Name: Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę tandemowego znacznika powinowactwa do oczyszczania natywnych kompleksów makromolekularnych z komórek S. cerevisiae. Protokół zapewnia szybką izolację z zachowaniem integralności strukturalnej dla badań biofizycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie i rady Nikolausa Grigoriewa. Dziękujemy Annie Loveland, Axelowi Brilotowi, Chen Xu i Mike'owi Rigneyowi za pomocne dyskusje i wskazówki dotyczące rynków wschodzących. Praca ta została sfinansowana przez National Science Foundation, Nagroda nr 1157892. Placówka Brandeis EM jest wspierana przez grant National Institutes of Health P01 GM62580.

Uwaga: Następujący protokół został opracowany dla oczyszczania kompleksu z 4 l hodowli komórkowej, około 40 g mokrej masy komórek. Po przygotowaniu wszystkie powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C i zużyte w ciągu miesiąca od ich przygotowania. Środek redukujący i inhibitory proteazy są dodawane do tylko tuż przed użyciem.
1. Przygotowanie ekstraktu z całych komórek do tandemowego oczyszczania powinowactwa 
<ol>
	<li>Wzrost komórek S. cerevisiae
	<ol>
		<li>Umieść żądany szczep S. cerevisiae oznaczony jako TAP z miejsca przechowywania (-80 °C) na płytce dekstrozy peptonowej (YPD) drożdży. Inkubować przez 3 - 5 dni (30 °C), aż komórki drożdży staną się białe i puszyste.</li>
		<li>Zaszczepić pasmo o długości około 2mm2 świeżych komórek z płytki do 10 ml pożywki YPD w stożkowej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml. Potrząśnij rurką z prędkością 180 obrotów na minutę (obr./min) przez noc (30 m°C).</li>
		<li>Zaszczepić 2 ml nocnej kultury na litr pożywki YPD w 2 l kolbie Erlenmeyera lub kolbie stożkowej. Wstrząsać przy 180 obr./min (30 °C). Monitoruj wzrost komórek przy gęstości optycznej 600 nm (OD600) do późnej fazy logarytmicznej, OD600 od 1,8 do 2, zwykle 20 - 24 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie komórek S. cerevisiae
	<ol>
		<li>Zbierać komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 400 x g przez 15 minut (4 °C).</li>
		<li>Szybko zdekantować supernatant i utrzymać komórki w temperaturze 4 °C lub na lodzie.</li>
		<li>Zawiesić każdy litr osadu komórkowego za pomocą 2 ml schłodzonego buforu do lizy (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCl; 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM imidazolu, pH 8,0; 10% glicerolu; 0,1% v/v NP-40). Zawiesić komórki przez wirowanie i/lub powtórzenie pipetowania przy użyciu pipety serologicznej o pojemności 10 ml. 
		Uwaga: Znaczenie NP-40 w odniesieniu do złożonej analizy jakości i po oczyszczeniu omówiono poniżej.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórkową do pustej stożkowej probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie. Umyć każdą butelkę wirówki dodatkowymi 2 ml schłodzonego buforu do lizy i dodać do zawiesiny komórek w probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Określ mokrą masę osadu komórkowego, ważąc probówkę i odejmując wagę pustej probówki, a także dodanego buforu do lizy. 
		Uwaga: Litr kultury komórkowej o OD600 wynoszącym 1,8 to około 10 g.</li>
		<li>Utworzyć kąpiel ciekłego azotu w stożkowej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml. Pobrać zawieszone komórki do strzykawki o pojemności 5 ml. Podłączyć igłę 16 G do strzykawki. Zamrozić zawiesinę komórkową, przepuszczając ją przez strzykawkę/igłę w celu wytworzenia "kropelek" komórek. Szybkość zamrażania powinna wynosić około 1 min/ml.</li>
		<li>Przechowywać zamrożone kropelki komórek (-80 °C) lub przystąpić do lizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lizacja komórek i klarowanie lizatu
	<ol>
		<li>Zlizuj komórki drożdży za pomocą młynka do kawy. Lizuj komórki osiem do dziewięciu razy z 25-sekundowymi seriami mielenia, potrząsając młynkiem do kawy. Przed użyciem należy wstępnie schłodzić młynek do kawy ciekłym azotem. Co dwie rundy mielenia dodaj płytką warstwę ciekłego azotu do młynka i pozwól mu odparować.</li>
		<li>W razie potrzeby wymieszaj szpatułką schłodzoną ciekłym azotem, aby zapobiec zbrylaniu się komórek. Zachowaj ostrożność, aby zapobiec rozmrażaniu komórek, co może spowodować zlepianie się komórek. Po lizie komórki powinny pojawić się jako drobny biały proszek. Jednorazowo można zmielić maksymalnie osad komórkowy z 4 l kultury drożdży (~ 40 g). 
		Uwaga: Spostrzeżenia dotyczące metody lizy omówiono poniżej.</li>
		<li>Oceń stopień lizy komórek za pomocą hemocytometru lub alternatywnej metody zliczania komórek. Aby zapewnić odpowiednią analizę, należy pobrać następujące próbki: (1) przed lizą; (2) po czterech rundach lizy; oraz (3) po lizie. Aby sprawdzić te próbki, należy pobrać niewielką ilość komórek za pomocą szpatułki schłodzonej ciekłym azotem i umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Po rozmrożeniu komórek odpipetować 5 μl komórek i wymieszać z 495 μl wody. Jeśli zaobserwuje się 40 - 60% lizę komórek, przejdź do następnego kroku w protokole. 
		Uwaga: Obserwacje dotyczące wpływu długich okresów lizy omówiono poniżej.</li>
		<li>Po zaobserwowaniu odpowiedniej lizy przechowuj zlizane komórki (-80 °C) lub przejdź do następnego kroku.</li>
		<li>Przygotuj dwie stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 50 ml, każda zawierająca 15 ml buforu do lizy, w tym 1 mM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), 1 mM ditiotreitolu (DTT) i dostępny w handlu koktajl inhibitorów proteazy. 
		Uwaga: Jeśli obserwuje się znaczną proteolizę, rozważ użycie szczepu z niedoborem proteazy.</li>
		<li>Za pomocą szpatułki schłodzonej ciekłym azotem nabrać zamrożony proszek z lizy komórkowej do przygotowanych probówek o pojemności 50 ml. Stopniowo dodawać proszek/ciało stałe do komórki do buforu do lizy, zawierającego zarówno reduktor, jak i inhibitor(y) proteazę.</li>
		<li>Delikatnie obrócić probówki o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej, aby rozmrozić/rozpuścić komórki, ale także zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Gdy proszek/ciało stałe komórki rozpuści się, dodaj dodatkową komórkę stałą/proszek.</li>
		<li>Napełnij każdą z dwóch probówek o pojemności 50 ml, aż do każdej z nich zostanie dodanych około 20 g komórek lub wszystkie komórki. Kontynuować rozmrażanie/rozpuszczanie do momentu, gdy w probówkach o pojemności 50 ml nie zaobserwuje się zamarzniętych grudek komórek. Powinno to zająć około 50 minut.</li>
		<li>Odwirować lizat zawieszonych komórek przez 20 minut w temperaturze 25 000 x g (4 °C). Dobrze zlizywane komórki mogą wykazywać niewielką ilość czarnego osadu.</li>
		<li>Przenieść 50 ml supernatantu do ultra-wirówek z poliwęglanu (użyto probówek o pojemności 26,3 ml) i dodać 10 μl 200 mM PMSF do każdej pełnej probówki.</li>
		<li>Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 x g (4°C). Powinny być widoczne cztery warstwy, od dołu do góry: (1) twardy, przezroczysty osad zawierający kompleksy rybosomalne; (2) miękki osad bogaty w lipidy; (3) duża, przezroczysta, zabarwiona na żółto warstwa zawierająca większość rozpuszczalnych białek i kompleksów komórki; oraz (4) "łuskowatą" warstwę wierzchnią składającą się z lipidów.</li>
		<li>Wszystkie kolejne czynności należy wykonać w chłodni (4 °C). Usunąć jak najwięcej wierzchniej "łuszczącej" warstwy lipidowej za pomocą pipety o pojemności 1 ml i wyrzucić. Użyj pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby odzyskać większość żółtej, przezroczystej warstwy.</li>
		<li>Odzyskaj ostatnie kilka ml tej warstwy za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby uniknąć naruszenia dwóch dolnych warstw. Z 40 g osadu z mokrych komórek zwykle odzyskuje się około 48 ml środkowej warstwy i usuwa/wyrzuca 8 ml warstwy lipidowej. 
		Uwaga: Przepływ oczyszczania kolumny jest znacznie utrudniony przez obecność lipidów, które również mogą obniżyć jakość kompleksu, omówionego poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie kolumny etap 1: Chromatografia IgG
<ol>
	<li>Równoważenie i wiązanie żywicy
	<ol>
		<li>Przygotować 300 μl zawiesiny IgG sepharozy na 40 g granulatu komórkowego. Odetnij koniec końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby ułatwić pipetowanie zawiesiny. Przepłukać/zrównoważyć żywicę IgG trzykrotnie, za każdym razem za pomocą 5 ml buforu IgGD150 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazolu, pH 8; 0,1% v/v NP-40; 1 mM DTT; tabletka inhibitora proteazy na 50 ml objętości).
		<ol>
			<li>Odwirować do granulki w temperaturze 160 x g (4°C) między praniami i usunąć supernatant.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obracać żywicę IgG z supernatantem środkowej fazy i dwiema tabletkami inhibitora mini proteazy na 40 g komórek, używając odpowiedniego rotatora, przez 2 godziny (4 °C). To jest roztwór wsadowy IgG.</li>
		<li>Przygotuj dwie 10 ml kolumny do przygotowania poli do użycia, przecinając koniec kolumny w celu uzyskania płaskiego cięcia. Aby przyspieszyć pakowanie i mycie kolumny przez przepływ grawitacyjny, należy załadować maksymalnie 200 μl wypełnionej żywicy IgG lub ~ 25 ml roztworu okresowego IgG na kolumnę o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Wlać roztwór wsadowy IgG do kolumny i pozostawić do osadzania się grawitacyjnie. Jeśli sedymentacja trwa dłużej niż 30 minut, najprawdopodobniej doszło do zanieczyszczenia lipidami podczas odzyskiwania środkowej fazy z probówek wirówkowych.</li>
		<li>Przemyć wypełnioną kolumnę czterema kolejnymi objętościami buforu IgGD150 po 10 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na kolumnie TEV Rozszczepienie 
	<ol>
		<li>Uszczelnić dno kolumny i dodać 1 ml buforu IgGD150 i 100 μl proteazy TEV (0,6 mg/ml podstawy, zmutowany wariant S219V TEV wyprodukowany we własnym zakresie). Uszczelnić górną część kolumny i mieszać przez 20 minut (18 °C) za pomocą mieszalnika termicznego, wstrząsając z prędkością 750 obr./min. Ponownie zawiesić żywicę i ponownie mieszać przez 20 minut, powtórzyć jeszcze raz, w sumie przez 1 godzinę inkubacji. 
		Uwaga: Bardzo ważne jest, aby ograniczyć czas inkubacji do minimum.</li>
		<li>Przywrócić temperaturę kolumny do 4 °C i wymyć białko/kompleks grawitacyjnie. Eluować martwą objętość za pomocą dodatkowych 200 μl buforu IgGD150.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oczyszczanie kolumny Krok 2: Chromatografia powinowactwa kalmoduliny
<ol>
	<li>Równoważenie i wiązanie żywicy 
	<ol>
		<li>Przygotować 200 μl żywicy powinowactwa do kalmoduliny na 40 g osadu komórkowego. Przemyć żywicę trzy razy, za każdym razem 5 ml buforu wiążącego kalmodulinę (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazolu, pH 8; 2 mM CaCl2; 0,1% v/v NP-40; 10 mM β-merkaptoetanolu), odwirowując przy 160 x g (4 °C) do granulek przy każdym płukaniu.</li>
		<li>Do każdego 1 ml eluatu IgG dodać 3 objętości buforu wiążącego kalmodulinę. Aby utrzymać stały poziom wapnia, dodaj CaCl2 i β-merkaptoetanol, aby uwzględnić brak tych składników w elucji IgG. Stężenia końcowe powinny wynosić 2 mM CaCl2 i 10 mM β-merkaptoetanolu.</li>
		<li>Dodać próbkę do żywicy Calmodulin i wiązać przez 1 godzinę (4 °C) za pomocą rotatora rurowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pakowanie i eluowanie z żywicy kalmodulinowej
	<ol>
		<li>Przygotować 2 ml kolumny do przygotowania poli na 100 μl zawiesiny kalmoduliny, przecinając koniec kolumny, aby utworzyć płaski otwór. Załadować nie więcej niż 100 μl zawiesiny kalmoduliny na kolumnę, aby zminimalizować ilość żywicy, z którą próbka styka się podczas elucji.</li>
		<li>Upakować kolumnę grawitacyjnie i przemyć żywicę w kolumnie trzykrotnie 5 ml buforu wiążącego kalmodulinę.</li>
		<li>Białko elutyczne z dodatkiem 200 μl buforu elucyjnego kalmoduliny (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazolu, pH 8,0; 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% v/v NP-40; 10 mM β-merkaptoetanolu). Powtórzyć sześciokrotne dodawanie 200 μl buforu elucyjnego kalmoduliny.</li>
		<li>W przypadku elucji od 1 do 3 nanieść objętość na kolumnę i natychmiast zebrać eluat. W przypadku elucji 4 uszczelnić dno kolumny i inkubować z buforem elucyjnym przez 2,5 minuty, a następnie rozszczelnić i pozostawić do wymycia grawitacyjnie. W przypadku elucji 5 inkubować przez 5 minut, a następnie rozszczelnić i wymyć. W przypadku elucji 6 inkubować przez 10 minut, a następnie rozszczelnić i wymyć. 
		Uwaga: Integralność kompleksu może się różnić w zależności od elucji/frakcji (patrz sekcja dotycząca wyników reprezentatywnych).</li>
		<li>Dializuj roztwory od 2 do 6 indywidualnie przez noc przy użyciu odpowiedniej metody mikrodializy. Dializować frakcje za pomocą buforu dializacyjnego (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazolu, pH 8; 10 mM β-merkaptoetanolu). 
		Uwaga: NP-40 nie przechodzi znacząco, jeśli w ogóle, przez membranę dializacyjną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analizy po oczyszczeniu w celu oceny złożonej jakości
<ol>
	<li>Natywne barwienie żelem i srebrem
	<ol>
		<li>Przygotuj 4 - 16% prefabrykowany natywny żel do analizy kompleksu zgodnie z instrukcjami producenta. Użyć odpowiedniego wzorca białka o masie cząsteczkowej i załadować 15 μl każdej z dializowanych elucji/frakcji kalmoduliny na żel.</li>
		<li>Elektroforezę żelu pod napięciem 150 V przez około 3 godziny (4 °C).</li>
		<li>Srebrem zabarwić żel, aby ocenić jakość każdej z sześciu eluncji. Alternatywnie użyj równie czułych komercyjnych plam fluorescencyjnych. Na tym etapie stężenie kompleksu jest najprawdopodobniej poniżej poziomu wykrywania niebieskiego barwienia Coomassie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodatkowe metody analizy żelu
	<ol>
		<li>Aby wykryć białko za pomocą Western blot, rozpuścić kompleks za pomocą SDS lub natywnego PAGE, a następnie zbadać żel pod kątem epitopu peptydu wiążącego kalmodulinę (CBP) za pomocą przeciwciała ze znacznikiem TAP zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Używając specyficznego barwnika fluorescencyjnego, potwierdź obecność i integralność białka i/lub kwasu nukleinowego w kompleksie oczyszczonym TAP. Należy uważać, aby nie wykryto nakładania się widma między tymi plamami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja mikroskopii elektronów barwienia ujemnego
	<ol>
		<li>Używaj ciągłych siatek węglowych rozżarzonych przy -15 mA przez 30 sekund, w ciągu 30 minut od złożonej aplikacji.</li>
		<li>Nanieść 3 μl oczyszczonego kompleksu TAP (zwykle o stężeniu 1 nM) na ruszt. Inkubować przez minutę. Osusz z boku siatki, aby usunąć nadmiar bufora.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 20 μl kropli wody dejonizowanej. Boczne plamy między praniami.</li>
		<li>Nałożyć siatkę na kroplę o ujemnym bale o pojemności 50 μl i inkubować przez min. Zaleca się barwienie octanem uranylu (2%) lub mrówczanem uranylu (0,75%). 
		Uwaga: Sole i roztwory uranylu są słabo radioaktywne i zawierają metale ciężkie. Należy obchodzić się z nimi ostrożnie, a wszystkie materiały, które mają kontakt z tymi roztworami, należy utylizować zgodnie z zalecanymi przez instytucje wytycznymi dotyczącymi odpadów.</li>
		<li>Nałóż siatkę na świeżą kroplę ujemnej plamy o pojemności 50 μl, bez osuszania. Inkubuj przez min, następnie osusz w bok, a na koniec wysusz na powietrzu i wizualizuj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM)
	<ol>
		<li>Wykonaj cryo-EM z oczyszczonym kompleksem TAP, chociaż może być konieczna optymalizacja, zgodnie z protokołem producenta. 
		Uwaga: Obecność detergentu w wysokich stężeniach może utrudniać postęp i została omówiona poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Złożone przechowywanie
<ol>
	<li>Przygotowanie kompleksu do przechowywania
	<ol>
		<li>W razie potrzeby skoncentrować kompleks za pomocą filtra odśrodkowego o odpowiednim odcięciu masy cząsteczkowej dla kompleksu. Wirować z prędkością 14 000 x g przez 1 minutę, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia. 
		Uwaga: Stężenie NP-40 wzrośnie podczas zagęszczania, ponieważ nie przechodzi przez filtr ani membranę dializacyjną.</li>
		<li>Błyskawicznie zamrozić kompleks w 30 μl podwielokrotności w kąpieli etanolowej schłodzonej ciekłym azotem lub suchym lodem, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalne usuwanie detergentu po oczyszczeniu</li>
</ol>
Uwaga: Obecność detergentu, takiego jak NP-40 i w stężeniu wyższym niż jego krytyczne stężenie miceli, może utrudniać lub hamować postęp w niektórych zastosowaniach. Poniżej omówiono konsekwencje jego usunięcia z protokołu, a także zastąpienia go innymi dodatkami lub współrozpuszczalnikami. Jeśli NP-40 nie jest pożądany, istnieje możliwość skorzystania z komercyjnej aplikacji do usunięcia, na przykład Bio-kulek.
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Wstępnie zrównoważyć dostępne w handlu kulki pochłaniające detergenty w buforze do dializy. Wymieszać pięć kulek na 30 μl kompleksu (zwykle przy stężeniu 10 nM).</li>
	<li>Inkubować zrównoważone kulki z kroku 5.2.1 z oczyszczonym kompleksem TAP przez 15 minut na lodzie. Zużyć złożony w ciągu kilku godzin po usunięciu detergentu.</li>
</ol>

<ol><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li>
<li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+A+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+recombinant+proteins+fused+to+calmodulin+or+to+calmodulin-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides.</a> Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).</li>
<li>Braisted, A. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+a+binding+domain+from+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Minimizing a binding domain from protein A.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Nallamsetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+site-specific+processing+of+fusion+proteins+by+tobacco+vein+mottling+virus+protease+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro.</a> Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Howson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction%2C+verification+and+experimental+use+of+two+epitope-tagged+collections+of+budding+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains.</a> Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).</li>
<li>Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells.</a> Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).</li>
<li>Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+partners+of+acyl+carrier+protein+detected+in+Escherichia+coli+by+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification.</a> FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).</li>
<li>Tharun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+analysis+of+the+decapping+activator+Lsm1p-7p-Pat1p+complex+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast.</a> Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).</li>
<li>Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+method%3A+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Gottschalk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+U1+snRNP+reveals+five+novel+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins.</a> RNA. 4 (4), 374-393 (1998).</li>
<li>Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteins+of+the+yeast+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).</li>
<li>Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+a+stable+form+of+recombinant+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease.</a> Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda TAP wykorzystuje dwa znaczniki, które równoważą potrzebę ścisłego i selektywnego wiązania z żywicą o powinowactwie z pragnieniem utrzymania warunków zbliżonych do fizjologicznych roztworu. Równowaga ta służy zachowaniu stabilnych interakcji znakowanego białka z czynnikiem (czynnikami) oddziaływania w celu charakterystyki po oczyszczeniu. Ponadto pojedyncze ORF-y znakowane TAP są dostępne ze źródła komercyjnego, dzięki czemu można uzyskać dowolny szczep drożdży z oznakowanym białkiem dla dowolnego kompleksu drożdży...

Wiele głównych procesów komórkowych jest przeprowadzanych przez duże kompleksy białkowe i białko-RNA1. Istotnym wąskim gardłem w prowadzeniu badań biofizycznych i strukturalnych takich kompleksów jest uzyskanie ich odpowiedniej jakości (tj. jednorodności) i w odpowiednim stężeniu. Wyizolowanie kompleksu od natywnego źródła ma wiele zalet, w tym zachowanie odpowiednich modyfikacji potranskrypcyjnych i/lub translacyjnych podjednostek oraz zapewnienie prawidłowego składania kompleksu. Jednak duże kompleksy komórkowe są często obecne w komórce przy niskiej liczbie kopii, a oczyszczanie musi być bardzo wydajne i zachodzić w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, aby zapewnić utrzymanie integralności kompleksu. Oczyszczanie kompleksu ze źródła eukariotycznego jest szczególnie trudne i może być zaporowe finansowo. Dlatego bardzo pożądane są strategie lub metody, które są skuteczne i dają jednorodny kompleks.
Strategią, która odniosła sukces w oczyszczaniu natywnych kompleksów z komórek eukariotycznych w celu ich wstępnej charakterystyki, jest metoda Tandem Affinity Purification (TAP)2,3. Metoda TAP została początkowo opracowana w celu oczyszczenia natywnego białka z pączkujących drożdży (S. cerevisiae) w kompleksie z czynnikiem (czynnikami) oddziałującym2. W metodzie TAP wykorzystano dwa znaczniki, z których każdy został połączony z tą samą sekwencją genu kodującego białko. Znaczniki zostały dobrane tak, aby zrównoważyć potrzebę ścisłego i selektywnego wiązania z żywicą o powinowactwie z chęcią utrzymania warunków zbliżonych do fizjologicznych roztworu. Równowaga ta służy zachowaniu stabilnych interakcji znakowanego białka z czynnikiem (czynnikami) oddziaływania w celu charakterystyki po oczyszczeniu. Genomowo włączony znacznik TAP umieszczono na końcu (C-końcu) genu kodującego białko i składał się z sekwencji kodującej peptyd wiążący kalmodulinę (CBP), a następnie białka A - dodatek nieco ponad 20 kDa do znakowanego białka. CBP jest krótkie, 26 aminokwasów i rozpoznawane przez białko Kalmodulina ~ 17 kDa (CaM) w obecności wapnia zK D rzędu 10-9 M 4. Znacznik białka A jest większy, składa się z dwóch powtórzeń po 58 reszt z krótkim łącznikiem między powtórzeniami. Każde powtórzenie 58 aminokwasów jest rozpoznawane przez immunoglobulinę G (IgG) o KD ~ 10-8 M 5. Pomiędzy tymi dwoma znacznikami umieszczono miejsce rozpoznania proteazy TEV, endopeptydazy z wirusa wytrawiania tytoniu6,7. Jak pokazano na rysunku 1, w pierwszym etapie powinowactwa metody białko znakowane TAP jest wiązane z żywicą IgG za pośrednictwem białka A. Znakowane białko jest eluowane przez rozszczepienie na kolumnie po dodaniu proteazy TEV, specyficznie dla miejsca rozszczepiającego między dwoma znacznikami. Jest to konieczny krok, ponieważ oddziaływanie IgG i białka A jest bardzo silne i może być odpowiednio zaburzone tylko w warunkach roztworu denaturującego. Brak znacznika białka A, białko jest wiązane z żywicą CaM w obecności wapnia i eluowane z tej żywicy z dodatkiem chelatora jonów metalu EGTA (kwas tetraoctowy glikolu etylenowego) (ryc. 1).
Wkrótce po wprowadzeniu metody TAP, została ona wykorzystana w dużym badaniu do wygenerowania 'mapy' złożonych interakcji w S. cerevisiae8. Co ważne, w wyniku tych starań cała biblioteka yeast-TAP Tagged Open Reading Frame (ORF), a także pojedyncze ORFy9 oznaczone tagiem TAP są dostępne z komercyjnego źródła. W ten sposób można uzyskać dowolny szczep drożdży z oznaczonym białkiem dla dowolnego kompleksu drożdży. Metoda TAP przyczyniła się również do modyfikacji lub wariacji znacznika TAP, w tym: jego zastosowania do oczyszczania kompleksów z innych komórek eukariotycznych i bakteryjnych10,11; projekt "podzielonego znacznika", w którym białko A i CBP są umieszczane na różnych białkach12; a znaczniki zostały zmienione, aby dostosować się do potrzeb badacza, takich jak wrażliwość kompleksu na Ca2+ lub EGTA13.
Ostatnie postępy zarówno w oprzyrządowaniu, jak i metodologii doprowadziły do znacznego postępu w zastosowaniu mikroskopii elektronowej (EM) do określania struktury, co doprowadziło do powstania obrazów kompleksów makromolekularnych o wysokiej, bliskiej rozdzielczości atomowej14. Rozdzielczość, jaką można uzyskać dla kompleksu przez EM, pozostaje jednak uzależniona od jakości badanego kompleksu. W badaniu tym wykorzystano podejście znacznika TAP do oczyszczenia z S. cerevisiae snRNP U1, 18-podjednostkowego (~ 0,8 MDa) kompleksu rybonukleoproteinowego o niskiej liczbie kopii, który jest częścią spliceosomu15,16. Podjęto szereg kroków w celu oczyszczenia tego kompleksu tak, aby był jednorodny i miał odpowiednie stężenie. Opisano potencjalne problemy napotkane na różnych etapach oczyszczania oraz podkreślono strategie podejmowane w celu pokonania wyzwań. Dzięki dokładnej ocenie i optymalizacji etapów oczyszczania, oczyszczony U1 snRNP ma jakość i ilość odpowiednią do badań w barwieniu ujemnym i kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM). Zoptymalizowany protokół metody TAP do oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych jest opisany w niniejszym dokumencie.

<table><tbody><tr><td>Szczep oznaczony tagiem S. cerevisiae</td><td>TAP Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>Jest to główny szczep drożdży użyty do opracowania protokołu TAP. Jego tłem jest S288C: ATCC 201388: MATa, his3&Delta; 1, leu2 i Delta; 0, met15 i Delta; 0, ura3 i Delta; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Młynek do kawy</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Używany do hemocytometru do lizy komórek</td></tr><tr><td>, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Służy do oceny lizy komórek</td></tr><tr><td>Wirnik wirówki JA 9.100&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Służy do zbierania komórek drożdży</td></tr><tr><td>Wirówka o stałym kącie nachylenia JA 20</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Służy do oczyszczania ekstraktu komórkowego z nierozpuszczalnego materiału komórkowego</td></tr><tr><td>Ti 60 wirnik wirówki o stałym kącie</td> nachylenia <td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Służy do dalszego oczyszczania ekstraktu z komórek rozpuszczalnych</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Wytrząsarka z kontrolowaną temperaturą</td></tr><tr><td>System żelowy Novex</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żywica IgG</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6 szybkoprzepływna</td></tr><tr><td>żywica Calmodulin</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Żywica Affinity</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy, mini tabletki</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra tabletki wolne od EDTA</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy, duże tabletki</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra Tabletki wolne od EDTA</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td></td><td></td><td>Rozpuszczony w izopropanolu</td></tr><tr><td>2 ml Kolumna Bio-spin</td><td>Bio-Rad Laboratoria, Inc.</td><td>7326008</td><td>Służy do pakowania i mycia kolumny poly-prep z żywicy Calmodulin</td></tr><tr><td>10 ml</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>Służy do pakowania i mycia żywicy IgG:</td></tr><tr><td>Prefabrykaty, natywne żele PAGE Bis-Tris,</td><td>Life Technologies</td>, <td>BN1002</td>, <td>Novex, NativePAGE, Bis-Tris 4 - 16% prefabrykowane żele poliakrylamidowe,</td></tr><tr><td>standard białka NativeMark</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Niebarwiony wzorzec białka stosowany dla natywnego PAGE. Obciążenie 7,5 &mu; l dla żelu barwionego srebrem i 5 &mu; l dla SYPRO Żel barwiony rubinowo</td></tr><tr><td>Prefabrykaty SDS PAGE Żele Bis-Tris</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% prefabrykowane żele poliakrylamidowe&nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler wzorzec białka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Niebarwiony wzorzec białka stosowany do Western blotting</td></tr><tr><td>SDS running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS</td></tr><tr><td>Buffer TAP przeciwciało</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko znacznikowi CBP</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Kozia anty-królicza fosfataza alkaliczna sprzężona</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforan/nitro niebieski tetrazolium&nbsp;</td></tr><tr><td>Jednostki dialazyczne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Mini jednostki dializacyjne Slide-A-Lyzer</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5 z membraną Ultracel-100</td></tr><tr><td>Kulki pochłaniające detergenty</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Absorbanty Bio-bead SM-2</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Barwnik fluorescencyjny do barwienia kwasów nukleinowych, podczas wykrywania z obecnością rubinu SYPRO należy użyć długości fali wzbudzenia 488 nm i długości fali emisji 532 nm</td></tr><tr><td>Rubinowe sondy molekularne</td><td>SYPRO</td><td>S-12000</td><td>Barwnik fluorescencyjny do barwienia białek, podczas wykrywania z obecnością SYBR Green II, należy użyć długości fali wzbudzenia 457 nm i długości fali emisji 670 nm</td></tr><tr><td>Siatki miedziane</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Metody oczyszczania powinowactwa okazały się skuteczne w izolowaniu natywnych kompleksów do charakterystyki proteomicznej. Niejednorodność strukturalna i stopień niejednorodności składowej kompleksu zwykle nie hamują postępu w prowadzeniu takich badań. Natomiast kompleks przeznaczony do charakterystyki strukturalnej powinien być oczyszczony w stanie, który jest jednorodny zarówno pod względem składu, jak i struktury, a także w stężeniu wyższym niż wymagane dla proteomiki. W ostatnim czasie nastąpił znaczny postęp w zastosowaniu mikroskopii elektronowej do określania struktury dużych kompleksów makromolekularnych. Spowodowało to wzrost zainteresowania podejściami do oczyszczania natywnych kompleksów o jakości i ilości wystarczającej do określenia struktury za pomocą mikroskopii elektronowej. Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) została zoptymalizowana do ekstrakcji i oczyszczania 18-podjednostkowego, ~ 0,8 zespołu rybonukleoproteinowego MDa z pączkujących drożdży (Saccharomyces cerevisiae) nadających się do barwienia ujemnego i kriomikroskopii elektronowej. W niniejszym dokumencie szczegółowo opisano modyfikacje dokonane w metodzie TAP, uzasadnienie wprowadzenia tych zmian oraz podejścia przyjęte do oznaczania jednorodnego składu i struktury kompleksu.

Do oczyszczenia kompleksu U1 snRNP, będącego rybonukleoproteinowym kompleksem składającym się z 18 podjednostek z S. cerevisiae, zastosowano zmodyfikowaną metodę TAP. Wstępne oczyszczanie kompleksu metodą TAP zgodnie z opublikowanym protokołem2,3 dało kompleks o niejednorodnym charakterze, który w natywnym żelu poliakrylamidowym barwionym srebrem migrował w postaci trzech prążków (Rysunek 2A). Wielokrotne optymalizacje metody TAP pozwoliły uzyskać komp...

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest oczyszczenie natywnego kompleksu makromolekularnego o jakości odpowiedniej do badań biofizycznych. Protokół ten służy nie tylko jako metoda oczyszczania kompleksu, ale także jako szczegółowy przewodnik po ocenie jakości strukturalnej próbki w trakcie procesu oczyszczania. Główną zaletą tego protokołu jest możliwość prostego i szybkiego oczyszczenia natywnego kompleksu w warunkach buforowych zbliżonych do fizjologicznych, co pozwala na zapewnienie homogeniczności składu.Po odwirowaniu komórek S.cerevisiae i odlaniu supernatantu zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać dwa mililitry schłodzonego buforu lizującego, a następnie zamieszać i/lub użyć 10 mililitrowej pipety serologicznej w celu zawieszenia osadu. Zawiesinę komórkową należy przenieść do pustej, 50 mililitrowej stożkowatej polipropylenowej probówki wirówkowej przechowywanej w lodzie. Następnie należy użyć dodatkowych dwóch mililitrów schłodzonego buforu lizującego do wypłukania każdej probówki wirówkowej i dodać otrzymany roztwór do probówki 50 mililitrowej.Po wyznaczeniu masy mokrej osadu komórkowego, przygotuj kąpiel w ciekłym azocie wewnątrz i wokół stożkowej polipropylenowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie pobierz zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 5 ml i podłącz do niej igłę o rozmiarze 16 G. Po tym zamroź zawiesinę komórkową, przepuszczając ją przez strzykawkę i igłę do kąpieli z szybkością około 1 ml na minutę, aby utworzyć kropelki.Aby zlizować komórki drożdży, należy najpierw schłodzić młynek do kawy za pomocą ciekłego azotu. Następnie należy dodać do 40 g komórek drożdży i mielić przez 25 s, powtarzając proces mielenia osiem lub dziewięć razy. Zaleca się, aby nie oczyszczać więcej niż 10 l hodowli komórkowej w jednej serii.Minimalizuje to czas oczyszczania i zapewnia zachowanie integralności strukturalnej kompleksu. Po każdych dwóch cyklach mielenia należy dodać do młynka niewielką warstwę ciekłego azotu i poczekać, aż odparuje. Aby zapobiec zlepianiu się komórek, należy uniemożliwić ich odtajanie, mieszając je szpatułką schłodzoną w ciekłym azocie.Po lizie komórki powinny mieć postać drobnego białego proszku. Po sprawdzeniu lizi komórek i przygotowaniu buforu do lizy z dodatkiem PMSF, DTT i inhibitorów proteaz zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć schłodzonej w ciekłym azocie szpatułki, aby stopniowo przenosić zamrożony proszek z lizowanych komórek do przygotowanych probówek 50 ml z buforem. Po każdej dodanej porcji należy delikatnie obracać probówki 50 ml w temperaturze pokojowej, aby rozmrozić i rozpuścić komórki oraz zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza.W miarę rozpuszczania się komórek należy dodawać kolejne porcje proszku komórkowego. Po dodaniu wszystkich komórek kontynuuj rozmrażanie i rozpuszczanie, aż w probówkach nie będą widoczne żadne zamrożone grudki komórek. Powinno to zająć około 50 minut.Następnie odwiruj lizat komórkowy przy 25 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po lizie komórek i wirowaniu można zauważyć niewielką ciemną warstwę w nierozpuszczalnym osadzie. Przenieś nadsadziny do poliwęglanowych probówek do ultrawirowania i dodaj 10 µL 200 mM PMSF do każdej pełnej probówki.Wiruj próbki przy 100 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Po zakończeniu wirowania powinny być widoczne cztery warstwy: twardy, przezroczysty osad zawierający głównie kompleksy rybosomalne; miękki osad bogaty w lipidy; szeroka, przezroczysta warstwa o żółtawym zabarwieniu zawierająca większość rozpuszczalnych białek i kompleksów komórkowych oraz łuskowata warstwa wierzchnia składająca się z lipidów.W pomieszczeniu chłodniczym w temperaturze 4°C, używając pipety o objętości 1 ml, usunąć jak największą ilość górnej, łuskowatej warstwy lipidowej i ją odrzucić. Użyć pipety serologicznej o objętości 10 ml, aby odessać większość przejrzystej żółtej warstwy. Następnie, używając pipety o objętości 1 ml, aby nie zakłócić dwóch dolnych warstw, odessać ostatnie kilka mililitrów tej warstwy.Z 40 gramów wilgotnego osadu komórkowego zazwyczaj odzyskuje się około 48 mililitrów warstwy środkowej. Po przygotowaniu sepharose IgG zgodnie z protokołem tekstowym, połączyć żywicę IGG z nadsączem fazy środkowej oraz dwiema mini tabletkami inhibitora proteaz na każde 40 gramów komórek. Następnie umieścić na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny.Jest to roztwór partii IgG. Przygotuj dwie kolumny polyprep o pojemności 10 ml, odcinając końce kolumn, aby uzyskać płaski otwór. Wlej 24 ml zawiesiny żywicy IgG lub roztworu partii do każdej kolumny i poczekaj, aż osadzą się pod wpływem grawitacji.Odpowiada to 200 µL upakowanej żywicy IgG. Jeśli sedymentacja trwa dłużej niż 30 minut, środkowa faza mogła zostać zanieczyszczona lipidami. Po zakończeniu sedymentacji należy przepłukać upakowaną kolumnę czterema kolejnymi porcjami po 10 mL buforu IgG D150.Aby przeprowadzić cięcie proteazą TEV (tobacco etch virus) na kolumnie, należy uszczelnić dno kolumny i dodać 1 ml buforu IgG D150 oraz 100 µL proteazy TEV. Uszczelnić górę kolumny i mieszać przez 20 minut za pomocą mieszalnika termicznego przy 750 RPM i 18 °C. Ponownie zawiesić żywicę i mieszać przez kolejne 20 minut.Następnie ponownie resuspenduj i powtórz 20-minutowe mieszanie po raz trzeci. Przenieś kolumnę do temperatury czterech stopni Celsjusza i wykorzystaj siłę grawitacji, aby eluować kompleks białkowy. Następnie dodaj 200 µL IgG D150, aby eluować objętość martwą.Po przygotowaniu żywicy powinowactwa do kalmoduliny zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj do żywicy bufor wiążący kalmodulinę oraz próbkę, a następnie inkubuj w rotatorze do probówek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Przygotuj kolumnę PolyPrep o objętości dwóch mililitrów na każde 100 mikrolitrów zawiesiny kalmoduliny, odcinając koniec kolumny w celu uzyskania płaskiego otworu. Protokół określa konkretne bufory i objętości przebywania, dobrane tak, aby utrzymać wysoką koncentrację kompleksu i zminimalizować czas jego przebywania na żywicy.W przypadku zmiany objętości hodowli zaleca się dostosowanie objętości żywicy oraz buforu w kolumnach grawitacyjnych, aby uwzględnić tę zmianę. Napełnić kolumnę nie więcej niż 100 µL zawiesiny kalmoduliny, a następnie, wykorzystując siłę grawitacji, trzykrotnie przemyć żywicę 5 mL buforu wiążącego kalmoduliny. Następnie białko należy eluować trzykrotnie, używając 200 µL buforu eluującego kalmoduliny.Następnie szczelnie zamknij dno kolumny, dodaj 20 µL buforu elucyjnego i inkubuj przez 2,5 minuty, po czym zdejmij uszczelnienie i pozwól białku eluować pod wpływem grawitacji. Ponownie szczelnie zamknij dno kolumny i dodaj 200 µL buforu elucyjnego, a następnie inkubuj przez pięć minut. Następnie odblokuj dno kolumny i przeprowadź elucję roztworu.W przypadku szóstej i ostatniej elucji, zamknij dół kolumny i inkubuj z buforem elucyjnym przez 10 minut. Następnie otwórz dół i przeprowadź elucję. Wykonaj analizę po oczyszczaniu i przechowuj próbki zgodnie z protokołem tekstowym.Jak pokazano tutaj, wstępna puryfikacja kompleksu metodą TAP przeprowadzona zgodnie z opublikowanym protokołem pozwoliła uzyskać kompleks, który w żelu barwionym srebrem migrował jako trzy prążki. Wielokrotne rundy optymalizacji metody TAP pozwoliły nam uzyskać kompleks migrujący w żelu natywnym jako pojedynczy prążek, co wskazuje na bardziej jednorodną strukturę kompleksu. Zgodnie z wynikiem w żelu natywnym, western blotting z użyciem przeciwciała TAP przeciwko kompleksowi oczyszczonemu zgodnie z opublikowanym protokołem wykazał proteolizę białka z tagiem TAP, SNU-71.Modyfikacje metody TAP znacząco zmniejszyły zakres proteolizy, ponieważ prawie wszystkie z 17 białek w kompleksie U1 snRNP zostały rozdzielone za pomocą SDS-PAGE i dodatnio zidentyfikowane metodą wielokrotnej spektrometrii mas. Elektronowa mikroskopia z barwieniem negatywowym wykazuje monodyspersyjne cząsteczki po udanej puryfikacji po pierwszym i drugim etapie TAP. W przeciwieństwie do tego, w przypadku nieudanej puryfikacji nie obserwuje się cząsteczek o prawidłowej wielkości.Jakość końcowego kompleksu oceniono na warstwie oczyszczonych cząsteczek, pokazanych tutaj, które na surowym obrazie EM z barwieniem negatywowym wydają się monodyspersyjne. Ponadto średnie klas cząsteczek wykazują wyraźne cechy wskazujące na to, że próbka jest prawdopodobnie odpowiednia do badań strukturalnych. Po opanowaniu techniki protokół ten można zrealizować w ciągu 10 do 12 godzin od rozmrożenia zamrożonego proszku z lizowanymi komórkami.Podczas stosowania tego protokołu ważne jest upewnienie się, że wszystkie roztwory są wolne od proteaz i nukleaz, a także szybka praca w celu zapobiegania agregacji lub dysocjacji kompleksu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak oczyścić natywny kompleks o jakości odpowiedniej do badań strukturalnych, a także jak ocenić, czy cel ten został osiągnięty.

purification-native-complexes-for-structural-study-using-tandem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Opisano metodę skutecznego oczyszczania białek fuzyjnych znakowanych podwójnie Strep-Strep-i ich specyficznych kompleksów na zmodyfikowanej żywicy streptawidyny (Strep-Tactin) kowalencyjnie usieciowanej z suberianem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3). Zaletą metody jest duża szybkość, dobry odzysk białka docelowego i wysoka czystość, a także jest kompatybilna z późniejszą analizą za pomocą spektrometrii mas.

Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3)

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Prezentujemy tutaj sprawdzony i przetestowany protokół oczyszczania kompleksów importujących białka chloroplastowe (kompleks TOC-TIC) za pomocą znacznika TAP. Jednoetapowy protokół izolacji powinowactwa może być potencjalnie zastosowany do dowolnego białka i może być wykorzystany do identyfikacji nowych partnerów interakcji za pomocą spektrometrii mas.

Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Poznaj metodę tandemowego znacznika powinowactwa do oczyszczania natywnych kompleksów makromolekularnych z komórek S. cerevisiae. Protokół zapewnia szybką izolację z zachowaniem integralności strukturalnej dla badań biofizycznych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Przeglądaj więcej filmów