa mililitry schłodzonego buforu lizującego, a następnie zamieszać i/lub użyć 10 mililitrowej pipety serologicznej w celu zawieszenia osadu. Zawiesinę komórkową należy przenieść do pustej, 50 mililitrowej stożkowatej polipropylenowej probówki wirówkowej przechowywanej w lodzie. Następnie należy użyć dodatkowych dwóch mililitrów schłodzonego buforu lizującego do wypłukania każdej probówki wirówkowej i dodać otrzymany roztwór do probówki 50 mililitrowej.

Po wyznaczeniu masy mokrej osadu komórkowego, przygotuj kąpiel w ciekłym azocie wewnątrz i wokół stożkowej polipropylenowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie pobierz zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 5 ml i podłącz do niej igłę o rozmiarze 16 G. Po tym zamroź zawiesinę komórkową, przepuszczając ją przez strzykawkę i igłę do kąpieli z szybkością około 1 ml na minutę, aby utworzyć kropelki.

Aby zlizować komórki drożdży, należy najpierw schłodzić młynek do kawy za pomocą ciekłego azotu. Następnie należy dodać do 40 g komórek drożdży i mielić przez 25 s, powtarzając proces mielenia osiem lub dziewięć razy. Zaleca się, aby nie oczyszczać więcej niż 10 l hodowli komórkowej w jednej serii.

Minimalizuje to czas oczyszczania i zapewnia zachowanie integralności strukturalnej kompleksu. Po każdych dwóch cyklach mielenia należy dodać do młynka niewielką warstwę ciekłego azotu i poczekać, aż odparuje. Aby zapobiec zlepianiu się komórek, należy uniemożliwić ich odtajanie, mieszając je szpatułką schłodzoną w ciekłym azocie.

Po lizie komórki powinny mieć postać drobnego białego proszku. Po sprawdzeniu lizi komórek i przygotowaniu buforu do lizy z dodatkiem PMSF, DTT i inhibitorów proteaz zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć schłodzonej w ciekłym azocie szpatułki, aby stopniowo przenosić zamrożony proszek z lizowanych komórek do przygotowanych probówek 50 ml z buforem. Po każdej dodanej porcji należy delikatnie obracać probówki 50 ml w temperaturze pokojowej, aby rozmrozić i rozpuścić komórki oraz zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza.

W miarę rozpuszczania się komórek należy dodawać kolejne porcje proszku komórkowego. Po dodaniu wszystkich komórek kontynuuj rozmrażanie i rozpuszczanie, aż w probówkach nie będą widoczne żadne zamrożone grudki komórek. Powinno to zająć około 50 minut.

Następnie odwiruj lizat komórkowy przy 25 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po lizie komórek i wirowaniu można zauważyć niewielką ciemną warstwę w nierozpuszczalnym osadzie. Przenieś nadsadziny do poliwęglanowych probówek do ultrawirowania i dodaj 10 µL 200 mM PMSF do każdej pełnej probówki.

Wiruj próbki przy 100 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Po zakończeniu wirowania powinny być widoczne cztery warstwy: twardy, przezroczysty osad zawierający głównie kompleksy rybosomalne; miękki osad bogaty w lipidy; szeroka, przezroczysta warstwa o żółtawym zabarwieniu zawierająca większość rozpuszczalnych białek i kompleksów komórkowych oraz łuskowata warstwa wierzchnia składająca się z lipidów.

W pomieszczeniu chłodniczym w temperaturze 4°C, używając pipety o objętości 1 ml, usunąć jak największą ilość górnej, łuskowatej warstwy lipidowej i ją odrzucić. Użyć pipety serologicznej o objętości 10 ml, aby odessać większość przejrzystej żółtej warstwy. Następnie, używając pipety o objętości 1 ml, aby nie zakłócić dwóch dolnych warstw, odessać ostatnie kilka mililitrów tej warstwy.

Z 40 gramów wilgotnego osadu komórkowego zazwyczaj odzyskuje się około 48 mililitrów warstwy środkowej. Po przygotowaniu sepharose IgG zgodnie z protokołem tekstowym, połączyć żywicę IGG z nadsączem fazy środkowej oraz dwiema mini tabletkami inhibitora proteaz na każde 40 gramów komórek. Następnie umieścić na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Jest to roztwór partii IgG. Przygotuj dwie kolumny polyprep o pojemności 10 ml, odcinając końce kolumn, aby uzyskać płaski otwór. Wlej 24 ml zawiesiny żywicy IgG lub roztworu partii do każdej kolumny i poczekaj, aż osadzą się pod wpływem grawitacji.

Odpowiada to 200 µL upakowanej żywicy IgG. Jeśli sedymentacja trwa dłużej niż 30 minut, środkowa faza mogła zostać zanieczyszczona lipidami. Po zakończeniu sedymentacji należy przepłukać upakowaną kolumnę czterema kolejnymi porcjami po 10 mL buforu IgG D150.

Aby przeprowadzić cięcie proteazą TEV (tobacco etch virus) na kolumnie, należy uszczelnić dno kolumny i dodać 1 ml buforu IgG D150 oraz 100 µL proteazy TEV. Uszczelnić górę kolumny i mieszać przez 20 minut za pomocą mieszalnika termicznego przy 750 RPM i 18 °C. Ponownie zawiesić żywicę i mieszać przez kolejne 20 minut.

Następnie ponownie resuspenduj i powtórz 20-minutowe mieszanie po raz trzeci. Przenieś kolumnę do temperatury czterech stopni Celsjusza i wykorzystaj siłę grawitacji, aby eluować kompleks białkowy. Następnie dodaj 200 µL IgG D150, aby eluować objętość martwą.

Po przygotowaniu żywicy powinowactwa do kalmoduliny zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj do żywicy bufor wiążący kalmodulinę oraz próbkę, a następnie inkubuj w rotatorze do probówek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Przygotuj kolumnę PolyPrep o objętości dwóch mililitrów na każde 100 mikrolitrów zawiesiny kalmoduliny, odcinając koniec kolumny w celu uzyskania płaskiego otworu. Protokół określa konkretne bufory i objętości przebywania, dobrane tak, aby utrzymać wysoką koncentrację kompleksu i zminimalizować czas jego przebywania na żywicy.

W przypadku zmiany objętości hodowli zaleca się dostosowanie objętości żywicy oraz buforu w kolumnach grawitacyjnych, aby uwzględnić tę zmianę. Napełnić kolumnę nie więcej niż 100 µL zawiesiny kalmoduliny, a następnie, wykorzystując siłę grawitacji, trzykrotnie przemyć żywicę 5 mL buforu wiążącego kalmoduliny. Następnie białko należy eluować trzykrotnie, używając 200 µL buforu eluującego kalmoduliny.

Następnie szczelnie zamknij dno kolumny, dodaj 20 µL buforu elucyjnego i inkubuj przez 2,5 minuty, po czym zdejmij uszczelnienie i pozwól białku eluować pod wpływem grawitacji. Ponownie szczelnie zamknij dno kolumny i dodaj 200 µL buforu elucyjnego, a następnie inkubuj przez pięć minut. Następnie odblokuj dno kolumny i przeprowadź elucję roztworu.

W przypadku szóstej i ostatniej elucji, zamknij dół kolumny i inkubuj z buforem elucyjnym przez 10 minut. Następnie otwórz dół i przeprowadź elucję. Wykonaj analizę po oczyszczaniu i przechowuj próbki zgodnie z protokołem tekstowym.

Jak pokazano tutaj, wstępna puryfikacja kompleksu metodą TAP przeprowadzona zgodnie z opublikowanym protokołem pozwoliła uzyskać kompleks, który w żelu barwionym srebrem migrował jako trzy prążki. Wielokrotne rundy optymalizacji metody TAP pozwoliły nam uzyskać kompleks migrujący w żelu natywnym jako pojedynczy prążek, co wskazuje na bardziej jednorodną strukturę kompleksu. Zgodnie z wynikiem w żelu natywnym, western blotting z użyciem przeciwciała TAP przeciwko kompleksowi oczyszczonemu zgodnie z opublikowanym protokołem wykazał proteolizę białka z tagiem TAP, SNU-71.

Modyfikacje metody TAP znacząco zmniejszyły zakres proteolizy, ponieważ prawie wszystkie z 17 białek w kompleksie U1 snRNP zostały rozdzielone za pomocą SDS-PAGE i dodatnio zidentyfikowane metodą wielokrotnej spektrometrii mas. Elektronowa mikroskopia z barwieniem negatywowym wykazuje monodyspersyjne cząsteczki po udanej puryfikacji po pierwszym i drugim etapie TAP. W przeciwieństwie do tego, w przypadku nieudanej puryfikacji nie obserwuje się cząsteczek o prawidłowej wielkości.

Jakość końcowego kompleksu oceniono na warstwie oczyszczonych cząsteczek, pokazanych tutaj, które na surowym obrazie EM z barwieniem negatywowym wydają się monodyspersyjne. Ponadto średnie klas cząsteczek wykazują wyraźne cechy wskazujące na to, że próbka jest prawdopodobnie odpowiednia do badań strukturalnych. Po opanowaniu techniki protokół ten można zrealizować w ciągu 10 do 12 godzin od rozmrożenia zamrożonego proszku z lizowanymi komórkami.

Podczas stosowania tego protokołu ważne jest upewnienie się, że wszystkie roztwory są wolne od proteaz i nukleaz, a także szybka praca w celu zapobiegania agregacji lub dysocjacji kompleksu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak oczyścić natywny kompleks o jakości odpowiedniej do badań strukturalnych, a także jak ocenić, czy cel ten został osiągnięty.