Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Ogólnym celem tego protokołu jest oczyszczenie natywnego kompleksu makromolekularnego o jakości odpowiedniej do badań biofizycznych. Protokół ten służy nie tylko jako sposób oczyszczania kompleksu, ale także jako szczegółowy przewodnik do oceny jakości strukturalnej próbki podczas oczyszczania. Główną zaletą tego protokołu jest to, że pozwala on w prosty i szybki sposób oczyścić natywny zespół w warunkach zbliżonych do fizjologicznych warunków buforowych, aby zapewnić jednorodność składu.

Po odwirowaniu komórek S. cerevisiae i dekantacji supernatantu zgodnie z protokołem tekstowym, dodać dwa mililitry schłodzonego buforu do lizy i zawirować i/lub użyć 10-mililitrowej pipety serologicznej do zawieszenia osadu. Przenieść zawiesinę komórkową do pustej stożkowej probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 mililitrów trzymanej na lodzie. Następnie użyj dodatkowych dwóch mililitrów schłodzonego buforu do lizy, aby umyć każdą butelkę wirówki i dodaj roztwór do 50-mililitrowej probówki.

Po określeniu mokrej masy osadu komórkowego należy utworzyć kąpiel ciekłego azotu w stożkowej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 mililitrów i wokół niej. Następnie wciągnij zawieszone komórki do pięciomililitrowej strzykawki i podłącz igłę o rozmiarze 16 do strzykawki. Następnie zamrozić zawiesinę komórkową, przepuszczając ją przez strzykawkę i igłę do kąpieli z szybkością około jednego mililitra na minutę, aby wytworzyć kropelki.

Aby zlizować komórki drożdży, zacznij od użycia ciekłego azotu do wstępnego schłodzenia młynka do kawy. Następnie dodaj do 40 gramów komórek drożdży i miel przez 25 sekund, powtarzając mielenie osiem lub dziewięć razy. Zaleca się, aby jednorazowo nie oczyszczać więcej niż 10 litrów kultury komórkowej.

Minimalizuje to czas oczyszczania i zapewnia utrzymanie integralności strukturalnej kompleksu. Po każdych dwóch rundach mielenia dodaj płytką warstwę ciekłego azotu do młynka i pozwól mu odparować. Aby zapobiec zbrylaniu się komórek, zapobiegaj ich rozmrażaniu za pomocą szpatułki chłodzonej ciekłym azotem do mieszania komórek.

Po lizie komórki powinny wyglądać jak drobny biały proszek. Po sprawdzeniu lizy komórek i przygotowaniu buforu do lizy z PMSF, DTT i inhibitorami proteazy zgodnie z protokołem tekstowym, użyj szpatułki chłodzonej ciekłym azotem, aby stopniowo nabrać zamrożony proszek komórek lizy do przygotowanych 50 mililitrowych probówek buforu. Z każdym dodanym przyrostem delikatnie obracaj 50-mililitrowe probówki w temperaturze pokojowej, aby rozmrozić i rozpuścić komórki oraz zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.

Gdy komórki się rozpuszczą, dodaj więcej proszku komórkowego. Po dodaniu wszystkich komórek kontynuuj rozmrażanie i rozpuszczanie komórek, aż w probówkach nie zaobserwuje się zamrożonych grudek komórek. Powinno to zająć około 50 minut.

Następnie odwiruj lizat komórkowy pod ciśnieniem 25 000 g i czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po lizie komórek i po odwirowaniu można zaobserwować niewielką ciemną warstwę w nierozpuszczalnym osadzie. Przenieść supernatant do poliwęglanowych probówek ultrawirówek i dodać 10 mikrolitrów 200 milimolowych PMSF do każdej pełnej probówki.

Odwirować próbki w temperaturze 100 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę. Pod koniec wirowania powinny być widoczne cztery warstwy. Twardy, przezroczysty osad zawierający głównie kompleksy rybosomalne; miękki granulek bogaty w lipidy; duża, przezroczysta, zabarwiona na żółto warstwa zawierająca większość rozpuszczalnych białek i kompleksów w komórce; i łuszcząca się górna warstwa składająca się z lipidów.

W chłodnym pomieszczeniu o temperaturze czterech stopni Celsjusza użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć jak najwięcej górnej łuszczącej się warstwy lipidowej i wyrzuć. Użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby odzyskać większość przezroczystej żółtej warstwy. Następnie, używając pipety o pojemności jednego mililitra, aby uniknąć naruszenia dwóch dolnych warstw, odzyskaj ostatnie kilka mililitrów tej warstwy.

Z 40 gramów granulatu z mokrymi komórkami zwykle odzyskuje się około 48 mililitrów środkowej warstwy. Po przygotowaniu sefarozy IgG zgodnie z protokołem tekstowym, należy połączyć żywicę IGG z supernatantem środkowej fazy i dwiema tabletkami inhibitora mini proteazy na 40 gramów komórek. Następnie umieść na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dwie godziny.

To jest roztwór wsadowy IgG. Przygotuj dwie 10-mililitrowe kolumny polyprep, odcinając końce kolumn, aby uzyskać płaski otwór. Wlej 24 mililitry zawiesiny zawiesiny żywicy IgG lub roztworu okresowego do każdej kolumny i pozostaw do osadzenia się grawitacyjnie.

Odpowiada to 200 mikrolitrom upakowanej żywicy IgG. Jeśli sedymentacja trwa dłużej niż 30 minut, środkowa faza mogła zostać zanieczyszczona lipidami. Po zakończeniu sedymentacji należy użyć czterech kolejnych 10-mililitrowych objętości buforu IgG D150 do przemycia wypełnionej kolumny.

Aby przeprowadzić rozszczepienie wirusa wytrawiania tytoniu lub proteazy TEV na kolumnie, uszczelnij dno kolumny i dodaj jeden mililitr buforu IgG D150 i 100 mikrolitrów proteazy TEV. Uszczelnij górną część kolumny i za pomocą mieszalnika termicznego przy 750 obr./min i 18 stopniach Celsjusza mieszaj przez 20 minut. Ponownie zawiesić żywicę i ponownie mieszać przez 20 minut.

Następnie ponownie zawieś i powtórz 20-minutowe mieszanie po raz trzeci. Przywróć kolumnę do czterech stopni Celsjusza i użyj grawitacji do elucji kompleksu białkowego. Następnie dodaj 200 mikrolitrów IgG D150, aby wymyć martwą objętość.

Po przygotowaniu żywicy powinowactwa do kalmoduliny zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj bufor wiążący kalmodulinę i próbkę do żywicy, a następnie użyj rotatora probówkowego do inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Przygotuj dwumililitrową kolumnę polyprep na 100 mikrolitrów zawiesiny kalmoduliny, przecinając koniec kolumny, aby utworzyć płaski otwór. Protokół wyszczególnia konkretne objętości bufora i miejsca zamieszkania wybrane tak, aby utrzymać koncentrację kompleksu i zminimalizować czas przebywania w nim żywicy.

Jeśli objętość kulturowa zostanie zmieniona, zaleca się zmianę objętości żywicy i bufora kolumn grawitacyjnych, aby uwzględnić zmianę. Wypełnij kolumnę nie więcej niż 100 mikrolitrami zawiesiny kalmoduliny i grawitacyjnie użyj 5 mililitrów buforu wiążącego kalmodulinę, aby trzykrotnie przepłukać żywicę. Używając 200 mikrolitrów buforu elucyjnego kalmoduliny, wymyj białko trzykrotnie.

Następnie uszczelnij dno kolumny i dodaj 20 mikrolitrów buforu elucyjnego i inkubuj przez 2,5 minuty przed zwolnieniem uszczelki i umożliwieniem wymycia białka grawitacyjnie. Ponownie uszczelnić dno kolumny i dodać 200 mikrolitrów buforu elucyjnego przed inkubacją przez pięć minut. Następnie rozszczelnić dno kolumny i wymyć roztwór.

W przypadku szóstej i ostatniej elucji uszczelnić dno kolumny i inkubować z buforem elucyjnym przez 10 minut. Następnie rozszczelnić i wymyć. Przeprowadzić analizę po oczyszczeniu i przechowywać próbki zgodnie z protokołem tekstowym.

Jak pokazano tutaj, wstępne oczyszczanie kompleksu metodą TAP zgodnie z opublikowanym protokołem dało kompleks, który migrował jako trzy prążki na żelu barwionym srebrem. Wielokrotne rundy optymalizacji metody TAP dają nam kompleks, który migrował jako pojedyncze pasmo na natywnym żelu, co wskazuje na bardziej jednorodny montaż. Zgodnie z natywnym wynikiem żelu, western blot przy użyciu przeciwciała TAP przeciwko kompleksowi, oczyszczonego zgodnie z opublikowanym protokołem, wykryło proteolizę białka znakowanego TAP, SNU-71.

Modyfikacje metody TAP znacznie zmniejszyły ilość proteolizy, ponieważ prawie wszystkie z 17 białek w kompleksie U1 snRNP zostały rozwiązane przez SDS-PAGE i pozytywnie zidentyfikowane za pomocą spektrometrii wielu mas. Mikroskopia elektronowa z barwieniem ujemnym pokazuje monorozproszone cząstki z udanego oczyszczania po pierwszym i drugim etapie TAP. W przeciwieństwie do tego, gdy oczyszczanie się nie powiedzie, nie obserwuje się żadnych cząstek o odpowiedniej wielkości.

Ostateczna jakość kompleksu została oceniona na trawniku z oczyszczonymi cząstkami, pokazanymi tutaj, które wydają się monorozproszone na surowym obrazie z ujemnym bejcem. Ponadto średnie klasowe cząstek ujawniają wyraźne cechy wskazujące, że próbka może nadawać się do badań strukturalnych. Po opanowaniu protokół ten można wykonać w ciągu 10 do 12 godzin od rozmrożenia zamrożonego proszku z komórek lizy.

Postępując zgodnie z tym protokołem, ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie roztwory są wolne od proteaz i nukleaz, a także działać szybko, aby zapobiec agregacji lub dysocjacji kompleksu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak oczyścić rodzimy kompleks o odpowiedniej jakości do badań strukturalnych, a także jak ocenić, czy zostało to osiągnięte.